Центральная роль трансформирующего фактора роста- (TGF-) в развитии почечного фиброза
Mar 26, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
ЧАСТЬ Ⅰ: Роль первичных почечных фибробластов человека в TGF- 1-опосредованных устройствах, имитирующих фиброз
Сон-Хе Хван, Юн-Ми Ли и др.
1. Введение
Почечный фиброз, конечный общий путь бесчисленных прогрессирующих заболеваний почек, характеризуется увеличением продукции белка внеклеточного матрикса (ECM), снижением деградации матрикса, дисфункцией клеточно-матриксного взаимодействия, трансформацией резидентных клеток и воспалительной клеточной инфильтрацией.Трансформирующий фактор роста-(TGF-) представляет собой многофункциональный димерный пептид, который регулирует такие биологические процессы, как пролиферация, дифференцировка клеток и иммунологические реакции [1]. Среди многочисленных фиброгенных факторов ТФР-(Трансформирующий фактор роста-) играет центральную роль и оказывает противовоспалительное действие. ТГФ- 1(Трансформирующий фактор роста-)-дефицитные мыши умирают от массивного воспаления. Трансгенные мыши со сверхэкспрессией TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)практически защищены от развития почечной фиброзной патологии, главным образом благодаря своей противовоспалительной активности [2]. Профибротические и противовоспалительные свойства TGF-(Трансформирующий фактор роста-)являются обоюдоострыми мечами в отношении терапевтического применения TGF-(Трансформирующий фактор роста-)ингибирование. Замечательные усилия были предприняты, чтобы препятствовать TGF-(Трансформирующий фактор роста-)действия, препятствующие прогрессированиюпочечныйфиброз[3]. Хотя для борьбы спочечныйфиброз, экспериментальная модель для оценки доступных в настоящее время лекарств не идеальна.
цистанхе трава предотвратитьпочечные заболевания
В целом исследования на животных играют ключевую роль в доклинических испытаниях для прогнозирования фармакокинетики и эффективности лекарств. Тем не менее, существуют различные различия между животными и людьми, что заставляет нас сомневаться в точности тестов на эффективность и безопасность лекарств на животных. Предыдущие отчеты основывались на доклинических исследованиях на животных во время разработки лекарств для оценки нефротоксичности и безопасности лекарств. Почечная функция животных более чем в два раза выше, чем у человека. Следовательно, лекарства метаболизируются у животных быстрее, чем у людей, что затрудняет разъяснение результатов испытаний на токсичность лекарств с помощью исследований на животных. Кроме того, результаты экспериментов на животных нельзя использовать для прогнозирования реакции человека на лекарства, поскольку у животных разные физиологические функции. на основе животныхпочечный фиброзмодели испытывают трудности в воспроизведении человекапочечный фиброз; следовательно, ведутся исследования для преодоления существующих препятствий и оптимизации платформ для открытия лекарств [5].
Технология «орган-на-чипе» (OoC) стала новой концепцией для решения этих проблем. Эта платформа была разработана с учетом существующих недостатков и показала большие перспективы в области нефрологии [6]. Кроме того, модели OoC обладают большим потенциалом в качестве замены экспериментальных моделей животных, обеспечивают решение межвидовых различий и могут помочь положить конец жестокому обращению с животными и этическим дебатам [7]. Существует несколько моделей in vitro, в которых одновременно используются первичные почечные фибробласты с эндотелиальными и эпителиальными клетками, которые являются важными клетками впочкафиброз. Роль каждой клетки вфиброзизучается отдельно; однако знания о взаимодействии клеток ограничены.
В настоящем исследовании мы разработалифиброзустройства, имитирующие первичные фибробласты человека. Мы подтвердили, что TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечение по-разному влияет напочечный фиброзмодель. Примечательно, что фибробласты играют ключевую роль в качестве эффекторных клеток, способствуют формированию профиброзной микросреды и секретируют факторы роста и цитокины. Поэтому, основываясь на этом новом методе, фибробласты могут стать идеальной системой клеточных моделей для изучения почечной недостаточности. Мы оценили, влияют ли фибробласты, полученные из фиброзной болезни почек, на целостность клеток, культивируемых в трех измерениях (3D). Наконец, мы представляем экспериментальное исследование, которое демонстрирует потенциал человеческогопочечный фиброз- имитирующие устройства как модель для прогнозирования реакции человекапочечный фиброз.
эффекты цистанхе: лечение почечной инфекции
2. Результаты
2.1. Идентификация альфа-актина гладких мышц (a-SMA) и кератина -8 (KRT -8) с помощью TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)в ячейках HK-2
На ранней стадии мы исследовали известные маркерыфибрози цитоскелет в двумерных (2D) культурах. Анализы иммунофлуоресцентного окрашивания были выполнены для оценки экспрессии -SMA маркера фиброза и перехода эпителия канальцев в мезенхиму (EMT) и уровней KRT8 в качестве маркера цитоскелета. Иммунофлюоресцентное окрашивание показало, что экспрессия -SMA изначально была слабой, а уровни KRT8 были высокими в монослойных эпителиальных клетках HK-2. Не было значительного изменения интенсивности флуоресценции под действием TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)(5 нг/мл) или обработку эпителиальных клеток HK-2 специфическим ингибитором в течение 24 ч (рис. 1).
Рисунок 1. Иммунофлуоресценция показывает, что экспрессия альфа-SMA и кератина-8(KRT8) поддерживалась при лечении TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)или ингибитор в клетках HK-2.(A) Экспрессия альфа-SMA и (B) CCK-8 не влияла на клетки HK-2 под действием TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)(5 нг/мл) или ингибитор. Первоначально клетки высевали с плотностью 1×10 градусов на лунку (ac) в необработанном контроле и (df) стимулировали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-) или（gi）10 мкМ ингибитора（SB431542） в течение 24 ч и фиксировали 4-процентным параформальдегидом. Затем клетки окрашивали анти-- -SMA и анти-цитокератином-8 в течение 20 мин. Было проведено совместное окрашивание красителем Hoechst H33342 для идентификации ядер клеток. Шкала баров на микрофотографиях указывает 200 мкм.
порошок цистанхе улучшает работу почек
2.2. Экспрессия KRT8 снижена TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)на чипе
Затем мы оценили уровни экспрессии -SMA и KRT8 в 3D-культуре HK-2 и общую длину GFP-эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), обработанных TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)и специфический ингибитор. Для этого мы сначала установили образец тканевого чипа, включающий два типа клеток, эпителиальные клетки HK-2 и GFP-HUVEC. После подтверждения конструкции мы обнажили тканевый чип с помощью TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)(5 нг/мл) или специфический ингибитор (10 мкМ SB431542) на 24 часа.
Как показано на рисунке 2A-C, экспрессия -SMA не была специфически изменена TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)или лечение специфическим ингибитором. Однако экспрессия KRT8 была снижена в чипах с совместным культивированием двухклеточного типа. Более того, добавление ингибитора TGF-β1 увеличивало экспрессию KRT8.
Мы исследовали формирование трехмерной трубчатой капилляроподобной сети с помощью TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)лечение в HUVEC, поскольку эндотелиальные клетки могут спонтанно образовывать трехмерную трубчатую капилляроподобную сеть. В соответствии с нашими культурными условиями образование толстых линий значительно уменьшилось. Однако капилляроподобные тонкие линии были увеличены в TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)обработанные GFP-HUVEC. В случае TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)обработка ингибитором на 3D-культивируемом чипе, общая длина толстых и толстых линий показала обратную тенденцию к TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечение. Наблюдалось увеличение длины толстой линии по сравнению с необработанной контрольной группой. Аналогичная картина наблюдалась в диаметре толстой линии в GFP-HUVEC после TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)лечение и лечение ингибиторами. Диаметр GFP-HUVEC подавлялся TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечения, но увеличивался независимо от толщины линии ингибитора по сравнению с контролем и TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-). Общая длина и диаметр толстой линии были значительно увеличены при обработке ингибитором TGF- 1 по сравнению с необработанным контролем и обработкой TGF- 1. Примечательно, что полученные результаты указывали на повышенную плотность мелких сосудов в TGF-(Трансформирующий фактор роста-)-леченная группа по сравнению с их необработанными аналогами. Напротив, плотность толстых сосудов в TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)группа лечения была ниже, чем в контрольной группе без лечения (рис. 2D, E).
Рисунок 2. Экспрессия KRT8 в HK-2 и общая длина и диаметр HUVEC.(A) Иммунофлуоресценция показывает, что экспрессия -SMA поддерживалась, а экспрессия KRT8 резко снижалась при лечении TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)в Гонконге-2. Клетки высевали и стимулировали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)или ингибитор 10 мкм (SB 431542) в течение 24 ч и фиксировали 4-процентным параформальдегидом. Клетки окрашивали анти-- -SMA и анти-цитокератином-8 в течение 20 мин. Было проведено совместное окрашивание красителем Hoechst H33342 для идентификации ядер клеток. Экспрессия -SMA(ac) не изменилась, но KRT8(df) в клетках HK-2 и экспрессия GFP в HUVEC (gi) были значительно изменены TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)(5 нг/мл) и ингибитор (B, C). В общей длине HUVEC тонкий сосуд увеличился, а толстый сосуд уменьшился под действием TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-). Диаметр увеличен как в тонких, так и в толстых сосудах. Эти результаты были обращены ингибитором SB431542 (D, E). Масштабные линейки на микрофотографиях указывают 100 мкм.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
для чего применяют цистанхе: лечение хронических заболеваний почек
2.3. ТГФ- 1(Трансформирующий фактор роста-)Влияет на три типа клеток чипа с многокамерной структурой
Для изучения TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)ответов предлагаемого 3D-чипа, мы провели иммуноокрашивание каждого компартмента отдельно (рис. 3). В этом анализе использовали первичные почечные фибробласты человека. Образцы были проанализированы с использованием FACS, и было подтверждено, что они являются положительными в отношении маркерного антитела к фибробластам. После инкубации трех типов клеток с TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)в течение 24 часов проводили иммуноокрашивание для оценки экспрессии -SMA и KRT8. Экспрессия a-SMA повышалась при обработке TGF-1, и противоположные результаты наблюдались при обработке TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)лечение ингибиторами. И наоборот, экспрессия KRT8 подавлялась TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)и показал противоположный ответ на TGF-(Трансформирующий фактор роста-)ингибитор (рис. 4A-C).
Рисунок 3. Образец изображения со схематической демонстрацией изготовления и экспериментального графика устройства.(A) На двух верхних изображениях показан макет. На левом изображении показана общая фотография устройства сверху вниз. Нижние изображения показывают поперечное сечение. Схематический вид с указанием размеров жидкостных направляющих. (B) Этот рисунок описывает экспериментальные графики дляфиброз-имитирующие устройства. Четырехэтапный процесс загрузки для каждой лунки. Расположение каждой зоны формирования рисунка гидрогеля, а также размещение среды в нисходящем и изометрическом поперечном сечении. (1) Всего 1,5 мкл гидрогеля 1 спонтанно направляется в центральный канал. (2) Центральный канал заполнен 5 мкл гидрогеля. (3) В общей сложности 10 мкл гидрогеля 3 нанесены на дно резервуара. (4) Всего выдается 200 мкл среды. Красная полоса шкалы=9 мм.
Как показано на рисунке 4D-G, длина капилляроподобной тонкой линии была значительно увеличена под действием TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)лечение в GFP-HUVEC. Однако толщина толстой линии была уменьшена в TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечили HUVEC. Диаметр был уменьшен в среднем для тонких и толстых сосудов в HUVEC. В случае TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)обработки ингибитором на 3D-культивируемом чипе общая длина толстых и толстых линий показала противоположную тенденцию по сравнению с обработкой TGF- 1. Кроме того, длина толстой линии была увеличена по сравнению с необработанной контрольной группой.
Рисунок 4. Изменение 3D-культуры HK-2 и HUVEC с первичными почечными фибробластами.Всего клеток высевали с плотностью 5×10 градусов на 3D-чип и стимулировали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)или ингибитор 10 мкм (SB 431542) в течение 24 ч и фиксировали 4-процентным параформальдегидом. (A) Клетки в 3D-чипе были окрашены анти-о-SMA и анти-цитокератином-8. Экспрессия -SMA (ac) была увеличена, а экспрессия KRT8 (df) значительно снижена под действием TGF- 1 (5 нг/мл). Общая длина HUVEC; тонкие сосуды резко увеличились, а толстые сосуды уменьшились под действием TGF-ß1(Трансформирующий фактор роста-)(Д, Е). Диаметр был уменьшен для тонких и толстых сосудов (F, G). Эти результаты были обращены ингибитором SB431542. Масштабные линейки на микрофотографиях указывают 100 мкм.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 модулирует медиатор воспаления и факторы роста
Затем мы исследовали воспалительные цитокины и факторы роста в супернатанте; ИЛ-1, ФРФ-2, ТФР- 2(Трансформирующий фактор роста-)и ТФР- 3(Трансформирующий фактор роста-)секреция белка была значительно выше в 3D-культивируемых чипах, чем в 2D-культуре фибробластов, даже несмотря на то, что они имели одинаковое общее количество клеток. Однако TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-) уровни были одинаковыми, так как 2D- или 3D-культурные модели обрабатывались одинаковыми концентрациями TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)(Рисунок 5А-Е). В частности, высвобождение FGF-2 из первичных почечных фибробластов человека составляло 20,9 ± 0,4 пг/день/5×10 клеток 2D монослойной культуры и 3094,8 ± 0,2 пг/день/5×10-градусных клеток, включая HUVEC и HK-2 3D-культивируемых чипов в необработанном контроле. Секреция FGF-2 с помощью TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)стимуляция составила 31,0±0,2 пг/день/5×1{9}} клеток степени для 2D-культуры и 3683,9± 0,8 пг/день/5×10 клеток степени для 3D-культуры. -культивированный чип. Это увеличение продукции белка FGF-2 в 2D-монослойной культуре сопровождалось увеличением TGF- 1 в модели 3D-культивирования чипов.(Трансформирующий фактор роста-)лечения (рис. 5B).
Рисунок 5. Сравнение 2D- и 3D-моделей в качестве платформ, имитирующих почечный фиброз.Клетки высевали с плотностью 5×10 градусов на лунку 2D или 3D-чип и стимулировали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)или 10 мкм ингибитора (SB 431542) на 24 часа. Первичные почечные фибробласты человека использовали в 2D-культивировании и в 3D-культивировании модели. Использовали фибробласты с плотностью 8×10*, культивированные с HUVEC и HK-2. Первичное отношение почечных фибробластов человека к HUVEC, или отношение F:H, составляло 1:5 для оценкифиброзКлетки .HK-2 использовали при плотности 2×104. Обнаружение (A)IL-1, (B)основного фактора роста фибробластов (FGF-2) и (CE)TGF-бета 1, 2 и 3 в супернатанте проводили с помощью мультиплексного анализа цитокины и мультиплексный иммуноферментный анализ. Каждая полоса представляет собой среднее ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Трансформирующий фактор роста-).
Польза cistanche tubolosa: лечение заболеваний почек
Кроме того, мы оценили экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-. Результаты были значительно подавлены рекомбинантным человеческим TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечение в 3D-культивированном чипе как противовоспалительное свойство TGF-(Трансформирующий фактор роста-). Мы обнаружили, что экспрессия мРНК активировалась TGF- 1.(Трансформирующий фактор роста-)ингибитор (SB431542). Кроме того, опосредованная ингибитором экспрессия IL-6, IL-8 и TNF- была специфически снижена по сравнению с необработанным контролем (рис. 6A-D). Уровень мРНК VEGF, фиброзного фактора, значительно повышался под действием TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)лечение. Уровень мРНК VEGF снижался под действием ингибитора TGF- 1 (рис. 6E), тогда как экспрессия мРНК IL-10 с антифибротическим эффектом снижалась при фиброзных состояниях, индуцированных TGF- 1 . Напротив, экспрессия мРНК I-10 увеличивалась при лечении ингибитором TGF- 1 (рис. 6F).
Рисунок 6. ПЦР в реальном времени показывает общую экспрессию мРНК 3D-чипа.Клетки высевали с плотностью 5×10 градусов на 3D-чип и стимулировали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформирующий фактор роста-)или 10 мкм ингибитора (SB431542) на 24 часа. Суммарная РНК, извлеченная из 3D-культивируемого чипа. Экспрессия мРНК (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 и (D)IL-8 отражает противовоспалительный эффект TGF{ {10}}(Трансформирующий фактор роста-)лечение. Экспрессия (E)VEGF как фактора ангиогенеза была увеличена. Экспрессия (F)IL-10 в качестве антифибротического фактора была значительно снижена под действием TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Трансформирующий фактор роста-).
