Аннотациядействовать

Фон: все больше исследований сообщают о терапевтическом эффекте экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которыми характеризуются белок и микроРНК. Однако протеомика и профили miRNA экзосом, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) и индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), остаются неясными.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе способны усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение анионов свободных радикалов тимина.

Нажмите на антивозрастной порошок Cistanche Bulk

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Методы: В этом исследовании мы выделили экзосомы из hESC, hiPSC и мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUC-MSC) с помощью классического ультрацентрифугирования и фильтра 0.22- мкм с последующей консервативной идентификацией. Тандемное массовое мечение и количественная оценка относительных пептидов без метки вместе определили их протеомику. Для определения профилей микроРНК было выполнено высокопроизводительное секвенирование. Затем мы провели биоинформатический анализ, чтобы определить доминирующие биологические процессы и пути, модулируемые экзосомными грузами. Наконец, вестерн-блоттинг и RT-qPCR были выполнены для определения фактических нагрузок белков и микроРНК в трех типах экзосом.

Полученные результаты: Согласно нашему исследованию, грузы трех типов экзосом способствуют сложным биологическим процессам. Для сравнения, экзосомы hESC (hESC-Exos) превосходили в регуляции развития, метаболизма и замедления старения, а экзосомы hiPSC (hiPSC-Exos) имели те же биологические функции, что и hESC-Exos, тогда как экзосомы hUC-MSC (hUC-MSC-Exos) больше способствовали иммунной регуляции.

Выводы: данные, представленные в нашем исследовании, помогают определить ландшафты белков и микроРНК трех экзосом, предсказать их биологические функции с помощью систематического и всестороннего сетевого анализа на системном уровне и выявить их соответствующие потенциальные применения в различных областях для оптимизации отбора экзосом в доклинических и клинических исследованиях. испытания.

Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки человека, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека, экзосомы, протеомика, микроРНК

Введение

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой активно секретируемые клетками крошечные везикулы, в основном содержащие экзосомы, микровезикулы (МВ) и апоптотические тельца [40, 56, 57]. Они широко распространены во многих жидкостях организма, таких как слюна, грудное молоко, кровь, спинномозговая жидкость, желчь и моча [57]. Среди них экзосомы имеют липидный бислой диаметром 40–200 нм, плавучую плотность 1,13–1,18 г/мл в градиенте сахарозы и чашеобразный вид под электронным микроскопом [21, 53]. Различные биологически активные соединения, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды, обеспечивают межклеточную коммуникационную функцию экзосом между клетками [16, 17]. Липидный бислой представляет собой тонкий барьер, защищающий содержимое экзосом от ферментативной дегенерации жидкости организма [49]. Стабильные экзосомы могут опосредовать сложные физиологические и патологические процессы посредством паракринной активности, включая развитие органов и репродуктивных органов, презентацию антигенов, нейронную коммуникацию, иммунный ответ, регуляцию старения и пролиферацию клеток [57, 62].

Формирование и высвобождение экзосом — полностью регулируемый процесс, а сортировка инкапсулированного в экзосомы содержимого происходит за счет мобилизации различных белков [22, 47]. Множественные белки имеют решающее значение для образования экзосом, которые содержат комплекс эндосомальной сортировки, необходимый для транспорта (ESCRT), тетраспанины (CD9, CD63 и CD81), белок X, взаимодействующий с геном апоптоза 2- (Alix), и предрасположенность к опухолям. ген 101 (TSG101) [38, 55]. Внутриклеточный перенос экзосом управляется коллективной активностью ряда белков, включая молекулярные переключатели RAB GTPases и белки цитоскелета, такие как актин и тубулин [24]. Впоследствии секреция экзосом дополняется комплексом SNARE и семейством синаптотагминов [22]. Исследования показали, что отпочкование и отторжение экзосом зависит от активности кальция и рекрутирования ESCRT [15]. В качестве мессенджера высвобождение экзосомы участвует в клеточных перекрестных помехах в ответ на клеточную физиологию и патологические изменения, такие как активация, изменение pH, гипоксия, радиационное повреждение или клеточный стресс [61].

Для выявления компонентов экзосом и их возможных физиологических и патологических функций часто используют протеомные, транскриптомные и другие методы исследования экзосомных РНК и белков разных видов, тканей и клеток [44]. Протеомный анализ экзосом обычно включает три этапа: выделение, очистку и характеристику экзосом, идентификацию белковых компонентов с помощью масс-спектрометрии и анализ исходных данных [14]. Клеточное состояние существенно влияет на белковый состав и обилие экзосом. В настоящее время количественные протеомные методы анализа характеристик и количества белков используются для выяснения механизма, лежащего в основе продукции экзосом, и углубления нашего понимания физиологической и патологической роли экзосом в клетках [39]. Среди них широко используются технологии количественной протеомики на основе масс-спектрометрии, в основном безметочные и меченые стабильными изотопами методы [13, 42]. микроРНК представляют собой небольшие биологически активные молекулы, тесно связанные с различными видами жизнедеятельности. Метод высокопроизводительного секвенирования характеризуется высокой чувствительностью и точностью и имеет широкое применение при секвенировании микроРНК (18–30 н.) [6]. Учитывая развитие современных технологий, нет препятствий для анализа профилей белков и микроРНК экзосом.

hESCs и hiPSCs обладают высоким потенциалом дифференцировки [36]. Однако их прямое применение в лечении ограничено из-за риска малигнизации и этических проблем [31]. Напротив, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) имеют более широкое применение для вмешательства при множественных заболеваниях в клинических условиях [8]. Однако их прямое использование по-прежнему сталкивается с рядом ограничений, включая низкую выживаемость, иммунологическое отторжение и проблемы безопасности [8, 43]. В настоящее время большое внимание уделяется экзосомам из-за их биобезопасности, стабильности, неанеуплоидности и низкой иммуногенности [51]. Предыдущие исследования задокументировали сравнение компонентов МСК, происходящих из разных тканей, и их экзосом, содержащих протеомные профили и профили микроРНК [59]. Гонг и др. также изобразили регуляторную сеть внеклеточных везикул (EVs) hESC с точки зрения протеома, но только в путях, связанных со старением, не фокусируясь на других [19]. Квеста и др. составили протеомный атлас EV hiPSCs, полученных из фибробластов крайней плоти человека (HFFs) [45]. Хотя в этих исследованиях частично сообщалось о белковых компонентах EV, они не были сосредоточены исключительно на экзосомах, и их всесторонний протеомный анализ четко не сформулирован. В частности, профили miRNA еще не описаны. Чтобы решить эту проблему, экзосомы, выделенные из hESC, hiPSCs и hUC-MSC, были выбраны в настоящем исследовании для дальнейшего изучения их профилей протеома и микроРНК, чтобы получить новые идеи для их исследований и клинического применения.

Методы

Подготовка и характеристика экзосом

hESC и hiPSC культивировали в среде ncTarget (кат. № RP01020; Nuwacell. Ltd, Китай), тогда как hUC-MSC 3-го поколения культивировали в бессывороточной миссионерской среде hMSC (кат. № RP02010; Nuwacell. Ltd, Китай). Затем для очистки экзосом собирали 350 мл супернатанта клеток в логарифмической фазе роста (~80% слияния). Экзосомы экстрагировали серией известных центрифугирования и ультрацентрифугирования, как описано ранее [34, 52]. Вкратце, кондиционированные среды (CM) собирали и подвергали центрифугированию в градиенте (300×g в течение 10 мин, 2000×g в течение 15 мин, 10, 000×g в течение 30 мин) для разделения клеточный мусор. Экзосомы осаждали из собранных супернатантов при 100 000×g в течение 70 мин с использованием ротора Ti45 (Beckman Coulter, США). Затем их ресуспендировали в PBS для следующей фильтрации с использованием мембранного фильтра MF-Millipore™ 0,22- мкм (Sigma, США). Фильтрат подвергали ультрацентрифугированию при 100 000×g в течение 70 мин. Конечный осадок экзосомы ресуспендировали в PBS для следующего анализа. Для измерения концентрации и размера выделенных экзосом использовали систему динамического светорассеяния (DLS) (Wyatt Technology, США).

Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ)

Для описания морфологии изолированных экзосом выполняли сканирование ПЭМ, как описано ранее. Ресуспендированные экзосомы (1 мкг в 10 мкл PBS) высаживали на покрытую углеродом медную сетку (сетка 200-) и оставляли адсорбироваться на ней в течение 2 минут с последующими двумя промываниями бидистиллированной водой. Затем сетки негативно окрашивали 8 мкл 2%-го раствора уранилацетата в течение 1 мин. После естественной сушки образцы исследовали на установке Tecnai Spirit (Thermo Fisher, США) при напряжении 120 кВ.

Динамическое рассеяние света

Распределение экзосом по размерам описывали с помощью анализа отслеживания наночастиц с использованием динамического светового рефлектометра (Wyatt Technology, США) в соответствии с инструкциями производителя (271-DPN), как сообщалось ранее [23]. Вкратце, осадок экзосомы ресуспендировали в 100 мкл PBS. Десять, 50 мкл вышеуказанных экзосом добавляли к 1450 мкл PBS и встряхивали в течение 30 с. Экзосомы (1,5 мл) переносили в одноразовую кювету для уравновешивания при 25 градусах в течение 30 с. Значение показателя преломления диспергатора составляло 1,37, а как Z-среднее, так и полидисперсность (PDI) определяли размер частиц экзосом. Для каждого образца были проведены независимые от дерева измерения.

Мечение тандемной масс-меткой (TMT) и анализ относительного количества пептидов без метки (LFQ)

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 и П<0.05) and label-free (at least two tests results>0 и П<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), а также статистическая значимость (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

анализ профиля микроРНК

Суммарную РНК выделяли из изолированных экзосом с помощью набора для выделения микроРНК mirVana™ (каталожный номер AM1560; Thermo Fisher, США). Образцы РНК были подвергнуты проверке качества для анализа микрочипов микроРНК, выполненного LC-Bio Technology Co., Ltd. Анализ необработанных данных был выполнен, как сообщалось ранее [9]. Дифференциально экспрессируемые миРНК были выбраны в качестве кандидата миРНК при значении p.<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) и максимальная свободная энергия<−10 (miRanda).

Биоинформатический анализ

Необработанные данные были подвергнуты анализу с использованием пакета программного обеспечения Maxquant (v1.6.0), а данные Swiss-Prot_человека были установлены в качестве эталона (20 600 белков) (идентификатор протеома: UP000005640). . Идентифицированные белки были картированы в Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) на основе терминов анализа KOBAS [60] для определения их биологических и функциональных свойств. Программное обеспечение Cytoscape и пакет igraph в программном обеспечении R (версия 3.6.1) использовали для рисования переплетенной сети белков экзосом или микроРНК между сигнальными путями.

статистический анализ

Все опыты проводились в трехкратной повторности. Количественная повторяемость белков и микроРНК была повышена с помощью анализа основных компонентов (PCA), относительного стандартного отклонения и коэффициента корреляции Пирсона. Результаты анализировали с использованием непарного критерия Стьюдента. Данные выражены как средняя стандартная ошибка среднего (SEM). P-значения считались статистически значимыми при *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Полученные результаты

Выделение и идентификация экзосом

Культивирование и идентификация трех плюрипотентных стволовых клеток человека описаны в дополнительном файле 1. Экзосомы были выделены из кондиционированных сред трех типов стволовых клеток (дополнительный файл 1: рис. S1) и идентифицированы на основе морфологии, размера частиц, концентрации, поверхностные маркеры [19]. ТЭМ показала, что эти экзосомы имели чашеобразную морфологию (рис. 1А), а ДРС показала, что их распределение по размерам находилось в пределах 50–200 нм (рис. 1Б). Вестерн-блоттинг показал, что выделенные экзосомы несли положительные маркеры CD63, TSG101 и HSP70, но не отрицательный маркер кальнексин (рис. 1С). Каждый hESC имел такой же выход экзосом, как и hiPSC, и оба были выше, чем у hUC-MSC (Fig. 1D). Эти результаты показывают, что репрезентативные экзосомы были арестованы без различий в форме; однако были обнаружены различия в концентрациях экзосом, выделенных из трех типов стволовых клеток.

Биоинформатика общих и загруженных сверху белков

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (анализ без метки). Наконец, 554, 437 и 911 семян были отобраны для анализа белковых профилей hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos соответственно (дополнительный файл 1: рис. S3A). Затем эти кандидаты были подвергнуты анализу диаграммы Венна для выбора общих белков (дополнительный файл 1: рис. S3B). Биоинформатический анализ показал, что 303 общих белка доминируют в регуляции этих сигнальных путей, включая регуляцию актинового цитоскелета, фокальной адгезии, PI3K-AKT, метаболизма углерода и т. д. (дополнительный файл 1: рис. S3C). Анализ GO также показал, что общие белки были обогащены внеклеточной экзосомой, мембраной, связыванием белка и внеклеточной областью (дополнительный файл 1: рис. S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (анализ без метки) (рис. 2А). На основании этих результатов был проведен скрининг белков 163, 187 и 451 в hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos соответственно (дополнительный файл 1: рис. S3E). Затем мы описали кривую изобилия экспрессии трех типов экзосом и определили десять первых генных символов загруженных белков в экзосомах (рис. 2В). ЧтВысоконагруженные белки подвергали биоинформатике на основе алгоритма KOBAS. Все протеомы трех типов экзосом были вовлечены в сложную регуляторную сеть сигнальных путей, и затем 20 лучших путей были отсортированы на основе значения -log10 (P-значение) (рис. 2C-E). Все протеомы были обогащены взаимодействием внеклеточного матрикса (ECM) с рецептором и сигнальными путями PI3K-AKT. Анализ белок-белкового взаимодействия (PPI) показал, что белки с верхней загрузкой как в hESC-Exos, так и в hiPSC-Exos былиобогащены клеточным циклом и метаболическим путем, тогда как белки с верхней загрузкой в ​​hUC-MSC-Exos были обогащены путями, связанными с регуляцией иммунитета (рис. 2F-H).

Попарное сравнение протеомики экзосом

Чтобы оценить разницу между каждыми двумя протеомами экзосом, мы построили диаграмму Венна, чтобы распознать уникальные и перекрывающиеся кластеры генов, кодирующих белок. Затем общие гены, кодирующие белок, подвергали вулканическому анализу и анализу тепловой карты, а также GSEA, а дифференциально экспрессируемые белки отфильтровывали при P<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

Сравнение между hESC-Exos и hUC-MSC- 1: рис. S4 D) показало, что уникальные кодирующие белки кластеры генов hESC-Exos в основном участвуют в EGFR, TGF-, клеточном цикле, регуляции плюрипотентности и Wnt. сигнализация (Дополнительный файл 1: рис. S4E). Напротив, уникальные кластеры hUC-MSC-Exos были обогащены многими сигнальными путями, связанными с иммунорегуляцией, такими как система комплемента, регуляция воспаления и микробная инфекция (дополнительный файл 1: рис. S4F). Перекрывающиеся кластеры были сильно обогащены взаимодействием ECM-рецептор, каскадами комплемента и коагуляции и передачей сигналов PI3K-AKT (Fig. 3D). На графике вулкана показаны различия между hESC-Exos и hUC-MSC-Exos (рис. 3E). Активированные белки в hUC-MSC-Exos (кластер 1) были в основном вовлечены в реакцию комплемента, активность естественных клеток-киллеров и передачу сигналов Rap1 и PPAR. Напротив, белки с повышенной экспрессией hESC-Exos были в основном вовлечены в передачу сигналов PI3K-AKT, MAPK и AMPK (Fig. 3F). GSEA подтвердил более высокую регулирующую способность hiPSC-Exos в плюрипотентности (дополнительный файл 1: рис. S6A и D) и способность hESC-Exos в иммунорегуляции, включая цитотоксичность, опосредованную естественными клетками-киллерами (дополнительный файл 1: рис. S6B и E) и регулирование COVID19-SARS-CoV2 (дополнительный файл 1: рис. S6C и F).

Сравнение hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos (дополнительный файл 1: рис. S4G) показало, что уникальный набор генов, кодирующих белок hiPSCExos, в значительной степени связан с негомологичным соединением концов, TGF- и метаболизмом витамина B6 (дополнительный файл). файл 1: рис. S4H), тогда как hUC-MSC-Exos был в основном вовлечен в пути, связанные с иммунорегуляцией (дополнительный файл 1: рис. S4I). Их перекрывающиеся белки также участвуют в регуляции взаимодействий ECM-рецепторов, каскадов комплемента и коагуляции, а также в передаче сигналов PI3K-AKT (Fig. 3G). На графике вулкана представлены дифференциально экспрессированные белки (рис. 3H). Белки кластера 1 на тепловой карте показали, что hUCMSC-Exos в основном регулируют иммунный ответ и сигнальный путь AMPK, тогда как hiPSC-Exos в основном регулируют клеточный цикл и сигнальные пути инсулина, Hippo и mTOR (рис. 3 I). GSEA также подтвердил доминирующую роль hiPSC-Exos в регуляции процессов развития (дополнительный файл 1: рис. S7A и D) и поддержании плюрипотентности (дополнительный файл 1: рис. S7B и E), тогда как hUC-MSC-Exos были в основном участвует в процессе иммунорегуляции (дополнительный файл 1: рис. S7C и F).

Биоинформатика перекрывающихся протеомов

Затем мы исследовали общие протеомы трех типов экзосом. В общей сложности 309 генов, кодирующих белок (рис. 4А), были подвергнуты анализу GO и KEGG. Результаты показали, что общие наборы генов, кодирующих белки, среди трех типов экзосом в основном участвуют во внеклеточной активности и биологических процессах, включая процессы метаболизма клеточных белков, связывание сигнальных рецепторов, связывание АТФ, связывание НАД, заживление ран и процессы метаболизма липидов (рис. 4Б). Они также способствовали созданию сложных регуляторных сетей сигнальных путей, таких как PI3K-AKT, гликолиз/глюконеогенез, Hippo, Oxytocin, HIF-1, клеточный цикл и пути AMPK (Fig. 4C). Между этими протеомными и каноническими сигнальными путями существовали сложные регуляторные отношения (Fig. 4D). Пузырьковая диаграмма свидетельствует о разной численности каждого белкового кластера в каноническом сигнальном пути. В то время как hUC-MSC-Exos и hiPSC-Exos могут обладать более сильными регуляторными способностями, чем hUC-MSC-Exos, с точки зрения клеточного цикла и сигнальных путей AMPK, hUC-MSC-Exos могут оказывать заметное регуляторное влияние на сигнальные пути VEGF и NF-κB (дополнительная информация). файл 1: рис. S8).

Анализ тепловой карты также выявил различия в экспрессии общих белков (рис. 4Е). В кластере A белки, участвующие в сигнальных путях PI3K-AKT, Hippo, VEGF и рецептора В-клеток, были обогащены hUC-MSCExos и hESC-Exos. Белки в кластере B в основном участвовали в регуляции передачи сигналов PPAR, метаболизма холестерина и продукции IgA и были истощены в hESC-Exos. hUC-MSC-Exos в основном содержали белки кластера C, которые регулировали реакцию комплемента, микробную инфекцию, передачу сигналов HIF-1, передачу сигналов MAPK, метаболические пути и путь NF-κB. Белки в кластере d, обогащенные hiPSC-Exos, участвуют в регуляции передачи сигналов Ras, окислительного фосфорилирования и передачи сигналов mTOR. Белки в кластере e были более распространены как в hiPSC-Exos, так и в hESC-Exos, чем в hUC-MSCExos, и они были вовлечены во многие метаболические процессы, такие как цитратный цикл, клеточный цикл, передача сигналов инсулина, метаболизм жирных кислот и передача сигналов AMPK. . Белки в кластере f участвовали в регуляции реабсорбции кальция, гликолиза/глюконеогенеза, адренергической передачи сигналов и метаболизма пирувата и были истощены как в hUC-MSCExos, так и в hiPSC-Exos. Белки в разных кластерах перечислены в дополнительном файле 4.

Профили микроРНК трех типов экзосом

Чтобы исследовать профили микроРНК трех типов экзосом, из экзосом выделяли тотальную РНК, чтобы соединить 5'- и 3'-концы для последующей обратной транскрипции. Полученную кДНК использовали для создания библиотеки и широкого тестирования. Число целостности РНК (RIN) составляло 2,7, 2,6 и 2,6 в hESC-Exos, hiPSC-Exos и hUC-MSC-Exos соответственно (дополнительный файл 1: рис. S9A). Определение концентрации РНК показало, что в РНК-нагрузке доминирует hESC-Exos, за которым следуют hiPSC-Exos и hUC-MSCExos (дополнительный файл 1: рис. S9B). Коэффициент корреляции Пирсона (дополнительный файл 1: рис. S9C) и PCA (дополнительный файл 1: рис. S9D) использовались для количественной оценки повторяемости микроРНК. Тепловые карты использовались для представления дифференциально экспрессируемых микроРНК в трех типах экзосом (дополнительный файл 1: рис. S9E), а количество дифференциально экспрессируемых микроРНК на P<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

Чтобы исследовать микроРНК, участвующих в биологических процессах, верхние микроРНК были отфильтрованы на P<0.05 and read count>1000 для дальнейшего предсказания целевого гена. Затем обогащенные гены подвергали анализу GO и KEGG. Результаты показали, что микроРНК hESC-Exos значительно влияют на следующие процессы: Rap1, PI3K-AKT, кальций, Hippo, цАМФ, ErbB, Foxo, клеточный цикл, сигнальный путь AMPK и т. д. (анализ KEGG) (рис. 5D) и клеточный цикл, развитие множества организмов, внутриклеточная передача сигнала, дифференцировка клеток, старение, передача сигналов Wnt и метаболизм жирных кислот. (биологический процесс) (рис. 5G). Обогащение миРНК hiPSC-Exos геном-мишенью показало, что следующие процессы в значительной степени регулируются: сигнальный путь PI3K-AKT, Rap1, Ras, кальций, гиппо, цАМФ и цГМФ-PKG и т. д. (анализ KEGG), а также клеточный цикл, множественное развитие организма, фосфорилирование, дифференцировка клеток, миграция клеток и реакция на гипоксию. (биологический процесс) (рис. 5H). В регуляторной сети микроРНК hUC-MSC-Exos наиболее вероятными биологическими процессами были: Rap1, Ras, PI3K-AKT, кальций, цАМФ, Hippo, клеточный цикл, JAK-STAT и сигнальный путь HIF-1. . (анализ KEGG) (рис. 5F), а также фосфорилирование, внутриклеточная передача сигнала, связывание АТФ, деление клеток, метаболизм липидов, костимуляция Т-клеток, заживление ран, связывание NF-κB и воспалительная реакция. (биологический процесс) (рис. 5 I). Также была изображена сеть из пяти лучших микроРНК и их регуляторных путей (дополнительный файл 1: рис. S10).

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】