Благотворное влияние экстракта Cistanche Tubulosa на улучшение низкой кишечной проницаемости эхинакозида (ECH) и актеозида (ACT).
Mar 25, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
Тадатоши Таниноа, Нориаки Нагаиб и Ёсинори Фунакамиб
* Факультет фармацевтических наук, Университет Токусима Бунри, Токусима и b Фармацевтический факультет, Университет Кинки, Осака, Япония
Абстрактный
ЦелиЦель этого исследования состояла в том, чтобы изучить благотворное влияниеЦистанхетрубчатыйизвлекатьна улучшение низкой кишечной проницаемости эхинакозида (ECH) и актеозида (ACT).МетодыПоглощение ЭХГ и АСТ в экстракте C. Tubulosa характеризовали с использованием монослоев клеток Caco-2 кишечника человека с интактными соединениями. Зависимое от транспортера глюкозы всасывание ЭХГ и АКТ было подтверждено методом кишечной перфузии in situ.Ключевые результатыКажущаяся проницаемость (Papp) существенно не отличалась между интактным ECH и интактным ACT. В присутствии флоридзина Papp ЭХГ и ACT в высокой дозе снижался до 20 процентов от соответствующего отсутствия лечения, но не изменялся под действием флоретина и верапамила. Экстракт C. Tubulosa в низких и высоких дозах усиливал Papp ЭХГ и ACT (оба в три раза), что приводило к их большому участию в натрий-зависимой абсорбции глюкозы, независимой от переносчика глюкозы. В низкой концентрации сопутствующие уровни ЭХГ и ACT в портальной крови значительно подавлялись флоридзином.ВыводДиетическая и лекарственная C.трубчатыйизвлекатьусиление кишечной абсорбции ЭХГ и АСТ может способствовать улучшению здоровья человека, хотя участие транспорта, чувствительного к флоридзину, должно быть уменьшено.
Ключевые словаактеозид; монослои клеток Caco-2;Цистанхетрубчатыйизвлекать; эхинакозид; чувствительный к флоридзину переносчик глюкозы
Введение
КорниЦистанхетрубчатыйтрадиционно использовались для медицины и пищевых продуктов. Известно, что экстракт C. tubulosa обладает фармакологическими эффектами при различных заболеваниях головного мозга, омолаживающих функциях, жировом обмене и росте волос. . [5,6] Фенилэтаноидные гликозиды, класс полифенольных соединений, являются основными химическими ингредиентами вЦистанхевидов [7], хотя их количество различается у разных видов. Эхинакозид (ECH; рис. 1) является одним из основных фенилэтаноидных гликозидов в Herba Cistanchis. Он гидролизуется в актеозид (ACT; также называемый вербаскозидом) под действием ферментов бактериального происхождения в толстой кишке. Удивительно, но хорошо растворимый в воде ЭХГ улучшает поведенческие и нейрохимические результаты в мышиной модели болезни Паркинсона и ингибирует активацию каспаз -3 и каспаз -8 в гранулярных нейронах мозжечка.[9] Хорошо известно, что гематоэнцефалический барьер строго ограничивает поступление и распространение ксенобиотиков в головной мозг из крови. Ву и др. [12] также показали, что водорастворимый АКТ быстро распределялся в тканях головного мозга крыс. Таким образом, ЭХГ и АКТ могут транспортироваться в мозг, кишечник и печень с помощью определенных систем.
Рисунок 1. Химическая структура эхинакозида и актеозида.
Хотя есть убедительные доказательства того, что потребление экстракта C. Tubulosa полезно для здоровья человека, проницаемость чистого ЭХГ через монослои клеток Caco{{0}} при апикальной концентрации 8,4 ± 1,6 мкг/мл является равен или ниже маркера парацеллюлярного транспорта маннита.[13] При пероральном введении чистого ЭХГ крысам (доза 1{{10}}0 мг/кг) абсорбция происходит чрезвычайно быстро (Tmax, 15 мин), а максимальная концентрация в сыворотке очень высока. низкая (Cmax, 0,61 ± 0,32 мкг/мл) [14]. Абсолютная биодоступность ЭХГ составляет всего 0,83%. Точно так же, когда клетки Caco-2 инкубируют с фенольной фракцией, частично очищенной от сточных вод оливкового завода, поглощение чистого ACT происходит быстро с пиком накопления, происходящим через 30 мин, и общей эффективностью накопления 0,1 процента, обеспечивая внутриклеточные уровни 130 пмоль/мг клеточного белка.[15] У крыс максимальная концентрация (0,13 ± 0,03 мкг/мл) чистого ACT была достигнута в течение 30 минут после перорального приема 100 мг/кг [12], что предполагает быстрое всасывание в кишечнике. Биодоступность АСТ при пероральном приеме, как и ЭХГ, довольно низкая (0,12 ± 0,04%), что указывает на возможность эффектов первого прохождения через кишечник и печень. В желчи крыс конъюгаты метилирования и глюкуронирования ЭХГ являются основными метаболитами [16], хотя степень печеночного метаболизма остается неясной. Предварительно нами было установлено, что ЭХГ и АСТ достаточно стабильны в гомогенатах слизистой оболочки кишечника крыс и искусственной желудочной кислоты (данные не представлены). Наджар и др. [17] продемонстрировали, что ACT ингибирует активность P-гликопротеина (P-GP)-АТФазы аналогично верапамилу (представительному ингибитору P-gp), подразумевая модулятор P-gp; однако неясно, доступен ли ACT в качестве субстрата P-gp. Интересно, что недавние открытия пищевых флавоноид-D-глюкозидов показали, что белок множественной лекарственной устойчивости (MRP2) маскирует опосредованное натрий-зависимым переносчиком глюкозы (SGLT) 1- поглощение кверцетин-4'-O- - глюкозы, [18,19], который отвечает за очень плохое поглощение. Однако очень мало известно о чувствительности полифенольных глюкозидов к абсорбционным переносчикам, включая переносчики глюкозы. Информация о характеристиках абсорбции кверцетин-4'-глюкозида и ЭХГ, быстро проникающего через гематоэнцефалический барьер, побудила нас исследовать чувствительное к переносчику поглощение фенилэтаноидных гликозидов в пищевом экстракте C. Tubulosa.
В этом исследовании мы исследовали абсорбцию интактных ЭХГ и АСТ, опосредованную переносчиками глюкозы, с использованием монослоев клеток Caco-2 кишечника человека. В то же время абсорбционный транспорт ЭХГ и ACT, сопутствующий пищевому экстракту C. Tubulosa, был охарактеризован с помощью модели in vitro и in situ системы кишечной перфузии с забором портальной крови, которая может легко различать степень абсорбции и предотвращение первой печеночной недостаточности. -распоряжение о пропусках.
Материалы и методы
Материалы
Неповрежденные ECH и ACT были щедрым подарком от Eishin Trading Co., Ltd (Осака, Япония). Флоридзин и флоретин были приобретены у Tokyo Kasei Co., Ltd. (Токио, Япония). Верапамил и п-кумаровая кислота, используемые в качестве внутренних стандартов для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Все другие используемые химические вещества были аналитической чистоты и коммерчески доступны.
Растительное сырье и приготовление метанольного экстракта
C. tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) — многолетнее паразитическое растение, растущее на корнях видов Salvadora или Calotropis и распространенное в странах Северной Африки, Аравии и Азии. Высушенные стебли C. Tubulosa измельчали в порошок и трижды экстрагировали метанолом с обратным холодильником в течение 3 часов. Выпаривание растворителя при пониженном давлении давало метанольный экстракт. Экстракт метанольный (технический, № партии 20070130;
зарегистрировать торговую марку Sabaku Ninnjinn Kanka) был щедрым подарком от Eishin Trading Co., Ltd через Мураоку и Морикаву (Университет Кинки, Япония), а ботаническая идентификация была проведена профессором Цзя Сяогуаном в Синьцзянском институте традиционного китайского и китайского языков. Этнологические лекарства.
Анализ растительных экстрактов: хроматография
Мы определили содержание ЭХГ и АСТ в экстракте C. Tubulosa (партия № 20070130) с помощью анализа ВЭЖХ, описанного ниже. Полученные данные представлены в таблице 1.
Культура клеток
Клетки Caco{{0}}, приобретенные в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Rockville, MD, USA), использовали в пассажах 38–53. Их выращивали в культуральной среде, состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM, Nacalai Tesque Co., Киото, Япония) с добавлением 0,1 мМ заменимых аминокислот, 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина G и 0,1 мг/мл сульфата стрептомицина.
Транспортные исследования
Клетки Caco-2 высевали с плотностью 6,4 × 103 клеток/см2 на поликарбонатные фильтры. Монослои использовали для транспортных экспериментов через 21–25 дней после посева. Интактные ЭХГ и АКТ, эквивалентные их содержанию вЦистанхетрубчатый извлекать(4.5 and 13.5 mg/ml) were mixed with DMEM medium containing 0.5% dimethylsulfoxide to maintain the integrity of the cell monolayer over the periods of the experiments. Intact ACT equivalent to ECH content in the extract was also dosed in the incubation medium. The extract was suspended in a DMEM medium and was centrifuged to remove insoluble components. Supernatants were loaded to the apical side. At the indicated times, an aliquot of the incubation medium was withdrawn from the basolateral side and was mixed with acetonitrile containing an internal standard for the assay. In separate experiments, phloridzin (fifinal concentration, 1 mM) and verapamil (fifinal concentration, 0.2 mM) was added to the apical side of the monolayer; however, phloretin (fifinal concentration, 0.3 mM) was treated on both sides of the monolayer. The integrity of monolayers was monitored by transepithelial electrical resistance (TEER) using Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA) before and after transport experiments. TEER values of monolayers used were >300 Ом·см2.
Перфузия кишечника in situ
Самцы крыс Wistar (23{{20}}-250 г) были получены от SLC Japan (Хамамацу, Япония). Животных помещали в кондиционируемую комнату при 12-часовом цикле свет/темнота в течение 1 недели перед использованием. Крыс кормили стандартным лабораторным кормом (Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония) с водой вволю и не кормили в течение ночи перед тестом. Исследование рециркуляционной перфузии in situ проводили в соответствии с модифицированной процедурой, описанной Mihara et al. [20] Вкратце, крыс анестезировали 25-процентным раствором уретана (1 мг/кг), чтобы избежать снижения артериального давления. Делали срединный разрез брюшной полости и обнажали тонкую кишку. Желчный проток перевязывали, чтобы избежать выделения желчи в перфузат. Всю тонкую кишку как один сегмент (от двенадцатиперстной до подвздошной) промывали физиологическим раствором при 37° в течение 10 мин до появления прозрачного смыва. Стеклянные трубки, соединенные с силиконовыми трубками, затем канюлировали в оба конца тонкой кишки и закрепляли шовной нитью. Затем тонкую кишку замещали в брюшную полость, а канюли соединяли с перистальтической помпой. Воротную вену канюлировали полиэтиленовой трубкой (PE10). Экстракт C. Tubulosa, имеющийся в продаже, суспендировали в бикарбонатном буфере Кребса-Хенселейта (рН 7,4) до конечной концентрации 4,5 мг/мл и центрифугировали в течение 10 мин при 8000 об/мин для удаления нерастворимых компонентов. Супернатант в отсутствие или в присутствии флоридзина (1 мМ) снова собирали в резервуар, который поддерживали при температуре 37 ± 0,5° на протяжении всего эксперимента. В указанные сроки кровь брали через канюлю воротной вены. После центрифугирования образцов крови полученную плазму депротеинизировали ацетонитрилом, содержащим внутренний стандарт, и центрифугировали при 3000 об/мин. Супернатанты выпаривали, а остаток разделяли подвижной фазой, состоящей из ацетонитрила и 0,5% уксусной кислоты. Смешанный раствор загружали в колонку ВЭЖХ. Крыс использовали в соответствии с этическими процедурами в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, изданным правительством Японии и Университетом Кинки.
анализ ВЭЖХ
Анализ ВЭЖХ проводили на системе, оснащенной Shimadzu SPD{{0}}A, УФ-детектором, насосом Shimadzu LC-10A и хронотопическим интегратором Shimadzu C-R4A (Киото, Япония). ЭХГ и АСТ разделяли с использованием колонки Inertsil ODS (5 мкм, 4,6 × 150 мм, GL Sciences Inc., Осака, Япония). Использовали подвижную фазу ацетонитрила и 0,5% уксусной кислоты в соотношении 15:85 (об./об.) при скорости потока 1,0 мл/мин. Детекцию проводили при 334 нм.
Кинетический анализ
Коэффициенты кажущейся проницаемости (Papp) оценивали по наклону линейной части временной динамики транспорта соединения через монослои клеток Caco-2 следующим образом:
Papp{{0}} （dQ/dt）/ A1C0)
где dQ/dt — скорость проницаемости, C0 — начальная концентрация растворенного вещества в донорской камере, A — площадь поверхности мембраны (4,7 см2).
В исследовании кишечной перфузии in situ у крыс площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC0–90) в воротной вене от нулевого времени до последнего измерения рассчитывали в соответствии с линейным правилом трапеций.
Физико-химические свойства
Площадь полярной поверхности и площадь неполярной поверхности соединений рассчитывали с помощью программы SAS (версия 0.8, Олссон Т.; Шербухин В., Synthesis and Structure Administration, 1997–2001, AstraZeneca, Cary , Северная Каролина, США). Экспериментально определенные значения log P и pKa были получены из литературы.
статистический анализ
Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки. Значения вероятности менее 5 процентов считались значимыми.
Полученные результаты
Абсорбционный транспорт эхинакозида и актеозида через монослои клеток Caco-2
У мышей и крыс интактный ECH[1{{20}},14] и ACT[12,21] перорально вводят в дозах 100–1{{ 39}}00 мг/кг. Используемый экстракт C. Tubulosa содержал приблизительно 30 процентов ECH и 15 процентов ACT на дозу. Поскольку экстракт изменял осмотическое давление и рН в среде инкубации, концентрации 4,5 и 13,5 мг/мл были определены на основе пероральной дозы (интактные соединения: 2–2{49}} мг/20 г тела вес) у мышей. Экстракт в низкой (4,5 мг/мл) и высокой (13,5 мг/мл) дозах содержал 2,0 и 6,1 мг ЭХГ и 1,0 и 3,0 мг АКТ соответственно. Мы применяли количества экстракта C. Tubulosa, которые были намного ниже пероральной дозы ЭХГ и АКТ, зарегистрированной у людей (рекомендуемая диетическая доза экстракта: 150 мг, содержащая примерно 45 мг ЭХГ и 22,5 мг АКТ). При низких и высоких дозах интактных соединений профили поглощения (рис. 2) и Papp существенно не отличались между ЭХГ и АСТ в качестве эквивалента ЭХГ (таблица 2). При загрузке в среду экстракта C. Tubulosa в высокой дозе 13,5 мг/мл значения Papp (1,27 ± 0,13 и 0,34 ± 0,03 × 10–6 см/с соответственно) сопутствующих ЭХГ и АСТ были в 3 раза выше, чем (0,38 ± 0,09 и 0,10 ± 0,03 × 10–6 см/с соответственно) интактных ЭХГ и АКТ (табл. 2). Экстракт, в отличие от интактных соединений, значительно усиливал абсорбционный транспорт ЭХГ и АКТ.
Рис. 2. Абсорбционный транспорт эхинакозида и актеозида через монослои клеток Caco-2 в трансвелловой системе. Отслеживали апикально-базолатеральный транспорт. Закрытые символы — это эхинакозид (круг) и актеозид (квадрат) изЦистанхетрубчатыйэкстракт, дозированный при низких и высоких концентрациях 4,5 (а) и 13,5 мг/мл (б). Незакрашенные символы — интактный эхинакозид (круг) и интактный актеозид (квадрат), соответствующие содержанию эхинакозида и актеозида вЦистанхетрубчатыйизвлекатьдозировано соответственно. Интактный актеозид (незаштрихованный треугольник) также загружали в среду в дозе, эквивалентной интактному эхинакозиду (незаштрихованный кружок). Результаты даны со стандартными отклонениями (n=3).
Ингибирующее действие флоридзина, флоретина и верапамила
To characterize the intestinal absorption of ECH and ACT, Caco-2 cell monolayers were incubated with representative inhibitors. Apical glucose transporter 1-sensitive phloridzin dramatically reduced the Papp of intact ECH and ACT to 20% of non-treatment at the high dose (Table 2). Basolateral glucose transporter (GLUT) 2-sensitive phloretin did not decrease the transport of intact ECH and ACT (Figure 3). In this study, higher concentrations (>0,3 мМ) флоретина нельзя было использовать из-за заметной клеточной токсичности. Кроме того, P-gp был идентифицирован как важный игрок, ответственный за взаимодействие между растительными лекарственными средствами и клинически важными субстратами P-gp. Верапамил не усиливал абсорбционный транспорт интактных соединений (рис. 3).
Абсорбционный транспорт ЭХГ и АСТ в экстракте (низкая доза) значительно ингибировался флоридзином (таблица 2 и рисунок 4). Экстракт в высокой дозе подавлял ингибирование, чувствительное к флоридзину, хотя транспорт интактных ЭХГ и АСТ был более чувствителен к флоридзину (табл. 2).
Рисунок 3 Влияние флоретина и верапамила на абсорбционный транспорт интактных эхинакозида и актеозида. Апикально-базолатеральный транспорт контролировали после нанесения интактного эхинакозида, соответствующего содержанию эхинакозида в экстракте 13,5 мг/мл на апикальной стороне (n=3). Актеозид (закрашенный квадрат) был эквивалентен по дозировке интактному эхинакозиду (закрашенный кружок) в отсутствие ингибиторов (n=3). Незакрашенные и закрытые ромбы показывают транспорт в присутствии 0,2 мМ верапамила и 0,3 мМ флоретина соответственно. Эксперименты по ингибированию проводили дважды.
Исследование кишечной перфузии in situ
В исследовании in-situ мы проверили, транспортируются ли ECH и ACT в экстракте C. Tubulosa с помощью SGLT1, расположенного на апикальной стороне тонкой кишки. При перфузии пищевого экстракта в низкой дозе (4,5 мг/мл) в портальной крови быстро появлялись ЭХГ и АСТ (рис. 5). AUC была определена как 2702,8 ± 384,1 мкм·мин для ЭХГ и 698,3 ± 197,2 мкм·мин для ACT. После того, как AUC была нормализована содержанием экстракта C. Tubulosa, поглощенное количество существенно не отличалось между ECH и ACT. SGLT1-чувствительный флоридзин, в отличие от флоретина, значительно подавлял абсорбционный транспорт сопутствующего ЭХГ (AUC, 649,4 ± 248,2 мкм·мин) и АКТ (не обнаружено).
Обсуждение
Некоторые растительные ингредиенты являются субстратами P-gp, которые в высокой степени экспрессируются в печени, кишечнике, мозге и почках. P-gp является определяющим фактором для биодоступности in vivo, расположения и распространения растительных лекарственных средств, включая зверобой продырявленный, куркумин, эхинацею, женьшень, гинкго и имбирь. [22,23] Биодоступность генистеина{{5} } глюкозид, производное флавоноида, также ограничивался кишечным переносчиком MRP2.[24] Таким образом, это исследование было разработано для изучения абсорбционных свойств ЭХГ и АКТ, сопутствующих диетическому и лекарственному экстракту C. Tubulosa.
Монослои поляризованных клеток Caco{{0}}, а также кишечник [25] экспрессируют основные кишечные переносчики лекарств, такие как P-gp, MRPs и белок устойчивости к раку молочной железы. [26] Было показано, что диетические флавоноиды кверцетина [27] и мирицетина [28] ингибируют опосредованный P-gp отток как на клеточных линиях, так и на животных моделях. Верапамил, ингибитор P-gp, не изменяет проницаемость ACT и ECH через монослои клеток Caco-2 (рис. 3), что указывает на то, что интактные ECH и ACT не ограничиваются насосом оттока P-gp. Наши предыдущие исследования показали, что белки MRP2 не экспрессировались в монослоях клеток Caco-2.[29] P-gp и MRP2-опосредованный отток может быть исключен из транспорта ECH и ACT. Некоторые гликозиды кверцетина с низкой липофильностью всасывались более эффективно, чем сам кверцетин [30}. Важно также отметить, что АКТ с сахарным фрагментом быстро распределяется в тканях головного мозга. Наше внимание было сосредоточено на комбинированном действии двух переносчиков глюкозы в энтероцитах: SGLT в мембране щеточной каймы и облегченного диффузионного транспорта глюкозы (GLUT) в базолатеральной мембране. Культуру клеток Caco-2 можно использовать в качестве модели для изучения чувствительных к флоретину GLUT2 и чувствительных к флоридзину транспортеров SGLT1 и 2 [31–34]. Глюкоза транспортируется с апикальной на базолатеральную сторону Caco{{27 }} монослоев с высокой скоростью с Papp 36,8 ± 1,1 × 10-6 см/с.[35] Он обладает более высоким Papp, чем маркер трансцеллюлярного транспорта пропранолол (23,4 ± 2,8 × 10-6 см/с). Как показано в Таблице 2, интактный ЭХГ и АСТ имели гораздо более низкое значение Papp, чем указанное в глюкозе и пассивном пропранололе. Мы рассчитали логарифм коэффициента распределения (октанол-вода), log P, который составил -2,32 и 0,077 для ЭХГ и АСТ соответственно. Полагают, что полярные или гидрофильные соединения транспортируются через парацеллюлярный путь (через плотные соединения). Два фенилэтаноидных гликозида, подобно манниту, транспортируются парацеллюлярным путем. Однако флоридзин резко снижал абсорбционную проницаемость интактных ЭХГ и АКТ (таблица 2), что свидетельствует о том, что апикальный SGLT1 играет важную роль в кишечной абсорбции интактных ЭХГ и АКТ. При эквивалентной дозе более высокая гидрофобная проницаемость АКТ была близка к проницаемости ЭХГ (рис. 2 и таблица 2). Йошикава и др. [36] продемонстрировали, что облегчающие транспортеры (GLUT 1 и 2), а также чувствительный к флоридзину SGLT1 интенсивно экспрессируются в тонком кишечнике. Поскольку поглощенное количество соединений основано на массовом балансе между поглощением и выведением, мы оценили участие GLUT2. Глюкоза пересекает апикальные мембраны энтероцитов с помощью SGLT1 с высокой аффинностью и низкой емкостью и выходит через базолатеральную мембрану через GLUT2 с низкой аффинностью и высокой емкостью. Флоретин (специфический ингибитор GLUT2) не отменял транспорт интактных ЭХГ и АСТ (рис. 3). Фунес и др. [37] продемонстрировали сильное взаимодействие АСТ с фосфатными группами фосфолипидных мембран. Поскольку в структуре ACT много гидроксильных групп, водородные связи между этими группами и полярными головками глицерина или фосфатными группами фосфолипидов являются наиболее вероятными взаимодействиями. Когда инкубированный ЭХГ и его эквивалент АСТ инкубировали с монослоями Caco-2 в течение 11 ч, клеточное накопление АСТ (0,24 ± 0,04 нмоль/см2) было в три раза выше, чем у ЭХГ (0,07 ± 0,01 нмоль/см2). Мы думали, что ЭХГ и АСТ, чувствительные к SGLT1-, медленно перемещались из энтероцитов в кровоток, что, возможно, приводило к наблюдаемому низкому Papp. По сравнению с высокогидрофильным ЭХГ низкая проницаемость АКТ может быть связана с интеркаляцией в клеточные мембраны.
Полифенольные соединения потребляются в смесях трав во время их клинического применения и коммерчески доступны в виде пищевых добавок. В исследовании in vitro было показано, что на абсорбцию фенольного эпикатехина не влиял состав ингредиентов пищевых материалов напитков.[38] Напротив, матриксы продукта Hypericum perforatum L. влияют на транспорт глюкозидов кверцетина (рутина и изокверцитрина) и гиперозида через клетки Caco-2 из-за различий в фитохимическом составе матрикса и транспортных характеристиках, т. е. парацеллюлярном переносе и опосредованном переносчиком или активном транспорт.[39] В этом исследовании C. Tubulosa обеспечивал трансэпителиальный транспорт в три раза выше, чем интактный ECH и ACT (рис. 2 и табл. 2). Мы предполагаем, что компоненты экстракта C. Tubulosa активируют чувствительный к флоридзину переносчик и/или ускоряют элиминацию внутриклеточного ЭХГ и АКТ. Экстракт C. Tubulosa в высоких дозах, по-видимому, сильно маскировал активность чувствительного к флоридзину транспорта (таблица 2). Пищевые углеводы[40] и белки[41] взаимодействуют с некоторыми полифенолами в желудочно-кишечном тракте. Морикава и др. [10] продемонстрировали, что пять иридоидов, канканозид AD и канканол, монотерпеновый гликозид, канканозид E, два фенилэтаноидных олигогликозида, канканозиды F и G и ацилированный олигосахар, канканоза, могут быть выделены из экстракта C. Tubulosa, используемого в настоящее время. Другие ингредиенты, в том числе белки в экстракте C. Tubulosa, остаются неясными. Наряду с приведенным выше предположением мы намерены изучить, взаимодействуют ли другие компоненты с SGLT1 и ингибируют ли поглощение ECH и ACT.
In-vivo experiments cannot easily distinguish between the extent of absorption and avoidance of first-pass disposition through the liver. The in-situ intestinal perfusion model has an advantage over in-vivo and in-vitro models due to the easy control of experiment parameters exclusion of the impact of other organs and maintenance of an intact intestinal blood supply.[22] The involvement of the phloridzin-sensitive glucose transporter was evaluated in an in-situ intestinal perfusion system. As shown in Figure 5, absorbed amounts of ECH and ACT concomitants in C. tubulosa extract (low dose) were greatly abolished by phloridzin, which agrees with our in-vitro data (Figure 4). Using peptides and 20 drugs passively absorbed, a good correlation is obtained between in-vivo drug absorption and the drug permeability of Caco-2 monolayers.[42] Drugs with a Papp of >1 × 10–6 см/с полностью всасываются у человека, в то время как плохо всасываются лекарства и пептиды (<1% of="" dose)="" have="" papp="" values="" of=""><1 ×="" 10−7="" cm/s.="" surprisingly,="" the="" papp="" of="" the="" ech="" concomitant="" (high="" dose)="" was="">1 × 10–6 см/с (таблица 2), что свидетельствует о высокой биодоступности при пероральном приеме у животных и человека. Креспи и др. [43] продемонстрировали, что отток в исследовании кишечной перфузии in situ существенно не отличался между флоридзином и флоретином. Они [44] также показали, что пероральная биодоступность флоридзина с высокой чувствительностью к SGLT1 у крыс составляла всего 10 процентов. В будущих исследованиях необходимо оценить биодоступность и эффект первого прохождения через печень сопутствующего ЭХГ после перорального приема пищевого экстракта в высокой дозе. Результаты in-situ показывают, что прием экстракта C. Tubulosa может улучшить низкую пероральную абсорбцию интактных ЭХГ и АКТ.
Рисунок 4. Ингибирующее действие флоридзина на абсорбционный транспорт эхинакозида и актеозида вЦистанхетрубчатыйизвлекать. Отслеживали апикально-базолатеральный транспорт. Темные кружки и квадраты – эхинакозид (а) и актеозид (б) в экстракте 4,5 мг/мл без флоридзина соответственно. Скрытые ромбы показывают обработку экстрактом 4,5 мг/мл, включая 1 мМ флоридзина. Результаты даны со стандартными отклонениями (n=3).
Рисунок 5. Изменение концентраций эхинакозида и актеозида в портальной крови во время in-situ рециркуляции кишечной перфузии крыс. Круглые и квадратные символы обозначают соответственно эхинакозид и актеозид.Цистанхетрубчатыйизвлекатьв концентрации 4,5 мг/мл перфузировали в отсутствие (заштрихованные символы) или в присутствии (незаштрихованные символы) 1 мМ флоридзина при 37°С. Результаты даны со стандартными отклонениями (n=3–4). *P < 0,05="" по="" сравнению="" с="" пищевым="" экстрактом="" в="" присутствии="">
Вывод
Пищевые и лекарственные экстракты C. Tubulosa, улучшающие всасывание ЭХГ и АСТ в кишечнике, могут способствовать улучшению здоровья человека, хотя участие транспорта, чувствительного к флоридзину, должно быть уменьшено.
Декларации Конфликт интересов
Автор(ы) заявляют(ют), что у них нет конфликтов интересов, о которых следует сообщать.
Финансирование
Эта работа была частично поддержана Исследовательским центром высоких технологий Университета Кинки.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Осаму Мураоке (Университет Кинки, Осака, Япония) и Тосио Морикаве (Университет Кинки, Осака, Япония) за предоставлениеЦистанхетрубчатыйизвлекатьи чистые составляющие. Мы очень благодарны Масахиро Иваки (Университет Кинки) за их поддержку в обучении.
использованная литература
1. Танака Дж. и соавт. ЭффектЦистанхетрубчатый извлекатьпри различных заболеваниях головного мозга. Стиль питания 21 2008; 12: 24–26.
2. Танака Дж. и соавт. Антивозрастные функцииЦистанхетрубчатый извлекать. Стиль питания 21 2008; 12: 27–29.
3. Танака Дж. и соавт. Функции красоты и роста волосЦистанхетрубчатыйизвлекать. Стиль питания 21 2008; 12: 29–32.
4. Танака Дж. и соавт. Эффект метаболизма жировЦистанхетрубчатыйизвлекать. Стиль питания 21 2008; 12: 30–33.
5. Йошизава Ф. и соавт. СоставляющиеЦистанхетрубчатыйШренк (Крюк) ф.II. выделение и структура нового фенилэтаноидного гликозида и нового неолигнанового гликозида. Chem Pharm Bull 1990; 38: 1927–1930.
6. Йошикава М. и соавт. Фенилэтаноидные аминогликозиды и ацилированные олигосахара с сосудорасширяющей активностью отЦистанхетрубчатый. Bioorg Med Chem 2006; 14: 7468–7475.
7. Ту П.Ф. и др. Анализ фенилэтаноидных гликозидов Herba cistanche методом ОФ-ВЭЖХ. Яо Сюэ Сюэ Бао 1997; 32: 294–300.
8. Лей Л. и соавт. Метаболическая регуляция фенилэтаноидных гликозидов от Herbaцистанхив желудочно-кишечном тракте собаки. Яо Сюэ Сюэ Бао 2001; 36: 432–435.
9. Гэн Х и соавт. Нейропротекторные эффекты эхинакозида в модели болезни Паркинсона у мышей MPTP. Евр Дж Фармакол 2007; 564: 66–74.
10. Морикава Т. и соавт. Ацилированные аминогликозиды фенилэтаноидов с гепатопротекторной активностью из пустынного растенияЦистанхетрубчатый. Bioorg Med Chem 2010; 18: 1882–1890.
11. Паола Р.Д. и соавт. Эффекты вербаскозида, биотехнологически очищенного культурами клеток растения syringa vulgaris, на модели пародонтита у грызунов. Дж Фарм Фармакол 2011; 63: 707–717.
12. Ву Ю.Т. и соавт. Определение актеозида вЦистанхеDeserticola и Boschniakia rossica и их фармакокинетика у свободно передвигающихся крыс с использованием ЖХ-МС/МС. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 844: 89–95.
13. Матиас А. и соавт. Исследования проницаемости алкиламидов и конъюгатов кофейной кислоты из эхинацеи с использованием модели монослоя клеток caco-2. J Clin Pharm Therapeut 2004; 29: 7–13.
14. Цзя С. и соавт. Определение эхинакозида в сыворотке крыс с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием и его применение к фармакокинетике и биодоступности. Ж Хроматогр 2006; 844: 308–313.
15. Кардинали А. и соавт. Вербаскозиды из воды оливкового завода: оценка их биодоступности и усвоения кишечником с использованием модельной системы переваривания in vitro/какао-2. Дж. Пищевая наука, 2011 г.; 176: Н48–Н54.
16. Цзя С. и соавт. Метаболизм эхинакозида, хорошего антиоксиданта, у крыс: выделение и идентификация его желчных метаболитов. Препарат Метаб Распоряжение 2009; 37: 431–438.
17. Наджар И.А. и соавт. Модуляция активности Р-гликопротеин-АТФазы некоторыми фитокомпонентами. Phytother Res 2009; 24: 454–458.
18. Уолгрен Р.А. и соавт. Отток пищевого флавоноида кверцетина 4'-бета-глюкозида через монослои клеток кака-2 кишечника человека с помощью апикального белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью-2. J Pharmacol Exp Ther 2000a; 294: 830–836.
19. Уолгрен Р.А. и соавт. Клеточное поглощение диетического флавоноидного кверцетина 4'-бета-глюкозидазы натрий-зависимым переносчиком глюкозы SGLT1. J Pharmacol Exp Ther 2000b; 294: 837–843.
20. Михара К. и соавт. Метаболизм эперизона при первом прохождении через кишечник у крыс. Фарм Рез 2001; 18: 1131–1137.
21. Исакки Б. и соавт. Антигипералгетическая активность вербаскозида в двух моделях невропатической боли. Дж Фарм Фармакол 2011; 63: 594–601.
22. Кук Т.Дж. и соавт. Кишечная проницаемость хлорпирифоса с использованием метода однопроходной кишечной перфузии у крыс. Токсикология 2003; 184: 125–133.23. Кумар Ю.С. и соавт. Опосредованное P-гликопротеином и цитохромом P-450- взаимодействие лекарственных средств растительного происхождения. Препарат Метабол Препарат Взаимодействие 2010; 25: 3–16.
24. Walle UK et al. Транспорт генистеин- 7-глюкозида клетками CACO-2 кишечника человека: возможная роль MRP2. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1999; 103: 45–56.
25. Ито К. и соавт. Апикальная/базолатеральная поверхностная экспрессия переносчиков лекарств и ее роль в векторном транспорте лекарств. Фарм Рез 2005; 22: 1559–1577.
26. Лайтинен Л. и соавт. Культуры клеток Caco-2 в оценке кишечной абсорбции: эффекты некоторых совместно вводимых лекарств и природных соединений в биологических матрицах. (Университет Хельсинки, Финляндия, 2006 г.) Академическая диссертация, стр. 1–66.
27. Скамбия Г. и соавт. Кверцетин потенцирует действие адриамицина на клеточную линию рака молочной железы человека MCF-7 с множественной лекарственной устойчивостью: P-гликопротеин как возможная мишень. Рак Chemother Pharmacol 1994; 34: 459–464.
28. Чой Д.Х. и соавт. Влияние мирицетина, антиоксиданта, на фармакокинетику лозартана и его активного метаболита EXP-3174 у крыс: возможная роль цитохрома P450 3A4, цитохрома P450 2C9 и P- Ингибирование гликопротеинов мирицетином. Дж Фарм Фармакол 2010; 62: 908–914.
29. Танино Т. и соавт. Паклитаксел-2'-пролекарство этилкарбоната может обходить опосредованный P-гликопротеином клеточный отток, повышая цитотоксичность препарата. Фарм Рез 2007; 24: 555–565.
30. Холлман П.С. и соавт. Поглощение пищевых гликозидов кверцетина и кверцетина у здоровых добровольцев с илеостомией. Ам Дж. Клин Нутр, 1995; 62: 1276–1282.
31. Келлетт Г.Л. и соавт. Диффузный компонент абсорбции глюкозы в кишечнике опосредован индуцированным глюкозой привлечением GLUT2 к мембране щеточной доски. Биохим Дж 2000; 350: 155–162.
32. Маттер К. и др. Сортировка эндогенных белков плазматической мембраны происходит из двух мест в культивируемых эпителиальных клетках кишечника человека (Caco-2). Сотовый 1990; 60: 429–437.
33. Махрауи Л. и соавт. Наличие и дифференциальная экспрессия мРНК транспортеров гексозы SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT3 и GLUT5 в клеточных клонах Caco-2 в зависимости от роста клеток и потребления глюкозы. Биохим Дж. 1994; 298: 629–633.
34. Месонеро Дж. и соавт. Сахарозависимая экспрессия переносчика фруктозы GLUT 5 в клетках Cac-2. Биохим Дж. 1995; 312: 757–762.
35. Уолгрен Р.А. и соавт. Транспорт кверцетина и его глюкозидов через эпителиальные клетки Caco-2 кишечника человека. Биохим Фармакол 1998; 55: 1721–1727.
36. Йошикава Т. и соавт. Сравнительная экспрессия переносчиков гексозы (SGLT1, GLUT1, GLUT2 и GLUT5) в желудочно-кишечном тракте мыши. Histochem Cell Biol 2011; 135: 183–194.
37. Фунес Л. и соавт. Эффекты вербаскозида, фенилпропаноидного гликозида из вербены лимонной, на модельные мембраны фосфолипидов. Химическая физика липидов 2010; 163: 190–199.
38. Нейлсон А.П. и соавт. Влияние состава шоколадной матрицы на биодоступность флаван-3-ола какао in vitro и биодоступность для человека. J Agric Food Chem 2009; 57: 9418–9426.
39. Гао С. и соавт. Сильно варьирующееся содержание фенолов в продуктах из зверобоя влияет на их транспортировку в модели клеток Caco-2 кишечника человека: фармацевтическое и биофармацевтическое обоснование стандартизации продукта. J Agric Food Chem 2010; 58: 6650–6659.
40. Шрамм Д.Д. и соавт. Влияние пищи на абсорбцию и фармакокинетику флаванолов какао. Life Science 2003; 73: 857–869.
41. Лоран С. и соавт. Этанол и винная матрица, не содержащая полифенолов, стимулируют дифференцировку клеток Caco-2 кишечника человека. Влияние их ассоциации с экстрактом виноградных косточек, богатым процианидином. J Agric Food Chem 2005; 53: 5541–5548.
42. Артурссон П. и соавт. Корреляция между пероральным всасыванием лекарств у людей и кажущимися коэффициентами проницаемости лекарств в клетках внутреннего эпителия человека (Caco-2). Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 880–885.
43. Crespy V et al. Сравнение кишечной абсорбции кверцетина, флоретина и их глюкозидов у крыс. Дж. Нутр 2001a; 131: 2109–2114.
44. Crespy V et al. Биодоступность флоретина и флоридзина у крыс. Дж. Нутр 2001b; 131: 3227–3230.