Абстрактный
Исследовать синергетические ингибирующие эффектыCistanche Deserticolaфенилетаноидные гликозиды (PHGS) и гларбридин (GLA) при пигментации кожи оптимальное соотношение массы PHGs и GLA предварительно подвергали скринингу черезвне организмаАнализы ингибирования активности тирозиназы, 1, 1- дифенил -2- Пикрилгидразил (DPPH) Радикальный масса и 2,2'-азино-бис (3- этилбензотиазолин -6- Сульфоницигил кислот) (abts⁺-is. Дальнейшие оценки проводились с использованием трех сотовых моделей:

Индуцированная UVB модель меланогенеза B16F10 для оценки ингибирования синтеза меланина посредством активности тирозиназы и содержания меланина;

Индуцированная липополисахаридом (LPS) воспалительная модель HACAT для оценки противовоспалительных эффектов путем измерения интерлейкина -6 (IL -6) и фактора некроза опухоли- (TNF-) подавления;

AAPH (2,2'-азобис (2- амидинопропан), индуцированная дигидрохлоридом модели окислительного стресса HACAT для определения антиоксидантной активности посредством усиления супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT).

Оптимальное соотношение массы PHGS/GLA было идентифицировано с помощью этих моделей. Результаты продемонстрировали, что растворы PHGS/GLA (приготовленные в солевом раунде с фосфатом, PBS, рН 6,8) в массовых отношениях 1: 1, 5: 1 и 10: 1, демонстрировали значительное ингибирование тирозиназы и синергетические антиоксидантные эффекты. Показатели ингибирования тирозиназы составляли 94,37%, 92,93%и 88,06%соответственно; Показатели поглощения радикалов DPPH достигли 89,44%, 88,72%и 88,10%; Показатели поглощения ABTS⁺ составили 100,13%, 100,01%и 99,87%. При 25 мкг/мл в DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) не показали цитотоксичности по отношению к клеткам B16F10 или HACAT. PHGS/GLA (1: 1) Решение DMEM отображаетсяпревосходное ингибирование тирозиназы(23,80% остаточная активность), значительноСнижение содержания меланина(30,90%) и превзошли другие отношения и монотерапию в подавлении IL -6/TNF-высвобождения и усиления активности SOD/CAT. Синергетическая комбинация PHG и GLA эффективно облегчает SКин -гиперпигментация путем ингибирования меланогенеза, уменьшая воспаление иУвеличение антиоксидантной способности.

Ключевые слова
CistancheДесертикола фенилетаноидные гликозиды; Глабридин; синергетический эффект; антимеланогенез; антиоксидант; противовоспалительное средство; Фармацевтическое сырье

 

 

 

CistancheДесертикола извлекать сВысокий уровеньфенилетаноидные гликозиды для отбеливания кожи

WhatsApp нам для более подробной информации

 

Экспериментальный раздел

1.1 Материалы, реагенты и инструменты

Мышиные меланомы клеткиB16F10 (каталог №: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

ЧЕЛОВЕКА НЕМОРМОРИЗАЦИИ КератиноцитыHACAT (Каталог №: ICELL-H066), Icell Bioscience Inc., Шанхай, Китай.

Cistanche фенилетаноидные гликозиды (PHGS)иГлабридин (GLA), Шэньси Тяньсинцзянь Биологическая Химическая Технология Ко., Лтд.

Тирозиназа, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Арбутин (ARB)иL-тирозин, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай.

1, 1- дифенил -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Япония.

2,2'-азино-бис (3- этилбензотиазолин -6- сульфоновая кислота) Диаммонная соль (ABTS), Шанхай Юанье Био-Технологии Co., Ltd.

Аскорбиновая кислота (VC), Tianjin Damao Chemical Reagent Factory.

Калий ПерсильфатиБезводный этанол, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Гидроксид натрия, Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipent Manufacturing Co., Ltd.

Дипотассийфосфат, Шанхай Саньпу Химическая Co., Ltd.

L-Dopa, Шанхай Юанье Био-Технологии Co., Ltd.

Комплект для подсчета ячейки -8 (CCK8), Пекин Синоинвитроген Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, диметилсульфоксид (ДМСО), 2,2'-азобис (2- метилпропионамидин) дигидрохлорид (AAPH), илипополисахарид (LPS), Пекин Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM с высокой глюкозой среды, Thermo Fisher Scientific (Китай).

Плодная бычья сыворотка (FBS), Sigma-Aldrich (Шанхай) Trading Co., Ltd.

Раствор пенициллин-стерепомицина, Шанхай Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Человеческий IL -6 набор ELISA, Человеческий набор TNF-ELISA, инабор элизы человекаУханьская компания Fine Biotech Co., Ltd.

Общий набор для анализа супероксиддисмутазы (SOD), Нанкинский биоинженерский институт Цзяньчэн. Все реагенты были аналитической оценки.

Используются инструменты:

Multiskan FC Full-Wavel Header ReaderиИнкубатор Heracell 371 CO2, Thermo Fisher Scientific, США.

Kq -200 vdb Ультразвуковое очистительКуньшань Ультразвуковые Инструменты Ко., Ltd.

DVKW-D -2 Цифровая термостатическая водяная баня, Пекин Юнгуанминг Медицинский Инструмент.

DHG -9246 Электрическая термостатическая сушка взрыва, Шанхай Цзинхун Экспериментальная Оборудование Co., Ltd.

KN4006B UVB Ultraviolet Gradiation Instruction(Интенсивность облучения: 8 МВт/см²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Методы

Во-первых, PHG и GLA растворяли либо в солевом растворе с фосфатом (PBS, PH =6. 8) или 50% этанол раствор для приготовления растворов с массовыми концентрациями{{0}}. 0 0 1, 0.Полем Затем PHGS и GLA смешали в соотношенииM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 и 1:40, чтобы подготовить растворы PHGS/GLA с общей массовой концентрацией0.4 g/L, помечен какPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), соответственно.

 

1.3 Биохимические эксперименты

1.3.1 Анализ ингибирования активности тирозиназы

В 96- well plate,50 мкл раствора испытательного образца, 50 мкл PBS (pH =6. 8), и50 мкл раствора L-тирозина (1 г/л)были последовательно добавлены. Тарелка инкубировали в водяной бане 37 градусов в течение 10 минут. Затем,5 0 мкл раствора тирозиназы (0,4 г/л, эквивалентно 200 ед/мл)был добавлен, и тарелка снова инкубировали в 37 -градусной водяной бане еще на 10 минут.

Арбутин (ARB)был использован в качестве положительного контроля, иPbs (ph =6. 8)использовался в качестве пустого управления.

Поглощение раствора в490 нмизмеряли с использованием считывателя микропланшетов, а скорость ингибирования тирозиназы in vitro (%) рассчитывали с использованием уравнения (1).

 

 

В формуле:

A _ реакцияявляется поглощением раствора образца, содержащего раствор L-тирозина, PBS и раствор тирозиназы.

A _ управление реакциейэто поглощение раствора образца, содержащего раствор L-тирозина, и PBS без раствора тирозиназы.

A _ blankявляется поглощением раствора, содержащего раствор L-тирозина, PBS и раствор тирозиназы без образца.

A _ пустой элемент управленияэто поглощение раствора, содержащего раствор L-тирозина и PBS без образца и раствора тирозиназы.

1.3.2 Определение деятельности DPPH свободных радикалов

Во -первых, {{0}}. 0197 g (0,05 ммоль) DPPH точно взвешивали и растворяли в 250 мл безводного этанола, чтобы подготовить рабочее решение DPPH с концентрацией0. 2 ммоль/л.

Затем PHG и GLA растворяли в 50% этаноле для приготовления растворов этанола PHG и GLA с массовыми концентрациями.{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1.6 и 2,0 г/Полем Растворы этанола венчурного капитала были получены таким же образом.

Впоследствии этинольные растворы PHG и GLA были смешаны в соотношенияхM (решение PHGS): M (GLA Solution)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Для получения 9 растворов этанола PHGS/GLA с различными массовыми соотношениями, помеченные какPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Окончательно,100 мкл каждого раствора для образцаи100 мкл рабочего раствора DPPHбыли добавлены на 96- скважину, равномерно смешан и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Поглощение в517 нмизмеряли с помощью считывателя микропланшетов. ВК был использован в качестве положительного контроля, и каждый эксперимент повторяли три раза.

Скорость массового удаления свободных радикалов DPPH (%) была рассчитана с использованием уравнения (2).

 

В формуле:

A1это поглощение раствора для образца + рабочего раствора DPPH.

A2это поглощение 50% рабочего раствора этанола + DPPH.

A3это абсорбция решения для образца + 50% этанола.

 

1.3.3 Определение активности по удалению свободных радикалов ABTS⁺

Первый,1 г (1,82 ммоль) ABTSрастворяли в деионизированной воде, чтобы подготовить работающий раствор ABTS с конечной концентрацией7,4 ммоль/л. 0. 5 г калия перцеплярастворяли в деионизированной воде для приготовления работающего раствора первойки для калия с конечной концентрацией2,6 ммоль/лПолем Равные объемы работающего раствора ABTS и рабочего раствора калия были смешаны и позволяли реагировать в темноте в течение 12 часов, чтобы подготовить рабочее решение ABTS⁺.

Затем растворы этанола PHGS, GLA и VC, а также растворы PHGS/GLA этанола с соотношениямиPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), готовили в соответствии с методом, описанным в разделе 1.3.2.

Окончательно,40 мкл каждого раствора для образцаи160 мкл рабочего раствора ABTS⁺были добавлены на 96- скважину, равномерно смешан и реагировать в темноте при комнатной температуре в течение 6 минут. Поглощение раствора в734 нмизмеряли с помощью считывателя микропланшетов.

Скорость массового удаления свободных радикалов ABTS⁺ была рассчитана с использованием уравнения (3).

 

 

В формуле:

A1это поглощение раствора для образца + Abts⁺ Рабочий раствор.

A2это поглощение деионизированной воды + Abts⁺ Рабочий раствор.

A3это поглощение раствора для образца + деионизированная вода.

1.4 Клеточные эксперименты

1.4.1 Клеточная культура

После возрождения клеток B16F10 и HACAT их высевали в среду с высоким уровнем глюкозы DMEM (содержит 10% плода-бычьи сыворотки и 1% раствора пенициллин-стерептомицина) и культивируется в37 градусов, 5% CO2, и70% влажностьв инкубаторе в течение 24 часов. Состояние роста клеток наблюдалось под микроскопом, а изменения среды или пассирование были выполнены как необходимые в зависимости от состояния роста клеток.

1.4.2 Экспериментальная группировка

Логарифмическая фаза B16F10 и HACAT-клетки высевали в 96- скважины на пластинах при соответствующей плотности клеток и культивировали в течение 24 часов, чтобы обеспечить приверженность клеток. Растворы образца с различными концентрациями готовили с использованием среды DMEM.

Экспериментальные группы были следующими:

Нормальная группа

Модельная группа

PHGS Lowd Dose Group(125 мкг/мл)

PHGS Средняя доза Группа(250 мкг/мл)

PHGS High Dose Group(500 мкг/мл)

GLA низкая доза группа(6,25 мкг/мл)

GLA Medium Dose Group(12,5 мкг/мл)

GLA High Dose Group(25 мкг/мл)

PHGS/GLA (1: 1) группа(25 мкг/мл)

PHGS/GLA (5: 1) группа

PHGS/GLA (10: 1) группа

ДляUVB-индуцированная модель пигментации в клетках B16F10, клетки модельной группы обрабатывали30 мкл PBS (pH =7. 4)и облучен под ультрафиолетовым излученным инструментом ультрафиолетового излучения3 см ниже устройствадля110 секундПолем Экспериментальные группы были предварительно обработаны100 мкл различных растворов образцаза 1 час до добавления30 мкл PBSи облучение под устройством UVB в течение 110 секунд. Нормальную группу непрерывно обрабатывали средой DMEM с высокой глюкозой, и пустая группа не содержала клетки, но была заменена на равное количество среды.

ДляLPS-индуцированная модель воспаления в клетках HACAT, модельная группа была обработана с помощью20 мкг/мл раствор PBS PBSв течение 24 часов. Экспериментальные группы были предварительно обработаны100 мкл различных растворов образцаВ течение 24 часов до добавления20 мкг/мл раствор LPSеще 24 часа. Нормальную группу непрерывно обрабатывали средой DMEM с высокой глюкозой, и пустая группа не содержала клетки, но была заменена на равное количество среды.

ДляИндуцированная AAPH-индуцированная модель окислительного стресса в клетках HACAT, модельная группа была обработана с помощью25 ммоль/л AAPH растворв течение 24 часов. Экспериментальные группы были предварительно обработаны100 мкл различных растворов образцаВ течение 24 часов до добавления25 ммоль/л AAPH раствореще 24 часа. Нормальную группу непрерывно обрабатывали средой DMEM с высокой глюкозой, и пустая группа не содержала клетки, но была заменена на равное количество среды.

Каждая группа была настроена с3 репликации скважини культивируется в37 градусов, 5% CO2, и70% влажностьв инкубаторе.

1.4.3 Анализ цитотоксичности

Цитотоксичность измерялась с помощьюМетод CCK8Полем Логарифмическая фаза B16F10 и клетки HACAT расщепляли с помощью0. 25% трипсинв течение 3 минут. После того, как пищеварение останавливали средой, клетки многократно пипетировали для приготовления клеточной суспензии с плотностью1 × 10⁴ ячейки/млПолем Клетки были равномерно посеяны в 96-.100 мкл на хорошои PBS был добавлен в периферические скважины. После приверженности ячейки добавляли различные концентрации растворов образца с3 репликации скважины на группуи клетки культивировали в37 градусов, 5% CO2, и70% влажностьдля24, 48 и 72 часаПрежде чем отказаться от среды.

Для всех групп,100 мкл среды с высокой глюкозой CCK8 DMEM (содержит 10% CCK8)был добавлен и инкубирован для60 минутПолем Поглощение раствора в450 нмизмеряли с помощью считывателя микропланшетов.

Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали с использованием уравнения (4).

 

В формуле:

A _ обработанэто поглощение хорошо содержащихся клеток, раствора CCK8 и раствора образца.

A _ blankэто поглощение хорошо содержащей среды и раствора CCK8, но без клеток.

A0является абсорбцией хорошо содержащихся клеток и раствора CCK8, но без раствора образца.

1.4.4 Анализ активности тирозиназы

Метод L-DOPA использовался для измерения активности тирозиназы. После лечения клеток48 часовКак описано в разделе 1.4.2, супернатант отбрасывали, и скважины дважды промывали PBS (pH =7. 4). Затем,50 мкл 1% Triton x -100 Решениебыл добавлен в каждую скважину и немедленно помещен в морозильную камеру –80 градусов для30 минутПолем Клетки оттаивали при комнатной температуре, чтобы вызвать лизис.

После предварительного выхода в37 градусовдля5 минут, 10 мкл 10 ммоль/л л-допа растворабыл добавлен в каждую скважину и инкубировал в37 градусов, 5% CO2 и 70% влажностьдля1 часПолем Поглощение в475 нмизмеряли с помощью считывателя микропланшетов. Каждый эксперимент повторялсятри разаи активность тирозиназы (%) рассчитывали с использованием уравнения (5).

В формуле:

A _ Экспериментэто поглощение хорошо содержащихся клеток и раствора образца при облучении UVB.

A _ нормальныйэто поглощение хорошо содержащихся клеток и раствора образца без облучения ультрафиолета.

A _ blankэто поглощение хорошо содержащей среды, но без клеток.

 

1.4.5 Измерение содержания меланина

Метод лизиса NaOH использовался для измерения содержания меланина. После лечения клеток72 часаКак описано в разделе 1.4.2, супернатант отбрасывали, а скважины дважды промывали PBS.100 мкл водного раствора NaOH, содержащего 10% ДМСО (1 моль/л)был добавлен в каждую скважину, а тарелка была помещена в90 градусов духовкидля1 часПолем Поглощение в490 нмизмеряли с помощью считывателя микропланшетов. Каждый эксперимент повторялсятри разаи содержание меланина (%) рассчитывали с использованием уравнения (5).

 

1.5 Измерение воспалительных факторов и индикаторов окислительного стресса

После лечения клеток48 часовКак описано в разделе 1.4.2,Клетки ХакатаИз каждой группы собирали с помощью клеточного скребка, центрифугированного, и супернатант собирали. Концентрации Il -6 и TNF- измеряли в соответствии с инструкциями наборов ELISA.

После лечения клеток48 часов, Клетки HACAT собирали с использованием клеточного скребка, подвергаемого повторным циклам замораживания-оттаивания, чтобы вызвать лизис клеток, и центрифугировали в12, 000 об / мин в течение 10 минут на 4 градусаПолем Супернатант был собран, и деятельностьДЕРНи концентрацииКОТбыли измерены с использованием инструкций набора ELISA.

 

1.6 Измерение комбинированного индекса

АМетод комбинированного индекса (CI)[20] использовали для оценки того, проявляла ли комбинация PHG и GLA в различных массовых отношениях синергетические эффекты при ингибировании активности тирозиназы и антиоксидации. Индекс комбинации рассчитывали с использованием уравнения (6).

 

В формуле:

D1иD2представляют соответствующие концентрации (г/л) двух препаратов в комбинированном лечении, необходимых для достиженияx% активность.

DXпредставляет концентрацию (г/л) каждого отдельного вещества при использовании в одиночку для достиженияx% активность.

АCompusyn Softwareиспользовался для расчетов:

CI> 1указывает на антагонистический эффект.

Ci=1Указывает аддитивный эффект.

CI <1указывает синергетический эффект.

 

1.7 Анализ данных

Все данные были выражены как«Среднее ± стандартное отклонение (x̄ ± s)»и дискуссии были основаны на средних значениях.

Статистический анализ был выполнен с использованиемGraphPad Prism 9.5. 0Полем Односторонний ANOVA (анализ дисперсии) использовался для сравнения между несколькими группами. АP-значение <0. 05считалось статистически значимым.