Текущий статус нейропротекции при врожденных пороках сердца. Часть 1.

Абстрактный:

Присутствие эктопической ДНК в цитоплазме вызывает воспаление и гибель клеток. Широко сообщалось, что утечка ядерной ДНК в цитоплазму может быть обнаружена главным образом с помощью циклической GMP-AMP-синтазы (cGAS).

ДНК — это молекула, которая определяет генетическую информацию каждого человека и содержится в каждой нашей клетке. Недавние исследования показывают, что ДНК может проникать в цитоплазму определенными путями и влиять на нашу память.

Это явление часто встречается у пожилых людей и людей с когнитивными нарушениями. Когда ДНК попадает в цитоплазму, это мешает нормальным функциям клетки и увеличивает риск потери памяти и когнитивных нарушений.

Однако нам не следует впадать в депрессию и безнадежность по этому поводу. Есть много способов улучшить память и когнитивные способности, которые помогут нам сохранить здоровье мозга.

Во-первых, вы должны вести здоровый образ жизни. Это включает в себя сбалансированное питание, достаточный сон, умеренные физические нагрузки и снижение стресса. Эти практики способствуют здоровью мозга, тем самым предотвращая утечку ДНК и улучшая память.

Во-вторых, необходима когнитивная тренировка. Это может включать в себя математические игры, чтение, изучение новых навыков и т. д. Эти занятия могут помочь стимулировать мозг и стимулировать нейрогенез, чтобы избежать утечки ДНК.

Наконец, сохраняйте позитивный настрой. Эмоциональная нестабильность и чрезмерный стресс могут вызвать изменения в химии мозга, которые способствуют утечке ДНК. Поэтому нам нужно научиться позитивно решать жизненные проблемы и сохранять оптимистический настрой.

Таким образом, хотя утечка ДНК в цитоплазму может повлиять на память, мы можем улучшить здоровье мозга, избежать утечки ДНК и, в конечном итоге, улучшить нашу память, приняв правильный образ жизни, занимаясь когнитивными тренировками и поддерживая позитивный настрой. Память и когнитивные способности. Видно, что нам необходимо улучшить память, а цистанхе пустынный может значительно улучшить память, потому что цистанхе пустынный — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность Cistanche Deserticola обусловлена ​​множеством содержащихся в нем активных ингредиентов, включая дубильную кислоту, полисахариды, флавоноидные гликозиды и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными путями.

Нажмите «Узнай 10 способов улучшить память»

Недавно мы сообщили, что полученная из митохондрий цитоплазматическая двухцепочечная ДНК (дцДНК), которая избежала лизосомальной деградации, индуцирует значительную цитотоксичность в культивируемых клетках и in vivo. Предполагается, что цитоплазматическая митохондриальная ДНК участвует в различных заболеваниях и расстройствах, и публикуется все больше статей, подтверждающих это. С другой стороны, современный метод оценки митохондриальной ДНК в цитоплазме не может быть количественным.

Здесь мы подробно представляем метод оценки эктопических клеток митохондриальной ДНК. Этот метод полезен в фундаментальных исследованиях, а также при изучении старения, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, сердечной недостаточности, аутоиммунных заболеваний, рака и других состояний.

Ключевые слова: эктопическая ДНК; митохондриальная ДНК; митохондриальный транскрипционный фактор А (TFAM); болезнь Паркинсона.

1. Введение

ДНК содержит важную информацию для выживания и наследования, и ее необходимо защищать от различных стрессоров, включая оксиданты и мутагены. Эукариотические клетки содержат митохондрии, которые производят энергию вместе со многими активными формами кислорода посредством аэробного дыхания.

Таким образом, в эукариотической клетке ДНК существует в ядре или митохондриях, упакованных внутри ядерной мембраны или митохондриальной мембраны соответственно. Однако ДНК может присутствовать в цитоплазме при определенных условиях, например, во время вирусных или невирусных инфекций [1- 4].

Даже при некоторых неинфекционных состояниях (например, старении, различных возрастных заболеваниях или раке) ДНК может просачиваться в цитоплазму из ядра или митохондрий [5–7].

ДНК в цитоплазме может быть воспалительной и токсичной для клеток. Широко сообщалось, что утечка ядерной ДНК в цитоплазму вызывает воспаление, цитотоксичность и секреторный фенотип, связанный со старением (SASP), главным образом через стимулятор циклической GMP-AMP-синтазы (cGAS) пути генов интерферона (STING) [ 5,6].

Недавно мы сообщили, что цитозольная двухцепочечная ДНК (дцДНК) митохондриального происхождения, спасающаяся от лизосомальной деградации, индуцирует цитотоксичность и нейродегенерацию на клеточных моделях болезни Паркинсона [8]. Присутствие или увеличение такой эктопической ДНК часто указывалось на репрезентативных микроскопических изображениях и косвенных доказательствах, а не на увеличении утечки ДНК как таковой.

Ожидается, что оценка этой эктопической ДНК будет становиться все более важной не только для фундаментальных исследований, но и для исследований старения и других заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, сердечная недостаточность, аутоиммунные заболевания, диабет, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и рак. Сообщается, что путь cGAS-STING имеет решающее значение не только в старении, но и в патогенезе этих заболеваний [8–17].

Вероятно, из-за окислительных процессов вокруг митохондрий и отсутствия эффективной системы репарации митохондриальной ДНК, митохондриальная ДНК гораздо более восприимчива к мутациям или повреждениям, чем ядерная ДНК [18,19].

В отличие от ядерной ДНК, митохондриальная ДНК существует в нескольких копиях в одной клетке и синтезируется по мере необходимости. Следовательно, митохондриальная ДНК может иметь гораздо больше шансов попасть в цитоплазму во время старения или при злокачественных состояниях, таких как возрастные расстройства, митохондриальная дисфункция. , или рак.

Обнаружение и измерение такой цитоплазматической митохондриальной ДНК может иметь важное значение для понимания патогенеза различных заболеваний и старения и может стать биомаркером и терапевтической мишенью.

Мы разработали полуколичественный метод оценки эктопической митохондриальной ДНК, просачивающейся в цитоплазму, и здесь мы подробно описываем этот метод. Эта статья позволяет объективно оценить утечку митохондриальной ДНК и полезна при изучении различных патологий.

2. Материалы и методы

2.1. Клеточные линии, обработка миРНК и количественный ПЦР (кПЦР) анализ

Клетки HeLa были получены из клеток рака шейки матки пациентки (ATCC,CCL-2). Клетки HeLa культивировали при 37 ◦C в атмосфере 5% CO2 в модифицированной среде Dulbecco EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Киото, Япония) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biowest, Нуайе, Франция) и раствора пенициллина и стрептомицина ( 100 ЕД/мл пенициллина G и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина, Вако, Осака, Япония).

За день до трансфекции клетки HeLa высевали с плотностью 600 клеток/мкл. Экспрессию интересующих генов подавляли в клетках HeLa с использованием миРНК Stealth RNAi (митохондриальный транскрипционный фактор A, TFAM: HSS144251, глюкоцереброзидаза, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Уолтем, Массачусетс, США) в реагенте для трансфекции липофектамина RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкции производителя (конечная концентрация РНК 10 нМ).

Через три дня после нокдауна siRNA суммарную клеточную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher Scientific). Шаблоны кДНК были синтезированы из очищенной РНК с использованием набора для синтеза ДНК ProtoScript II First StrandcDNA (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) с олиго(dT)20-праймерами. КПЦР выполнялась с использованием TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu). , Япония) и анализировали с помощью термоциклера Dice Real Time System Lite (Takara Bio). В настоящем исследовании использовались следующие праймеры для ПЦР: прямой GBA (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), обратный GBA (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), прямой TFAM (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), обратный TFAM (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), прямой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) и GAPD. Ч обратный (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 9.3.1 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Двусторонние t-критерии Стьюдента использовались для сравнения средних арифметических значений между двумя группами. Данные представлены как средние значения и ± стандартные ошибки средних.

2.2. Иммунофлуоресцентное обнаружение эктопической митохондриальной ДНК и анализ изображений

За день до трансфекции клетки HeLa высевали с плотностью 600 клеток/мкл. Экспрессию представляющих интерес генов подавляли в клетках HeLa с использованием миРНК Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) в реагенте для трансфекции липофектамина RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) в соответствии с инструкции производителя (конечная концентрация РНК 10 нМ).

Через три дня после нокдауна siRNA клетки подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию. Для обнаружения митохондриальной ДНК используйте антитело против дцДНК (Abcam, Кембридж, Великобритания, клон 35I9, номер по каталогу ab27156, RRID: AB_470907 или EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США, клон AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) показал лучшее соотношение сигнал/шум, чем Hoechst 33258, DAPI или Picogreen. Здесь мы объединили три первичных антитела: антитело против дцДНК (ДНК 35I9) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), антитело против гистона-H2B (Abcam, Cat# ab134211) и анти-тепловое антитело. антитело к шок-белку-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Можно выбрать другие антитела или флуоресцентно пометить их гистоном, либо альтернативно использовать Hsp60, но необходимо оптимизировать условия тройного окрашивания для каждой комбинации.

Клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали ледяным метанолом в течение 10 мин при 4 ◦C. Альтернативно для фиксации можно использовать 4% параформальдегид (PFA), но фоновые сигналы кажутся намного выше в образцах, фиксированных PFA. После фиксации клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером с Твином 20 (PBST) по 5 мин каждый. Клетки пермеабилизировали PBS, содержащим 0,2% (мас./об.) Тритона X-100, в течение 10 мин.

После трехкратной промывки PBST по 5 минут каждый раз клетки инкубировали с 2% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBST в течение 30 мин. Клетки инкубировали с одним первичным антителом, антителом против гистона-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211), разведенным в 2% (мас./об.) BSA в PBST O/N при 4°C. После трехкратной промывки PBST по 5 минут каждый раз клетки инкубировали с Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) }}) разводят в 2% (мас./об.) БСА в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре (RT).

После трехкратной промывки PBST по 5 минут каждый раз клетки инкубировали с первичными антителами и антителом против дцДНК (ДНК 35I9) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) и анти-дцДНК. -Антело Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444), разведенное в 2% (мас./об.) BSA в PBST, наносили на 1 час при комнатной температуре или на ночь (0/N) при 4◦С.

После трехкратной промывки PBST по 5 минут каждый раз клетки инкубировали с высоко перекрестно адсорбированным конъюгированным с Alexa Fluor 680- ослиным анти-кроличьим IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, кат. номер A10043). , RRID: AB_2534018) ​​и Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073), разведенные в 2% (мас./об.) BSA в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре.

Клетки трижды промывали PBST по 5 мин каждый раз и образец анализировали с помощью конфокального микроскопа A1R+ (Nikon, Токио, Япония).

For more information:1950477648nn@gmail.com