Синергетическое противовоспалительное действие экстракта ламинарии японской фукоидана и цистанхе трубчатой

В качестве иммунного ответа против чужеродных антигенов макрофаги высвобождают провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли- (TNF-), интерлейкин-1 (IL- 1), IL-6 и другие. Такие цитокины вызывают хемотаксический приток гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов и тучных клеток к поврежденной ткани, что способствует удалению антигена и восстановлению ткани. Однако чрезмерная инфильтрация и активация клеток усугубляют повреждение тканей, приводя к отеку (сосудистой экссудации) и боли, которые являются хорошо известными явлениями воспаления.

TNF- является важным фактором индукции экспрессии гена синтазы оксида азота (iNOS) в нескольких клеточных линиях. Активация iNOS приводит к выработке оксида азота (NO), который не только модулирует некоторые физиологические функции, такие как бактерицидность и расширение сосудов, но также вызывает воспаление. После повреждения тканей в результате деградации фосфолипидов клеточных мембран фосфолипазами образуется арахидоновая кислота. Арахидоновая кислота далее разлагается циклооксигеназой (ЦОГ) до простагландинов (ПГ). Чрезмерное количество PGE2, образуемого ЦОГ-II, индуцирует несколько цитокинов воспаления. Поскольку и NO, и PGE2 действуют как основные факторы индукции воспаления и боли, пути TNF-NO и COX-II-PGE2 являются основными потоками воспалительного процесса, которые ингибируются кортикостероидами и нестероидными препаратами.противовоспалительные препараты(НПВП) соответственно.

Несмотря на то, что существует несколько стероидов и НПВП длятерапия воспалительных заболеванийЭти препараты могут оказывать неблагоприятное воздействие на иммунную систему, желудочно-кишечный тракт, почки, печень, центральную нервную систему, артериальное давление и сердечно-сосудистую систему. Поэтому необходимо свести к минимуму неблагоприятное воздействие химических препаратов, заменяя их или используя в сочетании с натуральными продуктами.

Фукоидан, сульфатно-полисахаридный комплекс из морских водорослей, таких как Laminaria japonica и Cladosiphon okamuranus, широко распространенный во многих странах, в течение длительного периода использовался в качестве лечебного средства в восточной медицине. В предыдущих исследованиях было показано, что фукоидан обладает антиоксидантным, антикоагулянтным, противораковым и антиоксидантным действием.противовоспалительное действие. Соответственно, внимание исследователей привлекает благотворное влияние фукоидана на воспалительные заболевания, ишемию, иммунную дисфункцию и опухоли. С другой стороны,Цистанхе трубчатая(КТ) также широко используется в качестве традиционного лекарства в Китае. Сообщалось, что экстракты CT снижают выработку TNF-α и IL- 4, которые являются основными факторами продукции NO в воспалительных путях [19].

Такие предыдущие результаты побудили нас изучить комбинированную эффективность фукоидана и экстракта CT на двух основных путях воспаления. Чтобы выяснить механизм действия, мы проанализировали NO и PGE2 в экссудатах от воспаления воздушного пузыря, вызванного каррагинаном.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬPHGS75% ЭХ 30% АКТ 12%

Материалы и методы

Материалы

Полуочищенный фукоидан и водный экстракт ЦТ были получены от Misuba RTech Co., Ltd. (Асан, Корея). Фукоидан и экстракт CT хранили при температуре 4 градуса, смешивали (1:3), растворяли в очищенной воде перед применением и вводили перорально в объеме 5 мл/кг.

Клеточная культура и количественное определение NO

Клеточная линия мышиных макрофагов RAW 264.7 была приобретена из Американской коллекции типовых культур (Манассас, США) и культивирована в модифицированной Дульбекко среде Игла (Sigma, Сент-Луис, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и антибиотики [100 ед/мл]. пенициллин (Sigma) и стрептомицин 100 мкг/мл (Sigma)]. Клетки инкубировали во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37 градусах.

Для оценки влияния фукоидана и экстракта CT на секрецию NO клетки RAW 264.7 (1×106 клеток/мл) инкубировали с фукоиданом или экстрактом CT (1–320 мкг/мл) в течение 5 мин. с последующим введением интерферона (ИФН-, 10 ЕД/мл) и липополисахарида (ЛПС, 10 мкг/мл) в течение 24 часов. В наших предварительных исследованиях было подтверждено, что обработка IFN-plus LPS для активации клеток RAW 264.7 не влияла на жизнеспособность клеток до 24 часов и что фукоидан и экстракт CT не были цитотоксичными до 1 мг/мл. В качестве индикатора NO измеряли концентрацию нитрита (NO2 – ), продукта окисления NO. Культуральную среду смешивали с равным объемом реактива Грисса (1% сульфаниламида, 0,1% нафтилэтилендиамина в 2,5% фосфорной кислоты) [21] и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Концентрацию нитритов анализировали при 540 нм, где для построения стандартной кривой использовали NaNO2.

Животные и лечение

Мыши-самцы ICR (7 недель) были приобретены у Daehan Biolink (Ымсон, Корея) и помещены в комнату с постоянными условиями окружающей среды (22±2°C; 40-70% относительной влажности; 12- часовой свет. -темновой цикл 150-300 люкс; Гранулированный корм и очищенная вода были доступны в неограниченном количестве. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Национального университета Чунгбук (CBNU), Корея, и проводились в соответствии со Стандартными операционными процедурами (SOP) Центра исследований лабораторных животных CBNU.

Мышам (n=8/группа) перорально вводили фукоидан (18 или 54 мг/кг), экстракт CT (54 или 162 мг/кг) или их смесь (18+54, {{6 }} или 90+270 мг/кг) один раз в день в течение 7 дней. Низкие дозы фукоидана (18 мг/кг) и экстракта CT (54 мг/кг) были получены из расчетных доз для человека 100 мг/тело (70 кг) и 300 мг/тело после перемещения массы тела по площади поверхности (Km{{14 }} для человека/км=3 для мыши) соответственно. Высокие дозы фукоидана и экстракта CT были установлены в 3-кратном размере, по отдельности или в смеси, а самая высокая доза смеси была зафиксирована в 5-кратном размере для оценки максимального синергического эффекта.

В 1-й день лечения фукоиданом и экстрактом CT мышам подкожно вводили 10 мл стерильного воздуха в заднюю сторону, чтобы сформировать мешочек [22,23]. Через 2 и 5 дней в мешок повторно вводили 5 мл воздуха. Через час после последней обработки в пакет вводили 1 мл каррагинана (1% в физиологическом растворе; Sigma) или его носителя (физраствора).

Анализы экссудата

Воздушный мешок промывали 1 мл холодного физиологического раствора через 6 часов после инъекции каррагинана и регистрировали чистый объем промывной жидкости. Общее количество воспалительных клеток, нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов определяли с помощью счетчика Коултера. Концентрации NO и PGE2 определяли с помощью реагента Грисса (Sigma) и иммуноферментного анализа (EIA) с использованием набора Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA) соответственно.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНХ TUBULOSA ДЛЯ БЛОКИРОВКИ ДЕЙСТВИЯ НА ХЕМОТАКСИС ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Гистопатологическое исследование

Ткань подкладки мешочка удаляли и фиксировали в нейтральном растворе формалина. Залитые в парафин слайды тканей окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали под световым микроскопом на наличие воспалительных поражений.

Статистический анализ

Результаты представлены как среднее значение ± SE. Сравнение экспериментальных групп проводилось с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующей коррекцией теста Тьюки. Значение AP<0.05 was considered statistically significant.

Результаты

In vitro культура клеток RAW 264.7, обработка IFN- и LPS значительно увеличивали выработку NO (рис. 1). Предварительная обработка фукоиданом (1–320 мкг/мл) не влияла на высвобождение NO из линии клеток макрофагов (рис. 1А). Для сравнения, экстракт CT (32–320 мкг/мл) значительно подавлял выработку NO, что свидетельствует о противовоспалительной активности (рис. 1B).

Инъекция каррагинана в воздушный мешок мыши заметно увеличивала объем экссудата внутри мешочка (рис. 2). Такая повышенная экссудация была уменьшена при лечении фукоиданом (18 мг/кг) и экстрактом CT (54 и 162 мг/кг). Примечательно, что комбинированное лечение фукоиданом и экстрактом CT еще больше уменьшало объем экссудата по сравнению с отдельными эффектами, хотя комбинации с более высокими дозами (54+162 мг/кг и 90+270 мг/кг) не проявляли дополнительной эффективности. до комбинации наименьших доз (18+54 мг/кг) (рис. 2А). Содержание N-градусов в мешочке также резко увеличивалось после инъекции каррагинана (рис. 2B). По сравнению с мягким действием фукоидана экстракт ЦТ заметно снижал концентрацию N степени. Комбинированное лечение фукоиданом и экстрактом CT дополнительно снижало уровень NO дозозависимым образом. Аналогично, повышенное содержание PGE2 синергически подавлялось комбинированной терапией фукоидана и экстракта CT (рис. 2C).

Параллельно с наличием медиаторов воспаления в мешочке количество воспалительных клеток резко увеличивалось при инъекции каррагинана: в 37,8, 4,8 и 24,1 раза от контрольных уровней нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов соответственно (таблица 1). Однако фукоидан и экстракт CT значительно уменьшали инфильтрацию воспалительных клеток, при этом фукоидан несколько превосходил экстракт CT. Неожиданно при одновременном применении фукоидана и экстракта CT не было достигнуто синергического эффекта в отношении инфильтрации воспалительных клеток.

Судя по инфильтрации воспалительных клеток в экссудате, в подкожной клетчатке, окружающей воздушные мешочки, наблюдались тяжелые воспалительные поражения (рис. 3). Наблюдалось огромное количество клеток в утолщенной подкожной ткани, подвергшейся воздействию каррагинана (рис. 3В), по сравнению с почти нормальными показателями у контрольных животных (рис. 3А). Такие воспалительные поражения были значительно уменьшены при лечении фукоиданом (рис. 3C и 3D) или экстрактом CT (рис. 3E и 3F).

Примечательно, что более высокие противовоспалительные эффекты были получены при комбинированной терапии фукоиданом и экстрактом CT (рис. 3G-3I).

Обсуждение

Используя модель воспаления воздушной сумки, индуцированного аррагинаном in viv, инъекция воздуха в спины грызунов вызывает пролиферацию клеток, которые расслаиваются на поверхности полости, образуя структуру, подобную синовиальной оболочке. В этой модели инъекция каррагинана, индуцированная воспалительной клеточной инфильтрацией, увеличивала экссудат, что указывает на утечку из сосудов. Воздушный мешок служит резервуаром воспалительных клеток и медиаторов, которые можно легко измерить в жидкости, которая накапливается локально.

Среди разнообразных медиаторов воспаления, которые могут индуцировать проницаемость сосудов, хорошо известно, что NO и PGE2 являются основными факторами, участвующими в патогенезе многих воспалительных заболеваний. Они также известны как медиаторы индукции и восприятия боли. iNOS, которая экспрессируется и активируется в различных типах клеток путем стимуляции TNF- и/или LPS во время воспаления, продуцирует высокие, устойчивые концентрации NO. NO является важной регуляторной молекулой, участвующей в различных физиологических функциях, таких как расширение сосудов, приводящее к утечке из сосудов. PGE2, который образуется из арахидоновой кислоты посредством ЦОГ, способствует развитию многих воспалительных заболеваний, а перепроизводство PGE2 в ответ на различные воспалительные стимуляции связано с повышением уровня ЦОГ-II и прогрессированием воспаления. Таким образом, пути TNF- -NO и COX-II-PGE2 рассматривались как два основных потока воспалительных процессов, которые блокируются ингибиторами iNOS (кортикостероиды) и ЦОГ (НПВП) соответственно.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В настоящем исследовании одновременное введение фукоидана и экстракта CT уменьшало объем экссудата в мешочке, что позволяет предположить, что они обладают подавляющей активностью против утечки из сосудов (рис. 2А). По сравнению с индивидуальными эффектами каждого фукоидана и экстракта CT, комбинированное лечение еще больше усилилось, подразумевая, что соединения двух степеней действуют синергично. Такие синергетические эффекты между фукоиданом и экстрактом CT были подтверждены их активностью в отношении уровней NO и PGE2 в экссудате (рис. 3B и 2C).

Однако интересно, что было подтверждено, что фукоидан не ингибирует напрямую активацию макрофагов в анализе in vitro (рис. 1А). Аналогично, ингибирующий потенциал фукоидана в отношении накопления NO и PGE2 in vivo был относительно ниже, чем у экстракта CT (рис. 2B и 2C). Такой механизм действия фукоидана отличается от прямой инактивации клеток экстрактом CT (рис. 1Б). Для сравнения, фукоидан оказывал высокую эффективность в ингибировании инфильтрации воспалительных клеток в мешочках (таблица 1). Фукоидан превосходил экстракт CT в блокировании миграции нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов к местам повреждения тканей, вызванным каррагинаном. Интересно, что не было выявлено синергического антимиграционного эффекта, что указывает на различные механизмы действия фукоидана и экстракта CT: т.е. фукоидан блокирует инфильтрацию воспалительных клеток, тогда как экстракт CT ингибирует активацию клеток.

Полиморфно-ядерные клетки, особенно нейтрофилы, являются основными клеточными компонентами, рекрутируемыми в очаги острого воспаления, индуцированного каррагинаном. Кроме того, возникающие воспалительные клетки, такие как макрофаги и лимфоциты, также играют центральную роль в воспалительном процессе, секретируя цитокины. При предварительной обработке фукоиданом или экстрактом CT количество лейкоцитов, мигрировавших в воздушные мешочки с каррагинаном, было заметно подавлено. Этот результат соответствовал эффекту, который можно было бы получить от кортикостероидов, таких как дексаметазон, но не от НПВП, включая индометацин. Поэтому предполагается, что фукоидан и экстракт СТ частично обладают свойствами стероидов.

Помимо блокирующего действия на хемотаксис воспалительных клеток, экстракт CT, по-видимому, подавлял активацию макрофагов. Это было подтверждено его ингибирующим действием на NO in vitro и in vivo, который является основным медиатором воспаления, продуцируемым макрофагами. Таким образом, действие экстракта CT на макрофаги может быть обусловлено подавлением экспрессии мРНК и/или прямым ингибированием активности iNOS в этих клетках.

PGE2 также является одним из основных медиаторов воспаления. Он увеличивается параллельно с отеком тканей, который подавляется НПВП, ингибиторами ЦОГ. Каррагинан может увеличивать выработку PGE2, индуцируя мРНК ЦОГ-II и белок ЦОГ-II в экссудате мешочка. В этой модели каррагинан значительно увеличивал количество PGE2 и существенно подавлялся экстрактом CT. Интересно отметить, что этот результат соответствовал эффекту, который можно было бы получить при использовании НПВП индометацина. Таким образом, из результатов следует, что экстракт ЦТ обладает дополнительными свойствами НПВП. В совокупности считается, что экстракт CT оказывает как кортикостероидное, так и НПВП-подобное действие в модели воспаления, индуцированного каррагинаном, и что фукоидан усиливаетпротивовоспалительное действие экстракта CTблокируя инфильтрацию воспалительных клеток.

Хотя определение точного механизма действия требует дальнейшего изучения, смесь фукоидана и экстракта CT заметно ослабляет признаки воспаления, блокируя пути TNF-NO и COX-II-PGE2 при воспалении воздушного пузыря, вызванном каррагинаном. Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинированное лечение фукоиданом и экстрактом CT может быть многообещающим кандидатом для облегчения различных типов воспаления, реагирующих на кортикостероиды или НПВП.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ PHGS75% ECH 30% ACT 12%