Укороченный гликопротеин Е вируса ветряной оспы — идеальный иммуноген для разработки вакцины на основе Escherichia Coli

Вирус ветряной оспы (VZV) является высокоинфекционным агентом, вызывающим как ветряную оспу, так и опоясывающий герпес. Несмотря на высокую эффективность, остаются проблемы с безопасностью и доступностью лицензированных вакцин. Здесь мы стремились получить иммуноген VZV gE, используя систему экспрессии E. coli. Мы обнаружили, что экспрессия растворимого белка и выход белка gE можно повысить за счет усечения С-конца белка, тем самым облегчая надежный и масштабируемый процесс очистки для производства вакцин. Укороченный свинцом gE (31–358 а.к.), далее называемый tgE, представлял собой гомогенный мономер в растворе и проявлял превосходную антигенность. Наконец, мы оценили и сравнили иммуногенность tgE с коммерческой вакциной LAV на основе водки и вакциной Shingrix. Мы обнаружили, что tgE с адъювантом алюминия был иммуногенным по сравнению с водочным LAV. При адъюванте AS01B иммунизация двумя дозами tgE показала сравнимую или лучшую эффективность в отношении гуморальных реакций и клеточно-опосредованного иммунитета с таковыми вакцины Шингрикс в той же дозировке, особенно с точки зрения доли IFN- -, экспрессирующего CD4+ Т-клетки. В заключение, этот метод экспрессии tgE, опосредованной E. coli, предлагает экономически эффективную и масштабируемую стратегию создания идеального gE-иммуногена VZV для разработки вакцин против ветряной оспы и опоясывающего герпеса.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

вирус ветряной оспы, гликопротеин Е, кишечная палочка, вакцина

ВВЕДЕНИЕ

Вирус ветряной оспы (VZV) представляет собой патогенный альфа-герпесвирус человека, который вызывает две основные категории заболеваний: первичное инфицирование ветряной оспой, высококонтагиозное заболевание, характеризующееся волдырями на коже и легкими системными симптомами, такими как лихорадка и недомогание. преимущественно у детей; и опоясывающий герпес (HZ), скрытая реактивация вируса в ответ на ослабление клеточной иммунной системы, вызванное старением, которая вызывает болезненную локализованную везикулярную сыпь (HZ) с рядом других осложнений или без них (Cohen, 2013; Heininger and Seward, 2006; Зербони и др., 2014). Ветряную оспу и HZ можно предотвратить с помощью живых аттенуированных вирусных вакцин (LAV). Первый LAV для профилактики ветряной оспы был разработан Takahashi et al. (1974) на основе штамма вируса vOka и позже был лицензирован как Varivax для рутинного использования в США. За этим последовала разработка и лицензирование Зоставакса для профилактики ХЗ (Ценг и др., 2011). К сожалению, за 10 лет, прошедших с начала прививок Вариваксом, было подтверждено, что почти 1/3 случаев HZ связаны со штаммом vOka (Galea et al., 2008), что позволяет предположить, что vOka может заражать и устанавливать латентный период, как дикий дикий вирус. -типа вируса, а потом реактивировать, чтобы вызвать ХЗ. Кроме того, эффективность Зоставакса обратно пропорциональна возрасту пациента на момент введения, причем более высокий возраст связан с более низкой эффективностью (Oxman et al., 2005). Предыдущие исследования показали, что гликопротеин E (gE) VZV является наиболее распространенным вирусным гликопротеином на оболочке вириона и на поверхности инфицированных клеток. GE также является одним из наиболее важных защитных антигенов VZV, способных индуцировать клеточный и гуморальный иммунитет во время естественной инфекции ветряной оспы, а также после вакцинации vOka (Arvin, 1992; Oliver et al., 2016). Недавно рекомбинантная субъединичная вакцина HZ, Shingrix (HZ/su), была одобрена для профилактики HZ и связанной с ней постгерпетической невралгии (ПГН) у взрослых в возрасте старше 50 лет или равных (Shah et al., 2019; Syed, 2018). В клинических испытаниях Шингрикс вызывал эффективный, VZV-специфичный, клеточно-опосредованный иммунитет (CMI) с общей эффективностью вакцины 97,2% среди участников старше 50 лет и уровнем защиты 91,3% у участников больше или равным. до 70 лет. В совокупности эти результаты указывают на значительно сниженный риск HZ у вакцинированных лиц независимо от возраста и, следовательно, на более эффективный вариант вакцины по сравнению с ZOSTAVAX (Lal et al., 2015; Shah et al., 2019).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Shingrix создан на основе рекомбинантного антигена gE, экспрессируемого в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и адъювантной системы на основе липосом (AS01B), содержащей 3-одесацил-4'-монофосфориллипид A (MPL) и Quillaja saponaria. Молина, фракция 21 (QS21) (Dendouga et al., 2012). Однако рекомбинантные клетки CHO требуют длительного производственного цикла и связаны со сложным процессом очистки, что приводит к высокой стоимости производства и ограниченным поставкам. Таким образом, Shingrix не является идеальным решением для вакцинации для широкого использования, особенно в развивающихся странах (Kim et al., 2012). Микробные системы экспрессии обладают рядом преимуществ перед системами экспрессии млекопитающих, включая быстрый рост, простоту культивирования и более низкие производственные затраты (Overton, 2014), и поэтому широко используются при экспрессии и производстве многочисленных биофармацевтических препаратов (Adkins and Wagstaff, 1998; Monie и др., 2008; Ву и др., 2012). Однако для успешной экспрессии рекомбинантных эукариотических белков в прокариотических системах необходимо преодолеть ряд трудностей во время производства, таких как неправильная укладка и отсутствие посттрансляционной модификации (Singh and Panda, 2005). Несмотря на эти трудности, микробные системы экспрессии могут стать идеальной системой для широкого и экономически эффективного производства вакцин, и, следовательно, это требует исследования антигенов из системы экспрессии E. coli для разработки вакцин VZV. В предыдущей работе мы показали успешную экспрессию рекомбинантного белка gE (rgE) в клетках насекомых и получили очищенные белки для иммунизации мышей и продукции моноклональных антител (Liu et al., 2015). Основываясь на этой работе, мы исследуем, может ли белок gE экспрессироваться в E. coli. Мы исследовали неслитую растворимую экспрессию антигенов-кандидатов gE с усеченным на С-конце (далее называемым укороченным gE (tgE) или tgE) в E. coli и охарактеризовали очищенные белки tgE. Мы показываем, что очищенный tgE является антигенным, подобным нативному gE, и способен индуцировать высокие титры антител с vOka-нейтрализующей активностью у мышей. Сравнивая иммуногенность антигена tgE, полученного в нашем исследовании, с LAV и Shingrix, мы обнаружили, что наш антиген не только демонстрирует эффективный гуморальный ответ, но также индуцирует антиген-специфический CMI. В целом, наша стратегия E. coli по производству белка tgE может проложить путь к альтернативному промышленно производимому иммуногену как для вакцинации против ветряной оспы, так и для вакцинации против HZ.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия и очистка рекомбинантного tgE в E. coli

Последовательности ДНК, кодирующие внеклеточный домен VZV gE, были приготовлены в виде конструкций с различными N- или C-концевыми укорочениями и клонированы в вектор pTO-T7 для экспрессии белка в E. coli. Полноразмерный внеклеточный домен gE имел тенденцию образовывать тельца включения в E. coli во время экспрессии, и это можно улучшить с помощью усечения С-конца. Из различных укороченных белков наилучшая растворимость была достигнута при использовании конструкции gE (а.к. 31–358) (рис. 1А), называемой в дальнейшем усеченным gE или tgE. Кандидатный tgE был успешно экспрессирован в виде растворимого рекомбинантного белка и очищен из супернатанта бактериальных лизатов с помощью трехстадийной хроматографии в лабораторных условиях для дальнейшей оценки и разработки в качестве потенциальной вакцины. Для захвата использовали сильную анионообменную хроматографию с последующими этапами керамической гидроксиапатитной и гидрофобной хроматографии (рис. 1B). На последовательных этапах процесса очистки наблюдалось увеличение чистоты tgE на SDS-PAGE (рис. 1C). tgE мигрировал в виде полосы примерно 40 кДа и демонстрировал хорошую реактивность со специфическим антителом 1B11 (рис. 1D). Общий выход составил около 500 мкг очищенного tgE на грамм бактерий.

Характеристика укороченного gE

Для анализа гомогенности и коэффициентов седиментации очищенных белков использовали высокоэффективную эксклюзионную хроматографию (HPSEC) и аналитическое ультрацентрифугирование (AUC). В качестве контроля использовали белок rgE, очищенный из клеточной системы насекомых (Liu et al., 2015). При HPSEC tgE имел острый пик с преобладающим временем удерживания 16,1 мин (рис. 2А), что отражает высокую гомогенность очищенных белков tgE. В экспериментах AUC преобладающий пик седиментации наблюдался при ~ 2,3 S (рис. 2B), что соответствует ~ 39,4 кДа, что указывает на то, что tgE присутствует в растворе в виде мономера. Дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) использовали для проверки термической стабильности белка tgE путем мониторинга теплоемкости во время процесса термического разворачивания. Профили ДСК показали только один тепловой переход во время разворачивания белка при значении температуры перехода (Tm) 63,80 градуса для tgE, что сопоставимо с таковым для rgE (63,64 градуса) (рис. 2C). Чтобы исследовать конформационную целостность очищенных белков tgE, мы проанализировали антигенность tgE с помощью анализа ELISA, при этом очищенные белки rgE, экспрессированные в клетках насекомых, служили контролем. В тесте ELISA использовали девять mAb, которые могли распознавать конформационные эпитопы (mAb 1B11, 4G4, 14G1) или линейные эпитопы (4A2, 11B11, 11B12, 6H6, 10H6, 11E3) (рис. 3). Мы обнаружили схожие значения медианной эффективной концентрации (EC50, нг мл-1) для белков tgE и rgE для большинства антител, за исключением 1B11, который имел почти 10-кратную меньшую реактивность, что указывает на их схожую антигенность. Эти результаты позволяют предположить, что ключевые эпитопы rgE хорошо сохраняются в белке tgE.

Рисунок 1 (В цвете онлайн) Экспрессия и очистка белков. Схематическое изображение конструкции конструкции tgE. Клетки E. coli трансформировали рекомбинантными плазмидами, несущими усеченный ген gE (31–358 а.к.). Б. Схематическое изображение процесса очистки tgE. tgE очищали от лизированного супернатанта с помощью трехстадийной хроматографии. C: профиль tgE-PAGE в ДСН-ПААГ в процессе очистки. Молекулярная масса tgE составляет примерно 40 кДа. М: маркер молекулярной массы. Дорожка 1: супернатант, отделенный от клеточного лизата; дорожка 2: фракция, содержащая tgE, из хроматографа Q-FF; дорожка 3: фракция, содержащая tgE, из хроматографа CHT; дорожка 4: фракция из бутилового хроматографа, содержащая белок tgE высокой чистоты. D. Иммуноблоттинг очищенного tgE.

Анализ иммунных ответов, индуцированных tgE у мышей

Чтобы сравнить иммуногенность tgE с rgE, мы сформулировали белки с двумя адъювантами, обычно используемыми в исследовательской работе: адъювантом на основе алюминия Al-001 и адъювантом Фрейнда. Мышей иммунизировали трижды в недели 0, 2 и 4 дозой 1 мкг как для адъювантного tgE, так и для rgE. Титры gE-специфичных антител и ответы Т-клеток на 5-й неделе после первой иммунизации использовали для определения иммуногенности различных составов адъювантов. Мыши, иммунизированные вакциной tgE, составленной с Al-001, продемонстрировали сходные профили антител с мышами в группе rgE, а адъювант Фрейнда показал лучший эффект стимуляции при приготовлении с tgE, чем с rgE (рис. 4А). Титры нейтрализации не показали различий у мышей, иммунизированных вакциной tgE или rgE, с титром нейтрализации ~103 для tgE, приготовленного с различными адъювантами (рис. 4B). Однако при анализе CD4+ Т-клеток из спленоцитов методом внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) вакцины как tgE, так и rgE вызывали сходные уровни gE-специфического IFN- по сравнению с группой, получавшей физиологический раствор (рис. 4C, ~{ {22}}.1% для групп вакцин или группы физиологического раствора) и лишь умеренная симуляция gE-специфического IL{{20}} (рис. 4D, ~0,2% для групп вакцин против ~0,1 % для солевой группы). В совокупности эти результаты показывают, что tgE/Al-001 и адъювант tgE/Фройнда вызывают gE-специфические иммунные ответы, сравнимые с ответами, вызываемыми rgE, с особенно сильным гуморальным ответом.

Оценка кандидатной вакцины против ветряной оспы tgE по сравнению с LAV

Затем мы оценили выработку антител и устойчивость белков tgE с адъювантом алюминия у мышей BALB/c. Две группы мышей (n=5 в каждой группе) были иммунизированы трижды в недели 0, 2 и 4 разными дозами 0,5 мкг и 5 мкг tgE/Al{{ 8}} (рис. 5А и Б). Профили ответа антител показали, что первичная инокуляция белка tgE вызывала высокие титры антител с устойчивым увеличением после двух повторных иммунизаций на 2-й и 4-й неделе и достижением максимального уровня на 6-й неделе, а затем медленно снижалось до более чем 1{{ 20}}4 за период мониторинга. В разных группах дозирования наблюдались сходные профили титров антител в течение периода наблюдения, с одинаковыми высокими нейтрализующими титрами на 6 неделе. Иммуногенность tgE оценивали и сравнивали с водкой. Половинную эффективную дозу (ED50) у мышей использовали в качестве меры сероконверсии, причем более низкая ED50 указывает на лучшую иммуногенность. Мышей Balb/c разделяли на группы и внутрибрюшинно иммунизировали tgE с адъювантом алюминия (1, 0.5, 0.25, {{50}.125, {{ 54}}.0625, или 0.03125 мкг; н{{30}}) или вакцина вОка (1,000, 500, 250, 125 или 62,5 БОЕ; n=6) в серийных разведениях. Сыворотку собирали через 4 недели и тестировали с помощью ELISA. Сероконверсию анализировали по методу Рида и Мюнха (рис. 5C). В возрастных группах у мышей показатели сероконверсии составляли 83%, 100%, 100%, 100%, 50% и 17% для доз 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 и 0,03125 мкг соответственно. В группах, употреблявших водку, у мышей были более низкие показатели сероконверсии: 67%, 50%, 33%, 17% и 0% для 1, 000, 500, 250, 125 или 62,5 дозировок БОЕ соответственно. Значения ED50 составляли 0,063 мкг для tgE и 449,425 БОЕ для vOka, что указывает на то, что иммуногенность tgE при более низкой дозе 0,3 мкг была эквивалентна иммуногенности, достигаемой при использовании однократной дозы вакцины против ветряной оспы, содержащей vOka (обычно более 2,{{78} } БОЕ на дозу).

Рисунок 2. Характеристика белков tgE и rgE. А, профили HPSEC очищенного tgE. Указано время удерживания gE. B. Анализ скорости седиментации очищенного белка tgE. Коэффициент седиментации и молекулярную массу tgE определяли методами c(s) и c(M) независимо. На (А) и (Б) tgE показан черным, а красный – синим. C: Профили дифференциальной сканирующей калориметрии очищенных белков tgE и rgE.

Рисунок 3. Реактивность tgE и rgE с моноклональными антителами. mAb серийно разводили и реагировали с покрытыми белками tgE или rgE в анализе ELISA. Реакции детектировали с использованием антимышиных антител, меченных HRP. Двойные лунки измеряли на одном и том же планшете для каждого разведения. Значения EC50 рассчитывали путем аппроксимации сигмовидного тренда с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Рисунок 4. Иммуногенность tgE и rgE, проверенная на мышах BALB/c через 1 неделю после иммунизации тремя дозами. А. Производство антител у мышей к tgE и rgE, составленным с различными адъювантами. B. Титры нейтрализующих антител у мышей к tgE и rgE, приготовленным с различными адъювантами. C и D. Оценка gE-специфических ответов IFN- и IL-2, индуцированных вакцинами tgE или rgE.

Рисунок 5. Испытания иммуногенности вакцины tgE, содержащей алюминий, на мышах BALB/c. A и B, Персистенция антител и реакция нейтрализующих антител tgE/Al-001. Титры контролировали в течение 16 недель. C, ED50 у мышей для tgE, содержащего алюминий, и водки.

Оценка кандидатной вакцины tgE Zoster по сравнению с Shingrix

Чтобы сравнить иммуногенность нашей вакцины tgE с вакциной Shingrix, лиофилизированный белок tgE был составлен с адъювантом Shingrix, AS01B. Мышей C57BL/6 иммунизировали двумя дозами tgE/AS01B или Shingrix внутримышечно в большеберцовую мышцу на неделе 0 и 4. Уровни антител после первой иммунизации свидетельствовали о том, что иммунизации Shingrix было достаточно для индукции высоких уровней антител против gE, значительно выше, чем у tgE/AS01B; однако после второй иммунизации не было значительной разницы в выработке антител между двумя группами (рис. 6А). Что касается уровней нейтрализующих антител, иммунизация одной дозой tgE/AS01B привела к выработке незначительных количеств нейтрализующих антител, что значительно ниже, чем у Shingrix. Однако, опять же, после повторной иммунизации мы не смогли увидеть существенной разницы в выработке нейтрализующих антител между двумя группами (рис. 6B). Чтобы проверить, как иммунизация влияет на CMI, уровни gE-специфического IFN- и IL-2 определяли после первой и второй иммунизации с использованием точечного иммуноферментного анализа (ELISPOT) и окрашивания внутриклеточных цитокинов. Иммунизация tgE/AS01B вызывала слабый гуморальный иммунный ответ по сравнению с однократной дозой Шингрикса, но демонстрировала сопоставимую эффективность с точки зрения индукции IFN- - и IL-2-продуцирующих спленоциты (рис. 6C). Действительно, после второй иммунизации в группе tgE/AS01B было обнаружено значительное количество gE-специфичных клеток, продуцирующих цитокины, по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор, которые также были сопоставимы или лучше, чем в группе Shingrix (рис. 6D). ). Аналогичные результаты наблюдались при анализе проточной цитометрии, при этом наблюдались аналогичные пропорции IFN- -экспрессирующих CD4+ Т-клеток (рис. 6E), IL-2-экспрессирующих CD4+ T клетки (рис. 6F) и T-клетки IFN- -CD8+ (рис. 6G) между мышами, иммунизированными tgE/AS01B и Shingrix, независимо от однократной иммунизации или иммунизации бустерной дозой. Эти результаты показывают, что белок tgE, полученный из бактериальной системы экспрессии, может индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ при приготовлении с соответствующими адъювантами и, таким образом, может рассматриваться в качестве антигена-кандидата для создания вакцины против VZV.

Рисунок 6. Иммуногенность tgE у мышей C57BL/6. Вводили дозы 5 мкг tgE, приготовленные с 50 мкл адъюванта AS01B. Это была 1/10 дозы вакцины Шингрикс. Иммунизацию проводили на 0-й и 4-й неделе. А. Сравнение продукции антител, индуцированной вакциной tgE/AS01B, по сравнению с вакциной Шингрикс. Титры сыворотки определяли методом ELISA с использованием планшетов, покрытых rgE. B. Сравнение реакции нейтрализующих антител на vOka после вакцинации вакциной tgE/AS01B или Shingrix. Титры нейтрализации антисыворотки на неделе 2 (левая панель) и неделе 6 (правая панель) выражаются как величина, обратная разведению сыворотки, приводящему к 50% ингибированию. C. Оценка gE-специфических ответов IFN- и IL-2, индуцированных вакциной tgE/AS01B или Shingrix на 2 неделе. Количество спленоцитов, продуцирующих IFN- - и IL-2-, рассчитывали по Анализ ELISPOT после рестимуляции пулом пептидов gE. D. Оценка gE-специфических ответов IFN- и IL-2, индуцированных вакциной tgE/AS01B или Shingrix на 8-й неделе. Количество спленоцитов, продуцирующих IFN- - и IL-2-, рассчитывали по Анализ ELISPOT после рестимуляции пулом пептидов gE. E–G: анализы проточной цитометрии для клеток CD4+ и CD8+, экспрессирующих gE-специфические цитокины. Доля IFN- -продуцирующих CD4+ Т-клеток, IL-2-продуцирующих CD4+ Т-клеток и IFN- -продуцирующих CD8+ Т-клеток клеток среди спленоцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ

VZV gE является основной мишенью гуморального и клеточного иммунного ответа во время естественной инфекции ветряной оспы и после вакцинации VZV Oka. Шингрикс (GSK) представляет собой рекомбинантную субъединичную вакцину, содержащую gE VZV, экспрессируемый в клетках CHO, и адъювант AS01B на основе липосом. Другая работа была направлена ​​на исследование субъединичных вакцин против HZ с использованием белков gE, полученных из CHO или клеток насекомых, составленных с новыми адъювантами (Cao et al., 2021; Lee et al., 2020; Luan et al., 2022a, Luan et al., 2022b; Wang et al., 2021; Wui et al., 2019; Wui et al., 2021). Здесь мы исследовали и показали, что белок gE можно растворимо экспрессировать и очистить из E. coli, а затем сформулировать в качестве кандидата на субъединичную вакцину с соответствующим адъювантом, чтобы вызвать не только устойчивый нейтрализующий титр, но и сильный ответ CMI.

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

E. coli как система экспрессии обладает рядом преимуществ: высокая скорость роста клеток, недорогие условия культивирования, а также эффективный и универсальный инструмент для производства рекомбинантных белков. Исследования антигенов, связанных с вирусом герпеса, имели несколько успехов с использованием системы экспрессии на основе E. coli. Нейтрализующий линейный эпитоп gE (121–135 а.к.) был слит с 149 а.к. ядра белка вируса гепатита В (HBc) для получения химерных VLP, которые могли бы индуцировать VZV-специфические нейтрализующие антитела у мышей (Zhu et al., 2016). В другом исследовании гомологичный белок gE из вируса ветряной оспы обезьян (SVV) был экспрессирован в E. coli с использованием слитой метки GST для создания антисыворотки к gE (Gray et al., 2001). На данный момент не было сообщений о белке VZV gE без слитой метки, выделенном из E. coli, в качестве кандидата на вакцину.

gE состоит из трех областей: гидрофильного эктодомена 544-аа с сигнальным пептидом (1–30 аминокислот), гидрофобной трансмембранной области 17-аа и цитоплазматической хвостовой области 62-аа. Мы исследовали несколько молекул-кандидатов с различными укороченными участками в N- или C-концевых областях эктодомена gE и обнаружили, что экзогенная экспрессия этих белков в E. coli была лучше всего с использованием усеченной части (данные не показаны). Интактный эктодомен gE без слитой метки имеет тенденцию образовывать тельца включения при экспрессии E. coli, и его трудно очистить. Среди протестированных кандидатов на усечение белок gE (31–358 а.к.) продемонстрировал высокую растворимую экспрессию с минимальными трудностями в его очистке, а также высокую чистоту и высокую гомогенность (рис. 1). Таким образом, эта усеченная конструкция рассматривалась как идеальная вакцина-кандидат. антиген. Эта стратегия усечения могла потенциально повлиять на свойства белка, особенно на его антигенность. Ранее мы экспрессировали рекомбинантный gE в клетках насекомых и очистили эту конструкцию для иммунизации мышей BALB/c, получив моноклональные антитела 70 gE для анализа эпитопов (Liu et al., 2015). В ходе нашего анализа мы определили аминокислоты 1–194 как иммунодоминантную область (данные не показаны). Аналогичные результаты были получены в других местах: gE-специфические моноклональные антитела указывали на области 109–123 и 160–316, которые являются областями, ответственными за стабильное связывание антител среди вариантов изолятов (Vafai, 1994). В другом исследовании с использованием рекомбинантных гибридных фрагментов gE-VLP авторы идентифицировали остатки 1–134 как наиболее антигенную область белка gE и показали, что С-конец gE (остатки 303–623), содержащий несколько остатков цистеина, не способен образовывать частицы. у дрожжей (Fowler et al., 1995), предполагая, что гетерологичная экспрессия gE должна учитывать не только антигенность, но и простоту экспрессии. Здесь мы оптимизировали длину белка gE для его эффективной растворимой экспрессии с минимальным снижением антигенности. tgE показал аналогичную реактивность с большинством антител на рисунке 3, как и rgE, продуцируемый в клетках насекомых, что позволяет предположить, что ключевые эпитопы хорошо сохраняются в белке tgE, очищенном из E. coli. Однако одно исследование показало, что иммунодоминантные эпитопы CD4+ Т-клеток, распознаваемые донорами вакцины Shingrix, были рассеяны по всему белку gE (Voic et al., 2020). Иммуногенность tgE в нашем исследовании была идентична обнаруженной для gE, полученного из клеток CHO в Shingrix, когда антиген комбинировался с адъювантом AS01B, со столь же эффективными гуморальными ответами и ответами CMI, как показано на рисунке 5. Эти результаты показали, что усеченный gE полученный из прокариотической системы, по антигенности не уступал интактному эктодомену gE из эукариотической системы.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Существуют значительные различия между белками gE, полученными из разных систем экспрессии. Наиболее заметные различия отмечаются при посттрансляционных модификациях, особенно при гликозилировании. О-связанные гликаны мембранных гликопротеинов имеют значение с точки зрения распознавания эпитопов вирусных гликопептидов Т-клетками и антителами, и это распознавание имеет потенциально большое биомедицинское значение в наших попытках обеспечить иммунную защиту от вирусов с использованием субъединичных вакцин. Удаление гликанов в gE, продуцируемых клетками CHO-K1, привело к снижению реактивности на 17% с VZV-положительными сыворотками. Напротив, О-гликозилирование может мешать иммунореактивности эпитопов В-клеток: некоторые важные эпитопы блокируются дополнительными О-связанными гликанами (Nordén et al., 2019). В нашем исследовании tgE, полученный из E. coli, по-видимому, ведет себя так же, как и rgE, полученный из клеток насекомых, с точки зрения его иммунореактивности и иммуногенности, что позволяет предположить, что «голый» белок tgE перспективен в качестве кандидата на вакцину. Вакцины с tgE в качестве антигена, вероятно, индуцируют не только высокие титры IgG, что указывает на их потенциал в качестве субъединичной вакцины против ветряной оспы без потенциального риска латентного периода вируса, но также и высокий CMI, что указывает на их потенциал в качестве вакцины против опоясывающего герпеса. В целом, антиген gE, полученный из бактериальной системы экспрессии в этом исследовании, предлагает гораздо более экономичную стратегию разработки вакцин VZV.

Рекомендации

Адкинс Дж. К. и Вагстафф А. Дж. (1998). Рекомбинантная вакцина против гепатита В: обзор ее иммуногенности и защитной эффективности против гепатита В. Биопрепараты 10, 137–158.

Арвин, AM (1992). Клеточно-опосредованный иммунитет к вирусу ветряной оспы. J Infect Dis 166, S35–S41.

Цао Х., Ван Ю., Луан Н. и Лю К. (2021). Иммуногенность гликопротеина Е вируса ветряной оспы, содержащего липидные наночастицы и нуклеиновые иммуностимуляторы, у мышей. Вакцины 9, 310.

Чен Л., Лю Дж., Ван В., Е Дж., Вэнь Л., Чжао Ц., Чжу Х., Ченг Т. и Ся Н. (2014). Разработка метода нейтрализации вируса ветряной оспы с использованием точечного иммуноферментного анализа с антителами к гликопротеину К. J Virol Methods 200, 10–14.

Коэн, Дж.И. (2013). Клиническая практика: опоясывающий герпес. N Engl J Med 369, 255–263. Дендуга Н., Фочесато М., Локман Л., Моссман С. и Джаннини С.Л. (2012). Клеточные иммунные ответы на вакцину гликопротеина Е вируса ветряной оспы с использованием как агониста TLR, так и QS21 у мышей. Вакцина 30, 3126–3135.

Фаулер, В.Дж., Гарсия-Валькарсель, М., Хилл-Перкинс, М.С., Мерфи, Г., Харпер, Д.Р., Джеффрис, Д.Д., Бернс, Н.Р., Адамс, С.Е., Кингсман, А.Дж. и Лейтон, Г.Т. (1995). Идентификация иммунодоминантных областей и линейных В-клеточных эпитопов белка оболочки gE вируса ветряной оспы. Вирусология 214, 531–540.

Галеа С.А., Суит А., Бенингер П., Стейнберг С.П., ЛаРусса П.С., Гершон А.А. и Шаррар Р.Г. (2008). Профиль безопасности вакцины против ветряной оспы: обзор 10-года. J Infect Dis 197, S165–S169.

Грей, В.Л., Муллис, Л.Б. и Сойке, К.Ф. (2001). Экспрессия гликопротеина E вируса ветряной оспы обезьян. Virus Res 79, 27–37.

Хайнингер У. и Сьюард Дж. Ф. (2006). Варицелла. Ланцет 368, 1365–1376.

Ким, JY, Ким, YG и Ли, GM (2012). Клетки СНО в биотехнологии для получения рекомбинантных белков: современное состояние и дальнейший потенциал. Appl Microbiol Biotechnol 93, 917–930.

Лал, Х., Каннингем, А.Л., Годо, О., Члибек, Р., Диес-Доминго, Дж., Хван, С.Дж., Левин, М.Дж., МакЭлхани, Дж.Э., Подер, А., Пуч-Барбера, Дж., и другие. (2015). Эффективность адъювантной субъединичной вакцины против опоясывающего герпеса у пожилых людей. N Engl J Med 372, 2087–2096.

Ли, SJ, Пак, HJ, Ко, HL, Ли, JE, Ли, HJ, Ким, Х. и Нам, JH (2020). Оценка субъединицы гликопротеина Е и живых аттенуированных вакцин против вируса ветряной оспы, составленных с адъювантом на основе одноцепочечной РНК. Immun Inflamm Dis 8, 216–227.

Лю, Дж., Чжу, Р., Е, Х., Ян, Л., Ван, Ю., Хуан, Ю., Ву, Дж., Ван, В., Е, Дж., Ли, Ю., и другие. (2015). Количественный анализ гликопротеина E VZV на основе моноклональных антител и его применение для количественного определения антигена в вакцине VZV. Appl Microbiol Biotechnol 99, 4845–4853.

Луан Н., Цао Х., Ван Ю., Линь К. и Лю К. (2022a). Ионизируемые липидные наночастицы усиливали синергический адъювантный эффект CpG ODN и QS21 в субъединичной вакцине с гликопротеином E вируса ветряной оспы. Фармацевтика 14, 973.

Луан Н., Цао Х., Ван Ю., Линь К. и Лю К. (2022b). Гликопротеин E вируса ветряной оспы, адъювантный LNP-CpG ODN, индуцировал сравнимые уровни иммунитета с Shingrix™ у мышей, которым вводили VZV. Вирол Син 37, 731–739.

Мони А., Хунг К.Ф., Роден Р. и Ву Т.С. (2008). Церварикс: вакцина для профилактики ВПЧ 16, 18-ассоциированного рака шейки матки. Биологические препараты 2, 97–105.

Норден Р., Нильссон Дж., Самуэльссон Э., Райзингер К., Сильбом К., Бликст О., Ларсон Г., Олофссон С. и Бергстрем Т. (2019). Рекомбинантный гликопротеин Е вируса ветряной оспы содержит гликан-пептидные мотивы, которые модулируют эпитопы В-клеток в дискретные иммунологические признаки. Int J Mol Sci 20, 954.

Оливер С.Л., Ян Э. и Арвин А.М. (2016). Гликопротеины вируса ветряной оспы: проникновение, репликация и патогенез. Curr Clin Microbiol Rep 3, 204–215.

Овертон, ТВ (2014). Продукция рекомбинантного белка у бактериальных хозяев. Drug Discov Today 19, 590–601.

Оксман, М.Н., Левин, М.Дж., Джонсон, Г.Р., Шмадер, К.Е., Штраус, С.Е., Гелб, Л.Д., Арбайт, Р.Д., Симберкофф, М.С., Гершон, А.А., Дэвис, Л.Е. и др. (2005). Вакцина для профилактики опоясывающего герпеса и постгерпетической невралгии у пожилых людей. N Engl J Med 352, 2271–2284.

Шах, Р.А., Лиммер, А.Л., Нваннуну, К.Э., Патель, Р.Р., Муи, ООН, и Тайринг, СК (2019). Шингрикс от опоясывающего герпеса: обзор. Письмо о кожной терапии 24, 5–7. Сингх С.М. и Панда А.К. (2005). Солюбилизация и рефолдинг белков телец бактериальных включений. J Biosci Bioeng 99, 303–310.

Сайед, ГГ (2018). Рекомбинантная вакцина против опоясывающего герпеса (Шингрикс®): обзор опоясывающего герпеса. Наркотики Старение 35 лет, 1031–1040.

Такахаси М., Оцука Т., Окуно Ю., Асано Ю., Язаки Т. и Исомура С. (1974). Живая вакцина используется для предотвращения распространения ветряной оспы у детей в больницах. Ланцет 304, 1288–1290.

Ценг Х.Ф., Смит Н., Харпас Р., Бялек С.Р., Сай Л.С. и Якобсен С.Дж. (2011). Вакцина против опоясывающего герпеса у пожилых людей и риск последующего заболевания опоясывающим герпесом. ЖАМА 305, 160–166.

Вафаи, А. (1994). Сайты связывания антител на укороченных формах гликопротеина gpI(gE) вируса ветряной оспы. Вакцина 12, 1265–1269.

Войк, Х., де Врис, Р.Д., Сидни, Дж., Рубиро, П., Мур, Э., Филлипс, Э., Маллал, С., Шван, Б., Вайскопф, Д., Сетте, А., и другие. (2020). Идентификация и характеристика эпитопов CD4+ Т-клеток после вакцинации Шингрикс. Дж Вирол 94, е01641-20.

Ван Ю., Ци Дж., Цао Х. и Лю К. (2021). Иммунные реакции на гликопротеин E вируса ветряной оспы, содержащий наночастицы поли(молочно-когликолевой кислоты) и адъюванты нуклеиновых кислот у мышей. Вирол Син 36, 122–132.

Ву Т., Ли С.В., Чжан Дж., Нг М.Х., Ся Н.С. и Чжао К. (2012). Разработка вакцины против гепатита Е: 14-летняя одиссея. Hum Vaccin Immunother 8, 823–827.

Вуи, С.Р., Ким, К.С., Рю, Дзи, Ко, А., До, ХТТ, Ли, Ю.Дж., Ким, Х.Дж., Лим, С.Дж., Пак, С.А., Чо, Ю.Дж. и др. (2019). Эффективная индукция клеточного иммунитета к гликопротеину Е вируса ветряной оспы, лиофилизированному адъювантом на основе катионных липосом, у мышей. Вакцина 37, 2131–2141.

Вуи, С.Р., Ко, А., Рю, Джи, Сим, Э., Лим, С.Дж., Парк, С.А., Ким, К.С., Ким, Х., Юн, Х. и Ли, Н.Г. (2021). Влияние агониста TLR4/катионного липосомального адъюванта на эффективность вакцины с гликопротеином Е вируса ветряной оспы: презентация антигена, захват и доставка в лимфатические узлы. Фармацевтика 13, 390.

Зербони Л., Сен Н., Оливер С.Л. и Арвин А.М. (2014). Молекулярные механизмы патогенеза вируса ветряной оспы. Nat Rev Microbiol 12, 197–210.

Чжу Р., Лю Дж., Чен К., Е, X., Сюй Л., Ван В., Чжао Ц., Чжу Х., Ченг Т. и Ся Н. (2016). Высококонсервативный эпитоп-кандидат вакцины против вируса ветряной оспы индуцирует нейтрализующие антитела у мышей. Вакцина 34, 1589–1596 гг.