Текущий статус нейропротекции при врожденных пороках сердца. Часть 2.

Затем микроскопические изображения были подвергнуты расчету с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США). Сигнал Hsp60 умножали на «х».

Hsp60 — важная белковая молекула, играющая важную биологическую роль в организме человека. Исследования последних лет показали, что наличие Hsp60 тесно связано с памятью человека.

Hsp60 представляет собой молекулярный белок-шаперон, который в основном участвует в сворачивании, разворачивании, стабилизации и деградации белков. Эти процессы очень важны для нормального обмена веществ и клеточной функции организма человека. В то же время Hsp60 также обладает антиоксидантным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием и играет большую роль в поддержании здоровья человека и баланса иммунной системы.

Исследования показали, что Hsp60 играет решающую роль в формировании и поддержании памяти. В процессе обучения и памяти клетки мозга производят большое количество молекул Hsp60. Эти молекулы могут защищать клетки от вмешательства и повреждения внешней среды, обеспечивая плавный процесс обучения и памяти. Кроме того, Hsp60 также может влиять на мышление и поведение человека, изменяя передачу сигналов клетками головного мозга и развитие нейронов, а также оказывает положительное влияние на когнитивные функции и устойчивость к стрессу.

Хотя роль Hsp60 показала положительное влияние на организм человека, людям также необходимо осознавать, что как избыток, так и недостаток Hsp60 может иметь негативные последствия для здоровья человека. Поэтому нам следует активно исследовать и изучать механизм действия Hsp60 при различных физиологических и патологических состояниях организма человека, чтобы лучше понять положение и роль Hsp60 в здоровье человека. Видно, что нам необходимо улучшить память, а Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola обладает антиоксидантным, противовоспалительным и омолаживающим действием, что может помочь уменьшить окислительные и воспалительные реакции в мозге, тем самым защищая здоровье нервной системы. Кроме того, Cistanche Deserticola также может способствовать росту и восстановлению нервных клеток, тем самым улучшая связь и функцию нейронных сетей. Эти эффекты могут помочь улучшить память, способность к обучению и скорость мышления, а также предотвратить развитие когнитивной дисфункции и нейродегенеративных заболеваний.

Нажмите «Знать», чтобы улучшить кратковременную память.

Значение «х» определяли следующим образом: вычитание сигнала Hsp60, свернутого в «х», из сигнала митохондриальной ДНК в контрольной группе делало значение митохондриальной ДНК меньшим или равным нулю. Сигнал гистона H2B был умножен на «y».

Значение «y» определяли следующим образом: вычитание сигнала «y»-свернутого гистона-H2B из сигнала ядерной ДНК в контрольной группе делало значение ядерной ДНК меньше или равным нулю. Если фоновый сигнал становится высоким в результате умножения, контраст умноженного изображения можно отрегулировать для одинаковых условий во всех образцах.

Изображение окрашивания дцДНК за вычетом скорректированного изображения размноженного Hsp60 и гистона H2B использовалось для последующего анализа. С помощью функции «Adjust-Threshold» эти изображения были бинаризированы. Были выбраны точки дцДНК размером от 2 до 20 мкм2 (округлость 0,1–1,0) и подсчитаны с помощью функции «Анализ-Анализ частиц».

2.3. Электронная микроскопия

За день до трансфекции клетки HeLa высевали с плотностью 600 клеток/мкл. Экспрессию представляющих интерес генов подавляли в клетках HeLa с использованием миРНК Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) в реагенте для трансфекции липофектамина RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкции производителя (с конечной концентрацией РНК 10 нМ).

Через четыре дня после нокдауна siRNA клетки подвергали фиксации. Образцы клеточных культур фиксировали 2% PFA и 2% глутаральдегидом в 0.1 М фосфатном буфере, pH 7,4, при 37 ◦C, затем помещали в 4 ◦C в холодильнике на 30 мин. Образцы фиксировали в 2% глутаральдегиде в фосфатном буфере 0,1 М в течение ночи при 4 ◦С. Образцы трижды промывали 0,1 М фосфатным буфером в течение 30 мин и постфиксировали 2% тетроксидом осмия в 0,1 М фосфатном буфере при 4 ◦С в течение 1 часа.

Образцы представляли собой обезвоженные инградированные растворы этанола, перенесенные на смолу (Quetol-812, Nisshin EM Co., Токио, Япония) и полимеризованные при 60 ◦C в течение 48 часов. Полимеризованные смолы разрезали на ультратонкие 70-нм срезы алмазным ножом с использованием ультрамикротома (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Ветцлар, Германия) и затем монтировали на медные сетки.

Срезы окрашивали 2% уранилацетатом при комнатной температуре в течение 15 минут и промывали дистиллированной водой с последующим вторичным окрашиванием раствором для окрашивания свинцом (Sigma-Aldrich, Токио, Япония) при комнатной температуре в течение 3 минут.

Сетки наблюдались под просвечивающим электронным микроскопом (JEM-1400Plus, JEOL Ltd..(Токио, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ (мозг рыбки данио) или 100 кВ (клетка), а изображения записывались с помощью камеры с зарядовой связью (CCD) (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Иммуноэлектронная микроскопия

Образцы на золотых дисках замораживались в жидком пропане при температуре -175 ◦С. После замораживания образцов их замораживали 1% дубильной кислотой в этаноле и 2% дистиллированной водой при -80 ◦C в течение 24 часов.

Затем образцы хранили при температуре -20 ◦C в течение 4 часов с последующей инкубацией при 4 ◦C в течение 1 часа. Далее образцы обезвоживали в безводном этаноле 3 раза по 30 мин. каждый раз с последующей инфильтрацией смесью этанола и смолы в соотношении 50:50 (LR white: London Resin Co. Ltd., Беркшир, Великобритания) при 4 ◦C в течение 1 часа. Образцы переносили в свежую 100% смолу и инкубировали при 4 ◦C в течение 30 мин, этот процесс повторяли трижды.

Образцы переносили на свежую 100% смолу и полимеризовали при 50 ◦CO/N. Полимеризованные смолы получали ультратонкие срезы при 90 нм алмазным ножом с использованием ультрамикротома (Ultracut UCT; Leica), и срезы помещали на никелевые сетки. Сетки инкубировали с антителом против дцДНК (ДНК 35I9) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) в 1% BSA/PBS при 4°CO/N, с последующими тремя промываниями 1% BSA/PBS по 1 мин.

Затем их инкубировали со вторичным антителом, конъюгированным с частицами золота {{0}} нм (поликлональное антитело козы против мышиного IgG) в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывки PBS сетки помещали в 2%-ный глутаральдегидеин-0,1 М какодилатный буфер.

После этого сетки сушили, а затем окрашивали 2%-ным уранилацетатом в течение 15 минут и раствором свинцового красителя (Sigma-Aldrich) при комнатной температуре в течение 3 минут. Сетки наблюдали через просвечивающий электронный микроскоп (JEM-1400). плюс JEOLLtd.) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Цифровые изображения получали с помощью камеры CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Результаты

3.1. Снижение TFAM или GBA вызывает увеличение эктопической митохондриальной ДНК

Во-первых, мы показали пример обнаружения цитоплазматической ДНК, полученной из митохондрий, в клетках HeLa, в которых белок TFAM был сбит миРНК (рис. 1А). TFAM является ключевым фактором транскрипции митохондрий, а также участвует в репликации и репарации митохондриальной ДНК [20]. .

Сообщается, что полиморфизм последовательности этого гена связан с болезнью Паркинсона [21,22]. Через 3 дня нокдауна белка TFAM в цитоплазме клеток HeLa было обнаружено множество точек двухцепочечной ДНК.

Гистоны являются положительными маркерами ДНК ядерного происхождения в цитоплазме и отрицательными маркерами митохондриальной ДНК и ДНК митохондриального происхождения в цитоплазме [23]. Эти точки не локализовались совместно с гистонами, что позволяет предположить, что они не являются ДНК ядерного происхождения. Более того, некоторые из этих цитоплазматических эктопических точек ДНК не локализовались совместно с Hsp60, маркером митохондриального матрикса, что указывает на то, что они находились вне митохондрий (рис. 1B, C).

Электронная микроскопия также показала, что эктопическая ДНК вытекла из митохондрий (рис. 2А, Б). Таким образом, увеличение количества эктопических точек ДНК в цитоплазме в результате нокдауна TFAM было связано с утечкой митохондриальной ДНК из митохондрий. Во-вторых, мы показали еще один пример обнаружения цитоплазматической ДНК, полученной из митохондрий, в клетках HeLa, в которых белок GBA был нокдаун миРНК. (Рисунок 1А).

GBA является геном, вызывающим болезнь Гоше, но гетерозиготная мутация GBA также является фактором риска болезни Паркинсона [24]. Через 3 дня нокдауна белка GBA в цитоплазме клеток HeLa было обнаружено множество точек двухцепочечной ДНК. Некоторые точки ДНК были локализованы совместно с гистонами, что позволяет предположить, что они были ДНК ядерного происхождения.

Другие точки ДНК не были локализованы совместно с гистонами, что позволяет предположить, что они не были ДНК ядерного происхождения, а ДНК митохондриального происхождения (рис. 1D). Таким образом, увеличение количества эктопических точек ДНК в цитоплазме в результате нокдауна GBA было, по крайней мере, частично связано с утечкой митохондриальной ДНК из митохондрий.

For more information:1950477648nn@gmail.com