Синергический иммунитет и защита у мышей путем совместной иммунизации ДНК-вакцинами, кодирующими белок-шип и другие структурные белки SARS-CoV-2

Абстрактный:Появление новых вариантов коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS CoV-2) привело к повторяющимся вспышкам инфекции во всем мире. Эти сильно мутировавшие варианты снижают эффективность нынешних вакцин против коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19), которые предназначены для воздействия только на белок шипа (S) исходного вируса. За исключением S SARS-CoV-2, иммунозащитный потенциал других структурных белков (нуклеокапсида, N; оболочки, E; мембраны, M) в качестве антигенов-мишеней вакцины до сих пор неясен и заслуживает изучения. В этом исследовании были разработаны синтетические ДНК-вакцины, кодирующие четыре структурных белка SARS-CoV-2 (pS, pN, pE и pM), а мышей иммунизировали тремя дозами посредством внутримышечной инъекции и электропорации. Примечательно, что совместная иммунизация двумя ДНК-вакцинами, которые экспрессировали белки S и N, индуцировала более высокие нейтрализующие антитела и была более эффективной в снижении вирусной нагрузки SARS-CoV-2, чем один белок S у мышей. Кроме того, совместная иммунизация pS либо с pN, либо с pE + pM индуцировала более высокий клеточный иммунитет, специфичный к белку S, после трех иммунизаций и вызывала более легкие гистопатологические изменения, чем один pS, после заражения. Роль консервативных структурных белков SARS-CoV-2, включая белки N/E/M, следует дополнительно исследовать на предмет их применения в разработке вакцин, таких как мРНК-вакцины.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Ключевые слова: COVID-19; SARS-CoV-2}}; совместная иммунизация; ДНК-вакцина; спайковый белок; структурный белок

1. Введение

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) является причиной коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19), которая стала причиной миллионов инфекций и смертей во всем мире и поставила под угрозу здоровье человека и мировую экономику. . Хотя эффективные терапевтические подходы до сих пор недоступны, они быстро развиваются, включая применение CAR-T-клеточной терапии и нанотехнологий [1,2]. Вакцинация является эффективным способом борьбы с пандемией, и несколько вакцин были одобрены для использования различными регулирующими органами здравоохранения [3,4]. Геном коронавируса кодирует четыре основных структурных белка: белки шипа (S), нуклеокапсида (N), мембраны (М) и оболочки (Е), которые отвечают за сборку вириона и подавление иммунного ответа хозяина [5]. ]. Белок S состоит из 1273 аминокислотных остатков, содержащих две субъединицы, а именно S1 и S2. Он опосредует проникновение вируса и является основной мишенью для разработки вакцин против коронавируса [6–11]. Однако белок S SARS-CoV-2 имеет высокую частоту мутаций. Неудивительно, что в SARS-CoV-2, РНК-вирусе, мутация непрерывна и неизбежна. С сентября 2020 г. появилось пять вызывающих беспокойство вариантов SARS-CoV-2 (ЛОС), в том числе B.1.1.7 (Великобритания, Альфа), B.1.351 (Южная Африка, Бета), P.1. (Бразилия, Гамма), B.1.617.2 (Индия, Дельта) и B.1.1.529 (Южная Африка, Омикрон) (Андреано и Раппуоли, 2021; Гупта, 2021). Все они имеют несколько мутаций в белке-шипе [12]. Эти варианты ставят под угрозу эффективность нынешних вакцин против COVID-19, которые предназначены только для воздействия на шиповидный белок.

Белок N SARS-CoV-2 связывается с вирусной РНК посредством РНК-связывающего домена длиной 140-аминокислоты в их ядре по принципу «бусинки на нитке». Он высококонсервативен среди коронавирусов, имеет примерно 90% идентичности последовательности с последовательностью SARS-CoV, а также является единственным структурным белком внутри вириона [13]. Кроме того, он играет важную роль в упаковке вирусной РНК в рибонуклеокапсидный комплекс и необходим для репликации вирусной РНК, сборки вириона и высвобождения из клеток-хозяев [14]. Учитывая высокое сходство последовательностей белка N у коронавирусов, его можно предложить в качестве мишени вакцины перекрестной защиты. Ранее мы обнаружили, что совместная иммунизация двумя ДНК-вакцинами, экспрессирующими белки E и M, обеспечивает частичную защиту от SARS-CoV-2, и этот метод следует учитывать при разработке вакцины [15]. В зависимости от ландшафтного документа ВОЗ обычно существует семь стратегий кандидатов на вакцины против SARS-CoV-2, которые можно далее разделить на три категории: во-первых, вакцины на основе белков, включая инактивированные вирусные вакцины, вирусоподобные вакцины. частицы и белковые субъединичные вакцины; во-вторых, вакцины на основе генов, включая вакцины с векторным вирусом, ДНК-вакцины и мРНК-вакцины; в-третьих, сочетание подходов, основанных на белках и генах, таких как живые аттенуированные вирусные вакцины. Технологии ДНК, как новые стратегии создания вакцин на основе генов, позволяют быстро сравнивать несколько кандидатов на вакцины и стратегии во время доклинических испытаний [16,17]. Теоретически почти все вирусные белки являются потенциальными иммуногенами и мишенями вакцин. Однако, насколько нам известно, иммуногенность и защитный потенциал синтетических ДНК-вакцин в отношении кодирования S-белков SARS-CoV-2 и других структурных белков еще не систематически описаны. Четыре ДНК-вакцины, экспрессирующие белки S, N, E и M l SARS-CoV-2, были оценены на их иммуногенность и защитную эффективность на мышах для изучения иммунологических эффектов S в сочетании с другими структурными белками.

2. Материалы и методы

2.1. Клетки

Клетки Huh7.5 и клетки 293T эмбриональной почки человека культивировали при 37 ◦C во влажной атмосфере при 5% CO2 на протяжении всего исследования. Клетки культивировали в среде DMEM (HyClone, Logan, UT, США), с добавлением 10% FBS (GEMINI Co., Шанхай, Китай) и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Все клеточные линии оказались отрицательными на контаминацию микоплазмой.

2.2. Создание ДНК-вакцин, кодирующих SARS-CoV-2 S/N/E/M

Ген, кодирующий белок SARS-CoV-2 S/N, содержащий N-концевую последовательность Козака (GCCACC), за которой следует инициирующий кодон (ATG), был синтезирован с использованием кодона, оптимизированного для млекопитающих (GenScript Co., Нанкин). , Китай). Затем его клонировали в вектор экспрессии pcDNA3.1 (+) посредством расщепления EcoRI и XbaI и назвали pS/pN (ДНК-вакцины) (рис. 1А). Белок pE/PM был сконструирован и идентифицирован, как описано ранее [15]. Вакцины были приготовлены с использованием наборов Maxiprep, не содержащих эндотоксинов (Qiagen, Пекин, Китай), а последовательности были подтверждены с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру. Экспрессию белка S/N подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и антител против S (Sino Biological, Пекин, Китай)/анти-N, разведенных в соотношении 1:1000. Эти эксперименты проводились, как описано ранее [15,18].

Рисунок 1. Разработка и экспрессия белковых вакцинных конструкций SARS-CoV-2 S/N на основе рекомбинантной ДНК. (A) Схематическая диаграмма вакцин на основе рекомбинантной ДНК, кодирующих белки шипа (PS), нуклеокапсида (pN), оболочки (pE) и/или мембраны (PM) SARS-CoV-2. (B) Экспрессия целевого белка в ДНК-вакцинах была подтверждена с помощью вестерн-блот-анализа клеток 293T, трансфицированных плазмидами pS/pN/pE/pM.

2.3. Иммунизация и вызов

Самок мышей BALB/c (Charles River Laboratories, Франция) в возрасте 6 недель содержали в Национальном институте гигиены труда и контроля отравлений в среде с температурой 21 ◦C и контролируемой влажностью с 12-часовыми циклами света/темноты. Между тем, еда и вода предоставлялись вволю, и все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Китайского центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC). Исследование соответствовало соответствующим этическим нормам.

Мышей случайным образом разделили на пять групп и иммунизировали только pS/pN или совместно с pS + pN или pS + pE + PM в дни 0, 21 и 42 посредством внутримышечной инъекции плюс электропорация (35 мг/50 мл) (рис. 2) [19,20]. Вкратце, ДНК-вакцины вводили в переднюю большеберцовую мышцу (ТА) и сразу же подвергали воздействию электричества с использованием двухигольного матричного электрода на расстоянии 5 мм друг от друга (ECM830; BTX) с иглами. Сыворотку мышей собирали для анализа гуморального иммунного ответа, а селезенку мышей обрабатывали для измерения клеточного иммунного ответа (рис. 2).

Рисунок 2. Схема иммунизации и заражения SARS-CoV-2. Временной ход вакцинации, заражения и отбора проб крови/тканей. Мышей BALB/C случайным образом разделили на группы.

Эксперименты по заражению SARS-CoV-2 проводились, как описано ранее [15,21]. Вкратце, мышей анестезировали, а затем интраназально трансдуцировали 2,5 × 108 БОЕ Ad5-hACE2 в общем объеме 45 мкл. Через пять дней после трансдукции мышам вводили анестезию, а затем интраназально вводили 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) в общем объеме 50 мкл физиологического раствора. буфер. Вся работа с живым SARS-CoV-2 на моделях мышей проводилась в лабораториях уровня биологической безопасности животных 3 (ABSL-3).

2.4. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили, как описано ранее [15]. Вкратце, белки S (приобретенные у Sino Biological)/N (подарок от Song), разведенные в карбонатном буфере (0,1 М, pH 9,6), наносили на 96-луночные планшеты EIA/RIA (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в течение ночи при 4 ◦C. Планшеты блокировали 200 мкл 10%-ной козьей сыворотки в PBS при 37 ◦C в течение 2 часов с последующей пятикратной промывкой PBST. Затем добавляли образцы сыворотки, серийно разведенные 2%-ной козьей сывороткой в ​​PBS, и инкубировали в течение 2 часов при 37 ◦C с последующими пятью промывками PBST. Конъюгированное с HRP козье антимышиное IgG Ab (1:5000) добавляли при 37 ◦C в течение 1 часа. В каждую лунку добавляли в общей сложности 100 мкл субстрата ТМБ и гасили 50 мкл 2М ​​H2SO4. Поглощение измеряли при длине волны 450 нм с использованием SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Гонконг, Китай).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Псевдовирусная инфекция и эксперименты по нейтрализации

Анализ нейтрализации псевдовируса проводили, как описано ранее [21,22]. Ранее была сконструирована плазмида, экспрессирующая S-белок предкового вируса [22]. Был синтезирован ген шипового белка варианта SARS-CoV-2 Omicron (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) (подарок от Vazyme Biotech Co., Ltd., Нанкин, Китай). с использованием оптимизированного для млекопитающих кодона и клонирования в вектор pcDNA3.1, как описано ранее [22]. Вкратце, плазмиды, экспрессирующие репортер люциферазы, и плазмиды, экспрессирующие белок S, совместно трансфицировали в клетки HEK 293T с использованием реагента для трансфекции ДНК X-treme GENE HP. Культуру клеток обновляли через 6 часов после трансфекции, а супернатант, содержащий псевдовирус, собирали через 48 часов и хранили при -70 ◦C. В анализе нейтрализации псевдовируса равную смесь сыворотки и вируса затем инкубировали в 37 объемах супернатанта, содержащего псевдовирус, а затем добавляли к разбавленной сыворотке. ◦С в течение 1 часа. Затем культуральную среду клеток Huh7.5 заменяли 100 мкл смеси сыворотки и вируса и инкубировали при 37 ◦C в течение 12 часов. Клетки, культивированные только с псевдовирусами SARS-CoV-2, обрабатывались параллельно. Затем среду заменяли на DMEM (2% FBS) и инкубировали при 37 ◦C в течение 48 часов. Затем измеряли сигнал люциферазы с использованием набора люциферазы светлячка Bright-Glo (Promega).

2.6. Анализ нейтрализации SARS-CoV-2

В этом эксперименте использовался SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019). Вкратце, сыворотку разбавляли в два раза от начального разведения 1:10, смешивали с равным объемом (10–15 БОЕ/лунку) живого SARS-CoV-2 и инкубировали в течение 1 часа при 37 ◦C. после чего их добавляли к засеянным клеткам Vero. После инкубации при 37 ◦C в течение 48 часов наблюдался цитопатический эффект (CPE), и 100 мкл культурального супернатанта собирали для экстракции нуклеиновых кислот и флуоресцентной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-PCR). Медианную нейтрализующую дозу (ND50) рассчитывали по методу Рида-Мунка [15].

2.7. IFN-ELISpot-анализ

Пулы пептидов, охватывающие весь белок S/N/E/M в виде последовательных 15-меров, перекрывающих 10 аминокислот, были синтезированы компанией Scilight Biotechnology, LLC. Приблизительно 2,5 мг каждого очищенного пептида в пуле пептидов присутствовало на флакон. Эксперимент проводился, как описано ранее [18]. Вкратце, планшеты с лунками 96- (BD ELISPOT Set, США) покрывали антителами против IFN-захвата и инкубировали в течение ночи при 4 ◦C. Планшеты блокировали полной культуральной средой после трехкратного промывания. Спленоциты собирали после того, как мышей подвергали эвтаназии на 35-й и 120-й день. Свежие одноклеточные суспензии из каждой группы высевали по 5 × 106 на лунку и добавляли пептиды. Затем планшеты инкубировали при 37 ◦C в 5% CO2 в течение 22 часов и детектировали с помощью планшет-ридера ELISpot (Biosys, So. Pasadena, Калифорния, США). Пятнообразующая единица (SFU) представляет собой IFN-, секретирующий Т-клетки.

2.8. Оценка защиты мышей после заражения SARS-CoV-2

Эксперименты проводились, как описано ранее [15,21]. Вкратце, легкие собирали после того, как мышей подвергали эвтаназии. Половину тканей использовали для экстракции нуклеиновых кислот, флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени и TCID50. Другая половина была отправлена ​​в Колледж ветеринарной медицины Китайского сельскохозяйственного университета для патологоанатомической оценки.

2.9. Статистический анализ

Непарные t-критерии, двусторонние тесты ANOVA и тест множественных сравнений Даннетта были выполнены с использованием GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC). значения p < 0.05 считались статистически значимыми (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** р < 0,001; **** р < 0,0001).

3. Результаты

3.1. Характеристика ДНК-вакцин

Уровни белков E и M определяли с помощью вестерн-блоттинга. Мы измерили экспрессию кодируемых белков S/N/E/M SARS-CoV-2 в HEK-293T-клетках, трансфицированных плазмидами pS/pN/pE/pM, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антигена. -S/анти-N антитела и антитело анти-6 x His в клеточных лизатах. Полосы аппроксимировали предсказанную молекулярную массу белков S (140–142 кДа), N (45 кДа), E (10 кДа) и M (22–25 кДа) (рис. 1B).

3.2. Устойчивая и устойчивая продукция анти-S и/или анти-N IgG, индуцированная ДНК pS и/или pN

Вакцины. Сыворотку собирали у мышей BALB/c через 35, 56, 96 и 120 дней (рис. 2). Уровни анти-S/анти-N IgG определяли с помощью ELISA. Величина S- или N-специфического ответа IgG, индуцированного pS или pN, увеличивалась в сыворотке после первой и второй иммунизации. Титры анти-S и анти-N IgG были выше в группе pS + pN, чем в других группах; однако разница не была статистически значимой (рис. 3А, Б). Никаких надежных реакций антител, специфичных к E/M-белку, обнаружено не было, что согласуется с результатами предыдущего исследования (данные не показаны) [15].

Рисунок 3. Реакция B-клеток на SARS-CoV-2 у мышей BALB/c. (A) Титры конечной точки связывания IgG в сыворотке для белков SARS-CoV-2 S (A) и N (B). (C) Титры нейтрализации определяли на основе системы псевдотипированного вируса SARS-CoV-2. (D) Титры нейтрализации анти-SARS-CoV-2 определяли с использованием вируса SARS-CoV-2. (E) Анализ нейтрализации на основе псевдотипированной вирусной системы SARS-CoV-2 Omicron. Показаны коэффициенты ингибирования для сывороток из групп имитации (синий), pS (красный), pS + pN (зеленый), pS + pE + pM (розовый) и pN (оранжевый). Столбики ошибок представляют собой SEM, а значения p были рассчитаны с использованием двустороннего дисперсионного анализа и апостериорного анализа Сидака, где * p < 0,05.

3.3. Высокие уровни нейтрализующих антител, индуцированные совместной иммунизацией вакцинами pS и pN

Нейтрализующие титры серийно разведенных образцов сыворотки определяли с использованием псевдотипированного вируса SARS-CoV-2. Самые высокие уровни нейтрализующих антител (nAb) наблюдались в группе pS + pN, при этом обратные средние геометрические титры EC50 достигали 2988 (на 35-й день) и 3578 (на 56-й день) (рис. 3C). Аналогичные результаты наблюдались при использовании анализа микронейтрализации живого вируса (MN), при котором уровни nAb в группе pS + pN были выше, чем в группе S на 56 и 96 дни (p < 0,05; рисунок). 3D). Более того, уровни nAb в группе pS + pN на 56-й день (вторая ревакцинация) были значительно выше, чем на 35-й день (p <0,05; рисунок 3D).

Нейтрализующую активность каждой схемы вакцинации против варианта SARS-CoV-2 Omicron дополнительно определяли с использованием псевдотипированной платформы и образцов сыворотки. Профиль нейтрализации вируса Омикрон на 35 и 56 дни был аналогичен профилю нейтрализации предкового вируса (рис. 3E), что позволяет предположить, что обработка PS + pN имела перекрестную нейтрализующую эффективность.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

3.4. Ответы Т-клеток, индуцированные ДНК-вакцинацией

Как описано ранее, ответы Т-клеток против антигенов SARS-CoV-2 S/N/E/M оценивались с использованием IFN-ELISpot, как описано ранее [15]. Как и ожидалось, схемы PS + pN и pS + pE + pM индуцировали значительно более высокие уровни IFN + Т-клеток, специфичных для S-белка, на 12-й день0, чем на 35-й день (p < 0). 05; Рисунок 4А). Более того, количество IFN + T-клеток, специфичных для белка N, на 120-й день (вторая ревакцинация) было значительно выше, чем на 35-й день в группе pS + pN (p <0,05; рисунок 4B). Наконец, количество IFN + Т-клеток, специфичных для белка М, на 120-й день (вторая ревакцинация) было значительно выше, чем на 35-й день в обеих группах (p <0,05; рисунок 4D).

Рисунок 4. Реакция Т-клеток на отдельные структурные белки SARS-CoV-2 у мышей BALB/c. (A) Ответы Т-клеток измерялись с использованием IFN-ELISpot в спленоцитах, стимулированных в течение 20 часов перекрывающимися пулами пептидов, охватывающими SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, и (D) М-белки. Столбцы представляют собой среднее значение ± SD. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего дисперсионного анализа и апостериорного критерия Сидака, где * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 и **** р < 0,0001.

3.5. Синергическая защита, индуцированная совместной иммунизацией с PS/pN или PS/PE/PM

Затем мы оценили защитную эффективность ДНК-вакцин с использованием мышей hACE2, иммунизированных после заражения предковым вирусом SARS-CoV-2. После заражения мыши в экспериментальной группе начали постепенно терять вес. Напротив, мыши, иммунизированные либо pS, либо pS+, показали легкую потерю веса сразу после заражения с последующим выздоровлением (рис. 5А). У мышей, вакцинированных pS, pS + pN или pS + pE + pM, живой вирус не был обнаружен. Кроме того, вакцинация pS + pN значительно снижала количество копий вирусной РНК по сравнению с теми, которые были получены только при вакцинации pS (p=0.0228; рисунок 5B). Более того, гистопатология легких показала, что у мышей как в группе имитации, так и в группе pN наблюдались очаговые участки воспаления, инвагинация плевры, альвеолярный коллапс, высокий уровень инфильтрации воспалительных клеток и геморрагические участки. Для сравнения, у мышей, получавших либо pS + pN, либо pS + pE + pM, наблюдались более легкие гистопатологические изменения и более низкие показатели INHAND после заражения, чем в другой группе (рис. 5C).

Рисунок 5. Защитная эффективность иммунизации после заражения живым вирусом SARS-CoV-2. (A) Мышей взвешивали ежедневно (среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (SEM), n=4) в течение трех дней после заражения. (B) Титр инфекционного SARS-CoV-2 в легочных гомогенатах на третий день после заражения, определенный с помощью анализа TCID5{{10}} и количества копий РНК. Статистически значимые различия между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующей коррекцией множественного сравнения Даннетта (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** р < 0,0001). (C) Гистопатологический анализ легких с использованием окрашивания H&E.

4. Дискуссия

В этом исследовании совместная иммунизация двумя ДНК-вакцинами, экспрессирующими белки S и N, индуцировала высокие уровни nAb и была очень эффективной в снижении вирусной нагрузки SARS-CoV-2 у мышей. ДНК-вакцины, экспрессирующие белок S, индуцировали повышение уровня клеточного иммунитета, специфичного для S-белка, после трех иммунизаций, когда мышей совместно иммунизировали белками N/E и M, и облегчали гистопатологические изменения после заражения. Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий синергическое усиление иммунитета и защиты у мышей с использованием ДНК-вакцины, кодирующей белок S, при совместной иммунизации ДНК-вакцинами, кодирующими другие структурные белки SARS-CoV{{8 }}.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Иммунодоминантные B-клеточные эпитопы в областях N-антигена наблюдались в нескольких исследованиях. Вакцины на основе N обычно не могут индуцировать nAb, вероятно, потому, что белок N не отображается на поверхности вируса. Примечательно, что совместная иммунизация белками S и N индуцировала более высокие уровни nAb против предкового вируса и вируса Omicron SARS-CoV-2, чем в других группах. Повышенный ответ nAb связан с лучшим клиренсом вируса и защитной эффективностью. Наши результаты показали, что лечение pS + pN было более эффективным, чем лечение только pS, в снижении вирусной нагрузки SARS-CoV-2 после заражения. В предыдущем исследовании сообщалось, что хомяки, иммунизированные вакциной, совместно экспрессирующей белки M и N, были защищены от серьезной потери веса и патологии легких, а также имели значительно сниженные титры вируса в ротоглотке и легких после заражения SARS-CoV-2. что согласуется с нашими результатами [23]. К сожалению, снижение титров вируса не может быть связано именно с белком M или N, а уровни nAb в этом исследовании не оценивались. В одном исследовании мРНК вакцины SARS-CoV-2 сообщалось, что совместная иммунизация S + N индуцировала усиленный S-специфичный CD8+ Т-клеточный ответ и активность нейтрализующих антител, обеспечивая лучшую защиту легких от дельта-антител. вариант по сравнению с одним S, что согласуется с результатами этого исследования [24]. В другом исследовании сообщалось, что белок N коронавируса трансмиссивного гастроэнтерита способствует синтезу нейтрализующих антител, когда клетки TGEV-IMMUNE свиньи стимулируются комбинацией белков S и N in vitro, и этот эффект можно объяснить реакцией хелперных Т-лимфоцитов на белок N [25].

Иммунодоминантные эпитопы CD4+/CD8+ Т-клеток в регионах N-антигена были идентифицированы ранее. В нескольких исследованиях сообщалось, что вакцины на основе белка N SARS-CoV-2 N эффективно индуцируют клеточные иммунные реакции. В группе S + N наблюдалось повышение уровня клеточного иммунитета, специфичного для S-белка, после трех иммунизаций. В одном исследовании мРНК-вакцины SARS-CoV-2 сообщалось, что комбинаторный S + N индуцировал усиленный S-специфичный CD8+ Т-клеточный ответ по сравнению с одним S, что согласуется с нашими результатами [24]. В другом исследовании сообщалось, что реакции Т-клеток на антигены S и N после первичной вакцинации двойным антигеном hAd5 S + N были эквивалентны реакциям ранее инфицированных SARS-CoV-2- пациентов, а модели прогнозирования in silico Т-клеток Связывание эпитопа HLA позволило предположить, что Т-клеточные ответы на вакцину hAd5 S + N сохранят свою эффективность против варианта B.1.351. Более того, плазма пациентов, ранее инфицированных SARS-CoV-2-, показала более высокую аффинность связывания с клетками, экспрессирующими конструкцию двойного антигена S-Fusion + N-ETSD, чем только с hAd5 S-Fusion, что еще раз указывает на то, что иммуногенность Вакцина с двойным антигеном S + N лучше, чем вакцина с одним антигеном S [26].

Живой вирус не был обнаружен в легких, а потеря веса после заражения была смягчена в группах pS, pS + pN и pS + pE + pM, тогда как обработка pN не приводила к эффективному снижению титра вируса. Эти результаты подчеркивают незаменимость и эффективность белка S в качестве мишени вакцины. Примечательно, что совместная иммунизация pS и pN имела лучший эффект, чем pS или pN, на клиренс вируса. В группе pS + pE + pM отмечено меньшее количество гистопатологических изменений в легких, что согласуется с результатами нашего предыдущего исследования [15]. В группе S + N было мало копий вирусной РНК в легких, меньшая потеря веса и быстрое время восстановления после заражения SARS-CoV-2 по сравнению с группой, иммунизированной только S/N, что соответствовало результаты этого исследования. Однако ни в одной из групп не были обнаружены титры нейтрализующих антител, что можно объяснить различиями в разнообразии вакцин и подопытных животных [26]. В одном исследовании вакцины против вектора аденовируса SARS-CoV-2 сообщалось, что вакцина S обеспечивает острую защиту мозга только при совместной иммунизации с вакциной N [27]. В другом исследовании были разработаны вакцины Tri: ChAd, Bi: ChAd и Mono: ChAd, экспрессирующие белки S1/N/RdRp, N/RdRp и S1 соответственно, и протестированы их на модели животных B.1.351. Обширная грубая патология наблюдалась в Mono:ChAdlungs, тогда как легкие Bi:ChAd и Tri:ChAd оказались почти свободными от этой патологии [28].

Кроме того, у невакцинированных животных наблюдалась высокая вирусная нагрузка в легких, тогда как обработка Tri:ChAd значительно снижала вирусную нагрузку на 3,5 log. Для сравнения, вакцины Bi:ChAd и Mono:ChAd лишь умеренно снижали вирусную нагрузку. Эти результаты позволяют предположить, что защитный эффект вакцины с двойным антигеном S/N против вариантов может быть лучше, чем у вакцины с одним антигеном S, что согласуется с нашими результатами [28]. В нескольких исследованиях сообщалось, что у мышей, иммунизированных N-белком, после заражения SARS-CoV развивается тяжелое воспаление легких [29–31]. Предыдущие исследования также показали, что иммунизация аденовирусной векторной вакциной, экспрессирующей белок N вируса мышиного гепатита, защищает мышей от летальной инфекции, что демонстрирует, что белок N может оказывать защитное действие [32]. Кроме того, группа, иммунизированная ДНК-вакциной CRT/N, имела значительно сниженный титр вируса после заражения, при этом вирус коровьей оспы экспрессировал белок N SARS-CoV [33].

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Одно исследование белка S показало, что комбинированная ДНК/белковая вакцина индуцирует как гуморальный, так и клеточный иммунитет лучше, чем одна ДНК/белковая вакцина [8]. Вакцины, нацеленные только на белок S, продемонстрировали меньшую эффективность в защите от легкой и умеренной формы COVID,-19 вызванной новыми вариантами. Роль консервативных структурных белков SARS-CoV-2, включая белки N/E/M, заслуживает внимания при разработке и применении вакцин, поскольку мутации обычно не влияют на индуцированные вакциной Т-клеточные реакции против консервативных эпитопов. . В одном исследовании сообщалось, что пациенты, выздоровевшие от SARS (n=23), все еще обладали Т-клетками долговременной памяти, реагирующими на N-белок SARS-CoV, спустя 17 лет после вспышки 2003 года, которые демонстрировали устойчивую перекрестную реактивность к SARS CoV. {15}} N-белок, что еще раз подтверждает возможность использования N-белка в качестве мишени вакцины для перекрестной защиты [34]. Это исследование продемонстрировало, что совместная иммунизация pS/pN была связана с более высокими ответами nAb, лучшим клиренсом вируса и улучшенными клеточными иммунными реакциями и может обеспечить лучшую защиту после заражения SARS-CoV-2 по сравнению с одним pS. Кроме того, было показано, что варианты SARS-CoV-2 заражают многие виды животных, а передача вируса от человека к животному наблюдалась у некоторых диких животных и домашних животных [7]. Итак, ветеринарная вакцина против SARS-CoV-2 требует большего внимания. Кроме того, нанотехнологии могут стать мощным инструментом оптимизации вакцин и заслуживают большего внимания [2].

Это обучение имеет несколько ограничений. Во-первых, мы наблюдали стратегию ДНК-вакцины только у мышей BALB/c, и будущие исследования должны оценить иммуногенные эффекты этих схем вакцинации на других моделях животных. Во-вторых, необходимы дополнительные исследования, чтобы полностью понять молекулярные механизмы, лежащие в основе усиленных nAb- и S-специфичных ответов CD8 Т-клеток, индуцированных совместной иммунизацией с использованием белков S и N, и использовать эти знания для оптимизации COVID.-19 конструкция вакцины. Наконец, функция антител, специфичных к N-белку, заслуживает дальнейшего изучения.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

В заключение, в этом исследовании оценивался иммунозащитный потенциал совместной иммунизации белками S, N, E и M SARS-CoV-2. Некоторые вакцины, нацеленные только на белок S, оказывают пониженное защитное действие на возникающие варианты штаммов. Наши результаты заложат основу для разработки перекрестно-реактивной вакцины против COVID-19 для борьбы с существующими и появляющимися вариантами SARS-CoV-2 и предотвращения потенциальных пандемий коронавируса.

Рекомендации

1. Змиевская Е.; Валиуллина А.; Ганеева И.; Петухов А.; Ризванов А.; Булатов Е. Применение CAR-T-клеточной терапии за пределами онкологии: аутоиммунные заболевания и вирусные инфекции. Биомедицина 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Рашидзаде Х.; Данафар, Х.; Рахими, Х.; Мозафари, Ф.; Салехиабар, М.; Рахмати, Массачусетс; Рахамуз-Хагиги, С.; Мусазаде, Н.; Мохаммади, А.; Эртас, Ю.Н.; и другие. Нанотехнологии против нового коронавируса (коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома): диагностика, лечение, терапия и перспективы на будущее. Наномедицина 2021, 16, 497–516. [Перекрестная ссылка]

3. Фонтане А.; Кошемес, С. Коллективный иммунитет к COVID-19: где мы находимся? Нат. Преподобный Иммунол. 2020, 20, 583–584. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Джейанатан, М.; Афхами, С.; Смайлл, Ф.; Миллер, М.С.; Личти, Б.Д.; Син, З. Иммунологические аспекты стратегий вакцинации против COVID-19. Нат. Преподобный Иммунол. 2020, 20, 615–632. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Ванделли А.; Монти, М.; Миланетти, Э.; Армаос, А.; Руперт, Дж.; Закко, Э.; Бечара, Э.; Делли Понти, Р.; Тарталья, Г.Г. Структурный анализ генома SARS-CoV-2 и предсказания интерактома человека. Нуклеиновые кислоты Рез. 2020, 48, 11270–11283. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

6. Джексон, CB; Фарзан, М.; Чен, Б.; Чоу, Х. Механизмы проникновения SARS-CoV-2 в клетки. Нат. Преподобный мол. Клеточная Биол. 2022, 23, 3–20. [Перекрестная ссылка]

7. Конфорти, А.; Санчес, Э.; Сальватори, Э.; Лионе, Л.; Компаньоне, М.; Пинто, Э.; Паломбо, Ф.; Д'Акунто, Э.; Музи, А.; Росцилли, Г.; и другие. Кандидат на линейную ДНК-вакцину, кодирующий домен связывания рецептора SARS-CoV-2, вызывает мощный иммунный ответ и нейтрализующие антитела у домашних кошек. Мол. Там. Методы Клин. Дев. 2023. [Перекрестная ссылка]

8. Боргоякова, М.Б.; Карпенко Л.И.; Меркульева И.А.; Щербаков Д.Н.; Рудометов А.П.; Старостина Е.В.; Шаньшин, Д.В.; Исаева А.А.; Несмеянова В.С.; Волкова, Н.В.; и другие. Иммуногенность комбинированной ДНК/белковой вакцины против COVID-19. Бык. Эксп. Биол. Мед. 2023, 1–4. [Перекрестная ссылка]

9. Цюй, Л.; Йи, З.; Шен, Ю.; Лин, Л.; Чен, Ф.; Сюй, Ю.; Ву, З.; Тан, Х.; Чжан, X.; Тиан, Ф.; и другие. Циркулярные РНК-вакцины против SARS-CoV-2 и новых вариантов. Ячейка 2022, 185, 1728–1744.e16. [Перекрестная ссылка]

10. Корбетт, К.С.; Эдвардс, ДК; Лейст, СР; Абиона, ОМ; Бойоглу-Барнум, С.; Гиллеспи, РА; Химансу, С.; Шефер, А.; Зиваво, Коннектикут; ДиПиацца, AT; и другие. Разработка мРНК-вакцины SARS-CoV-2 стала возможной благодаря готовности прототипа патогена. Природа 2020, 586, 567–571. [Перекрестная ссылка]

11. Тиан, Дж. Х.; Патель, Н.; Хаупт, Р.; Чжоу, Х.; Уэстон, С.; Хаммонд, Х.; Лог, Дж.; Портнов, А.; Нортон, Дж.; Гебре-Ксабье, М.; и другие. Иммуногенность вакцины-кандидата на основе гликопротеина SARS-CoV-2 NVX-CoV2373 у павианов и защита у мышей. Нат. Коммун. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Андреано, Э.; Пачелло, И.; Пиччини, Дж.; Манганаро, Н.; Пилери, П.; Хисени, И.; Леонарди, М.; Пантано, Э.; Аббьенто, В.; Бенинкаса, Л.; и другие. Гибридный иммунитет улучшает В-клетки и антитела против вариантов SARS-CoV-2. Природа 2021, 600, 530–535. [Перекрестная ссылка]

13. Накви, ААТ; Фатима, К.; Мохаммад, Т.; Фатима, У.; Сингх, Индиана; Сингх, А.; Атиф, С.М.; Харипрасад, Г.; Хасан, генеральный менеджер; Хассан, М.И. Взгляд на геном, структуру, эволюцию, патогенез и методы лечения SARS-CoV-2: подход структурной геномики. Биохим. Биофиз. Акта Мол. Основа. Дис. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Аббаси, Дж. Новая индийская ДНК-вакцина от COVID-19 для подростков и взрослых является первой. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Чен Дж.; Дэн, Ю.; Хуанг, Б.; Рука.; Ван, В.; Хуанг, М.; Чжай, К.; Чжао, З.; Ян, Р.; Чжао, Ю.; и другие. ДНК-вакцины, экспрессирующие белки оболочки и мембраны, обеспечивают частичную защиту от SARS-CoV-2 у мышей. Передний. Иммунол. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Тебас, П.; Крайняк, К.А.; Патель, А.; Маслоу, Дж. Н.; Морроу, член парламента; Сильвестр, Эй Джей; Ноблок, Д.; Гиллеспи, Э.; Аманте, Д.; Расин, Т.; и другие. Внутрикожная ДНК-вакцина SynCon®Ebola GP устойчива к температуре и безопасно демонстрирует преимущества клеточной и гуморальной иммуногенности у здоровых добровольцев. Дж. Заразить. Дис. 2019, 220, 400–410. [Перекрестная ссылка]

17. Смит, TRF; Патель, А.; Рамос, С.; Элвуд, Д.; Чжу, X.; Ян, Дж.; Гэри, EN; Уокер, С.Н.; Шультайс, К.; Пурвар, М.; и другие. Иммуногенность ДНК-кандидатной вакцины против COVID-19. Нат. Коммун. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Чжао, З.; Дэн, Ю.; Ню, П.; Сонг, Дж.; Ван, В.; Ду, Ю.; Хуанг, Б.; Ван, В.; Чжан, Л.; Чжао, П.; и другие. Совместная иммунизация VLP CHIKV и ДНК-вакцинами вызывает многообещающую гуморальную реакцию у мышей. Фронт Иммунол. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Гуань Дж.; Дэн, Ю.; Чен, Х.; Инь, Х.; Ян, Ю.; Тан, В. Праймирование двумя ДНК-вакцинами, экспрессирующими белок NS3 вируса гепатита С, нацеленный на дендритные клетки, вызывает превосходный гетерологичный защитный потенциал у мышей. Арх. Вирол. 2015, 160, 2517–2524. [Перекрестная ссылка]

20. Чен, Х.; Вэнь, Б.; Дэн, Ю.; Ван, В.; Инь, Х.; Гуан, Дж.; Руан, Л.; Тан, В. Усиленный эффект иммунизации ДНК плюс электропорация in vivo с использованием комбинации плазмид ядра вируса гепатита B-PreS1 и S-PreS1. Клин. Вакцина Иммунол. 2011, 18, 1789–1795. [Перекрестная ссылка]

21. Ян, Р.; Дэн, Ю.; Хуанг, Б.; Хуанг, Л.; Лин, А.; Ли, Ю.; Ван, В.; Лю, Дж.; Лу, С.; Жан, З.; и другие. Вакцина мРНК COVID-19 со структурой ядра-оболочки с благоприятным характером биораспределения и многообещающим иммунитетом. Трансдукт сигнала. Цель: Тер. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Ян Р.; Хуанг, Б.; А, Р.; Ли, В.; Ван, В.; Дэн, Ю.; Тан, В. Разработка и эффективность псевдотипированной системы SARS-CoV-2, определенная с помощью нейтрализующей эффективности и теста на ингибирование проникновения in vitro. Биосаф. Здоровье-2020, 2, 226–231. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

23. Цзя, К.; Билефельдт-Оманн, Х.; Мезон, РМ; Маслеша-Галич, С.; Купер, СК; Боуэн, РА; Хорвиц, MRA Реплицирующая бактериально-векторная вакцина, экспрессирующая мембранные и нуклеокапсидные белки SARS-CoV-2, защищает от тяжелого COVID-19-подобного заболевания у хомяков. Вакцины NPJ 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Хайник, Р.Л.; Планте, Дж.А.; Лян, Ю.; Аламе, М.-Г.; Тан, Дж.; Чжун, К.; Адам, А.; Шартон, Д.; Рафаэль, Г.Х.; Лю, Ю.; и другие. Комбинаторная вакцинация мРНК усиливает защиту от дельта-варианта SARS-CoV-2. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Антон, И.М.; Гонсалес, С.; Буллидо, MJ; Корсин, М.; Риско, К.; Лангевельд, JP; Энхуанес, Л. Сотрудничество между структурными белками коронавируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV) в индукции in vitro вирусспецифических антител. Вирус Рез. 1996, 46, 111–124. [Перекрестная ссылка]

26. Дешамбо, Ю.; Линч, Дж.; Уорнер, Б.; Тирни, К.; Хьюнь, Д.; Вендрамелли, Р.; Портной, Н.; Фрост, К.; Бут, С.; Саджеш, Б.; и другие. Однократная иммунизация рекомбинантными вирусами коровьей оспы ACAM2000, экспрессирующими белки шипа и нуклеокапсида, защищает хомяков от клинического заболевания, вызванного SARS-CoV-2-. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Пеналоса-МакМастер, П.; Класс, Дж.; Данги, Т.; Ричнер, Дж. М. Нуклеокапсидная вакцина против SARS CoV-2 защищает от дистального распространения вируса. биоРксив 2021.

28. Афхами, С.; Д'Агостино, MR; Чжан, А.; Стейси, HD; Марзок, А.; Канг, А.; Сингх, Р.; Баванантасивам, Дж.; Йе, Г.; Луо, X.; и другие. Доставка через слизистую оболочку дыхательных путей вакцины нового поколения от COVID-19 обеспечивает надежную защиту как от предковых, так и от вариантных штаммов SARS-CoV-2. Ячейка 2022, 185, 896–915.e19. [Перекрестная ссылка]

29. Чжэн, Н.; Ся, Р.; Ян, К.; Инь, Б.; Ли, Ю.; Дуань, К.; Лян, Л.; Го, Х.; Се, К. Повышенная экспрессия белка нуклеокапсида SARS-CoV в табаке и его иммуногенность у мышей. Вакцина 2009, 27, 5001–5007. [Перекрестная ссылка]

30. Ясуи, Ф.; Кай, К.; Китабатаке, М.; Иноуэ, С.; Йонеда, М.; Ёкочи, С.; Касе, Р.; Секигути, С.; Морита, К.; Хишима, Т.; и другие. Предварительная иммунизация нуклеокапсидным белком коронавируса (SARS-CoV), ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), вызывает тяжелую пневмонию у мышей, инфицированных SARS-CoV. Дж. Иммунол. 2008, 181, 6337–6348. [Перекрестная ссылка]

31. Деминг Д.; Шихан, Т.; Хейзе, М.; Йонт, Б.; Дэвис, Н.; Симс, А.; Сутар, М.; Харкема, Дж.; Уитмор, А.; Пиклз, Р.; и другие. Эффективность вакцины на стареющих мышах, зараженных рекомбинантным SARS-CoV, несущим эпидемические и зоонозные варианты. ПЛоС Мед. 2006, 3, е525. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

32. Весселинг, Дж.Г.; Годеке, Г.Дж.; Шейнс, В.Е.; Превец, Л.; Грэм, Ф.; Горзинек, MC; Роттиер, П.Дж. Шипы вируса гепатита мыши и белки нуклеокапсида, экспрессируемые аденовирусными векторами, защищают мышей от смертельной инфекции. Дж. Генерал Вирол. 1993, 74, 2061–2069. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

33. Ким, Т.В.; Ли, Дж. Х.; Хунг, КФ; Пэн, С.; Роден, Р.; Ван, MC; Вишиди, Р.; Цай, ЮК; Он, Л.; Чен, Пи Джей; и другие. Создание и характеристика ДНК-вакцин, нацеленных на белок нуклеокапсида коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома. Дж. Вирол. 2004, 78, 4638–4645. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

34. Ле Бер, Н.; Тан, АТ; Кунасегаран, К.; Тэм, CYL; Хафези, М.; Чиа, А.; Чнг, MHY; Лин, М.; Тан, Н.; Линстер, М.; и другие. Специфический Т-клеточный иммунитет к SARS-CoV-2-в случаях COVID-19 и SARS, а также у неинфицированных контрольных групп. Природа 2020, 584, 457–462. [Перекрестная ссылка]