Эффективность и безопасность пиноцембрина на модели блеомицин-индуцированного легочного фиброза у овец

Контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный

Главнаяфлавоноид, пиноцембрин, как полагают, имеет множество медицинских применений, которые связаны с его заявленным антиоксидантом,противовоспалительное средство, противомикробные и противораковые свойства. Некоторые исследования показали, что этот флавоноид обладает антифиброзной активностью. В этом исследовании мы исследовали, будет ли пиноцембрин препятствовать фиброзу, ослаблять воспаление и улучшатьлегкоефункционируют в модели легочного фиброза на крупных животных. Фиброз индуцировали в двух локализованных сегментах легкого у каждой из 10 овец, участвовавших в исследовании. Это было достигнуто с помощью двух инфузий блеомицина, доставленных бронхоскопически с двухнедельным интервалом. Другой сегмент легкого той же овцы не подвергали лечению и использовали в качестве здорового контроля. Животных содержали немногим более 5 недель после последней инфузии блеомицина. Пиноцембрин, выделенный из листьев эвкалипта, вводили в один из двух пораженных блеомицином сегментов легкого в дозе 7 мг. Эта доза вводилась один раз в неделю в течение 4-недель, начиная с одной недели после последней инфузии блеомицина. Податливость легких (как мера жесткости) значительно улучшилась после четырех еженедельных введений пиноцембрина в сегменты легких, поврежденные блеомицином. Было значительно меньшее количество нейтрофилов и воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже сегментов легких, обработанных блеомицином, которые лечили пиноцембрином. По сравнению с пораженными блеомицином сегментами легких без медикаментозного лечения введение пиноцембрина было связано со значительно меньшим количеством иммунопозитивных CD8t и CD4 плюс Т-клеток в паренхиме легких. Данные оценки гистопатологии показали, что лечение пиноцембрином было связано со значительным уменьшением воспаления и общей оценки патологии. Гидроксипролиновый анализ показал, что введение пиноцембрина не снижало повышенное содержание коллагена, вызванное блеомицином в этой модели. Анализ срезов, окрашенных трихромом Массона, показал, что лечение пиноцембрином значительно снижает содержание соединительной ткани в сегментах легких, подвергшихся воздействию блеомицина, по сравнению с легкими, обработанными блеомицином, которые не получали пиноцембрин. Поразительные противовоспалительные и умеренные антифиброзные ремоделирующие эффекты введения пиноцембрина, вероятно, были связаны со способностью соединения улучшать патологию легких и функциональную податливость в этой животной модели легочного фиброза.

Нажмите, чтобы узнать больше информации

Введение

Главнаяфлавоноид, пиноцембрин, был идентифицирован и выделен из ряда видов растений. Считается, что эта биоактивная молекула имеет множество медицинских применений, связанных с заявленным антиоксидантом,противовоспалительное средство, противомикробные и противораковые свойства [1-7]. Важно отметить, что было показано, что пиноцембрин обладает антифибротическими свойствами на ряде различных животных моделей заболевания. Например, пиноцембрин снижает фиброз желудочков [8] в крысиной модели депрессии и снижает предсердный фиброз в крысиной модели инфаркта миокарда [9]. Точно так же в экспериментальной крысиной модели индуцированного хлороформом фиброза печени пероральное введение пиноцембрина снижало экспрессию коллагена и альфа-SMA (используемого в качестве маркера дифференцировки миофибробластов) в качестве показателей фиброза [10]. Недавнее исследование продемонстрировало

Пиноцембрин облегчает индуцированный блеомицином фиброз кожи у мышей и подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию келоидных фибробластов и первичных дермальных фибробластов мышей in vitro [11]. Пиноцембрин индуцировал эти антифибротические эффекты посредством подавления сигнальных путей NF-x и TGF- 1/Smad [10,11].

Учитывая известные антифибротические эффекты пиноцембрина, мы стремились выяснить, будет ли пиноцембрин препятствовать фиброзу и улучшатьфункция легкихв модели легочного фиброза на крупных животных. Физиологически и фармакологически релевантная модель легочного фиброза была разработана в качестве средства для исследования основного механизма (механизмов) заболевания при идиопатическом легочном фиброзе (ИЛФ) [12,13]. Это также было полезно для тестирования новых методов лечения легочного фиброза [14-16].

Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) представляет собой разрушительное хроническое заболевание легких, характеризующееся прогрессирующим рубцеванием легких из-за обильного накопления внеклеточного матрикса (ECM) в паренхиме легких [17]. Прогноз при ИЛФ очень плохой: медиана выживаемости пациентов после постановки диагноза составляет всего 3-5 лет [18]. Текущие доступные фармакологические методы лечения ограничены пирфенидоном и нинтеданибом, препаратами, которые, как было показано, только замедляют прогрессирование заболевания, не останавливая его. Кроме того, существуют значительные побочные эффекты, связанные с этими двумя препаратами. Поэтому существует неудовлетворенная потребность в новых эффективных методах лечения этого состояния.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить терапевтическую эффективность и безопасность пиноцембрина на овечьей модели легочного фиброза, вызванного блеомицином, разработанной в нашей лаборатории (12). В частности, было проведено исследование, чтобы установить, значительно ли местное введение пиноцембрина в легкие ослабляет фиброз, воспаление и гистопатологию в определенных сегментах легких после индукции фиброза блеомицином. Важно отметить, что мы определили, значительно ли местное введение пиноцембрина улучшает физиологическую функцию определенных сегментов легких с блеомицин-индуцированным фиброзом.

материалы и методы

Индукция фиброза в сегментах легкого овцы

В этом исследовании мы использовали в общей сложности 10 овец. Мы индуцировали фиброз в двух сегментах легких каждой овцы аналогично нашим предыдущим исследованиям [12,13]. Используя эту установленную процедуру (подробности см. ниже), фиброз был ограничен небольшими изолированными областями в легких, оставляя оставшиеся 90-95 процента здоровых незатронутых легких для выполнения нормальной дыхательной функции.

Всем овцам в исследовании вводили 2 однократные дозы блеомицина (3 единицы) на сегмент легкого с интервалом в 2 недели, и животных содержали чуть более 5 недель после введения последней дозы блеомицина. Процедура введения включала введение бронхоскопа в сегменты легкого. в правое и левое легкое, а затем через порт для биопсии бронхоскопа медленно вводят блеомицин в два сегмента, как показано на рис. 1.

Время инфузий блеомицина, забор крови, забор бронхоальвеолярного лаважа, тестирование функции легких и применение пиноцембрина подробно описаны на Eig2. Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены комитетом по этике животных Мельбурнского университета (идентификационный номер одобрения этики животных: 2015209.1). Эти экспериментальные процедуры и сроки, связанные с работой с животными, были разработаны, чтобы облегчить и свести к минимуму страдания овец, используемых в исследовании. В частности, количество бронхоскопических процедур было сокращено до минимума, что позволило бы успешно интерпретировать данные.

Выделение и структурное подтверждение пиноцембрина

Пиноцембрин очищали из метанольных экстрактов листьев, собранных с трехлетнего Eucalyptus pressiana subsp. pressiana были выращены на экспериментальном участке в кампусе Дуки Мельбурнского университета (36 градусов 23'3" ю.ш., 145 градусов 42'52" в.д.). Семена, приобретенные у компании Nindethana Seed Company (Кинг-Ривер, Австралия), были собраны в Вуденеллупе, Западная Австралия, а сеянцы были выращены и пересажены на участок, как описано в [19]. Образцы листьев высушивали в печи при 5{{40}} градусах в течение 48 часов, а затем измельчали ​​в мелкий порошок с помощью мельницы IKA MF10 с сеткой 1 мм. Измельченную ткань (100 г) помещали в целлюлозные наперстки Kinesis XK (Antylia Scientific, Чикаго, США) и подвергали экстракции по Сокслету 100% MeOH (200 мл) в течение 8 часов. Экстракты MeOH затем концентрировали примерно до 50 мл с помощью роторного испарителя. Аликвоты концентрированных экстрактов (2 мл) подвергали флэш-хроматографии на системе Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Швейцария), снабженной картриджем FlashPure C18 RP-WP 12 г (Buchi). Используемая система растворителей представляла собой градиент ацетонитрила (MeCN) и воды из 30-100 процентов MeCN в течение 5 минут с временем уравновешивания 1 минута (S1, рис.). Фракцию, содержащую пиноцембрин, обнаруживали при 283 нм и собирали. Фракции из нескольких экспресс-прогонов объединяли, MeCN удаляли с помощью роторного испарителя, а пиноцембрин сушили с помощью лиофилизации. Структура пиноцембрина была подтверждена с помощью ESI-LCMS и ЯМР-спектроскопии, как описано в [19], в сравнении с коммерческим стандартом (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США). Пиноцембрин: бледно-желтые кристаллы из MeCN/H, O.UVλmax MeCN (нм) ∶ полоса I325 нм, полоса II289 нм. 'H ЯМР (600 МГц, CDCl) ∶ δ 5,36 (1H, дд, J13,0, 3,0 Гц, H-2), δ2,76 (1H, дд, J17,1, 3,1 Гц, H{ {51}}a）,δ3,02（1H,dd,J17.1,13,1 Гц,H-3b）,δ5,92（1H,d,2,2Гц,H-6）, δ5,94 (1H, d, 2,2 Гц, H-8). ESI-MS (фрагментатор 150 В, скиммер 65 В) m/z (отн. инт. процент): 255,0673 ([MH], 100), 213,0565 ([M-42-H],19), 151,0037([M-104-H],16),257,0811([M плюс H],100),153,0167([M-104 плюс H], 2). Массовая чистота выделенного пиноцембрина была количественно определена как минимум 96 процентов с использованием ВЭЖХ-PDA по сравнению с коммерческим стандартом (S2A и S2B Fig).

Введение пиноцембрина в сегменты легкого овцы

На каждую неделю режима дозирования 7 мг пиноцембрина вводили в один каудальный сегмент легкого каждой овце, проходящей испытание (рис. 1). Эта весовая доза пиноцембрина была основана на ранее опубликованном исследовании, которое показало, что 50 мг пиноцембрина на кг массы тела были наиболее эффективной дозой для облегчения симптомов заболевания в этой модели животных [20]. Доза пиноцембрина 7 мг учитывала тот факт, что только приблизительно 150 г сегмента легкого на овцу обрабатывались дозой ~50 мг/кг. Биоактивное вещество растворяли в 10-процентном ДМСО и вводили один раз в неделю в течение четырехнедельного периода, как показано на рис. 2. В целях контроля сегмент легкого в противоположном легком использовали в качестве блеомицин-положительного, без лекарственного средства, контроля. , как показано на рис. 1. Биоактивные молекулы в носителе вводили в виде инфузий по 5 мл через биопсийный порт бронхоскопа. Обратите внимание, что для устранения любых небольших различий (например, физиологических или анатомических и т. д.) между левым и правым легкими инфузии пиноцембрина были рандомизированы между левым и правым каудальными сегментами легкого. Половине животных (n=5 овец) вводили пиноцембрин в правые каудальные сегменты легкого, а другой (n=5 овцам) вводили пиноцембрин в левые каудальные сегменты легких. Правый медиальный сегмент легкого оставили необработанным и использовали для контрольной ткани здорового легкого, образец которой был взят при вскрытии (рис. 1).

Процедуры забора проб бронхоальвеолярного лаважа

Для каждого из бронхоальвеолярных (БАЛ) образцов в моменты времени, указанные на рис. 2, эндоскопом манипулировали в конкретном сегменте легкого для взятия образцов, обычно проходя примерно через 3-4 ветви дыхательных путей. Для отбора проб БАЛ 10 мл стерильного физиологического раствора вводили через биопсийный порт эндоскопа в конкретный сегмент легкого, а затем набирали в шприц через тот же порт. Эта процедура позволила восстановить от 3 до 5 мл жидкости БАЛ. Метод отбора проб собирал клетки для анализа из мелких дыхательных путей и альвеолярных просветов определенного сегмента легкого, к которому направлялся бронхоскоп. Клетки БАЛ из каждого сегмента центрифугировали на предметных стеклах и окрашивали для дифференциального подсчета воспалительных клеток с помощью Hem-Quik, как описано ранее [13].

Тестирование и анализ функции легких

Функцию легких измеряли в описанных сегментах легких в моменты времени, указанные на фиг. 2. Функцию легких оценивали во всех испытуемых сегментах легких (левая и правая каудальные доли и медиальная доля у каждой овцы). Функциональную емкость сегментов легкого измеряли через эндоскоп по опубликованной методике [12,13]. Параметр функции легких, оцениваемый в этом исследовании, назывался растяжимостью в легочном сегменте (сокращенно Cseg). В общем, податливость является мерой того, насколько легко раздуть легкое. Плохо податливое легкое называется жестким легким, которое обычно труднее надуть.

Забор крови

Цельную кровь собирали на исходном уровне перед индукцией фиброза и в конце эксперимента перед эвтаназией экспериментальных животных, как показано на фиг. 2, путем забора крови из яремной вены в пробирку, содержащую гепарин. Кровь была обработана для анализа клеток крови.

Выделение и анализ легочной ткани

Овец подвергали эвтаназии чуть более чем через 5 недель после введения последней дозы блеомицина (начало 12-й недели), как показано на рис. 2. Эвтаназию индуцировали передозировкой барбитуратов внутривенно в мл на 2 кг массы тела в соответствии с рекомендациями производителя (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd.). Затем отдельные сегменты надували смесью 1:1 OCT (Optimal Cutting Temperature, Tissue-Tek) и стерильного раствора PBS под давлением примерно 20 см/ч, O[13].Несколько последовательных поперечных срезов надутый сегмент фиксировали в 10-процентном нейтральном забуференном формалине и обрабатывали в парафине для гистопатологической оценки.Остальные срезы легких заливали в ОКТ и замораживали в криоформах на алюминиевых лодочках, плавающих в жидком азоте.

Срезы ткани, залитые парафином (5 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином Y (H&E) для общей гистологии и окрашивали трихромом по Массону для выявления изменений содержания коллагена в паренхиме легких.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимическую локализацию CD4* и CD8 Т-лимфоцитов проводили на замороженных срезах. Срезы легочной ткани (5 мкм) фиксировали ледяным этанолом; эндогенные пероксиды блокировали раствором H, O, после чего срезы инкубировали с первичными антителами (моноклональными мышиными анти-CD4 (чистыми) и моноклональными мышиными анти-CD8 (чистыми)) во влажной камере в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубации с первичными антителами

затем срезы трижды промывали PBS и инкубировали со вторичным антителом (кроличьи антимышиные IgG (HRP) (ab6728)) (1:100; Abcam, Мельбурн, Австралия) в течение 1 часа при комнатной температуре. Для проверки специфичности во время IHCrun были включены изотипические контроли с использованием биологически нерелевантных антител SBU-3 того же изотипа. Срезы контрастно окрашивали раствором гематоксилина Майера в течение 20 секунд. Комплекс антиген-антитело визуализировали с помощью 3,3'-диаминобензидина. Наконец, срезы обезвоживали этанолом, очищали ксилолом и помещали в DPX.

Оценка гистопатологии

Гистопатологию паренхимы легкого оценивали с использованием полуколичественной системы оценки, как описано ранее [12,13]. Вкратце, все гистологические препараты были слепыми, чтобы эксперт не знал группы лечения. Для каждого среза, окрашенного H&E, 10 последовательных неперекрывающихся полей при увеличении x200 оценивались на основе критериев оценки фиброза, воспаления и общей оценки патологии, как сообщалось ранее [12,13]. Области были выбраны вдали от крупных дыхательных путей и крупных кровеносных сосудов. Затем баллы по всем десяти полям усреднялись, чтобы получить репрезентативные баллы для параметров, оцениваемых в сегменте секционированного легкого.

Анализ концентрации белка коллагена с использованием анализа гидроксипролина использовался для экстраполяции содержания коллагена и концентрации каждого сегмента, как описано ранее (4,5). Вкратце, замороженные ткани легких из каждого сегмента лиофилизировали до сухого веса, гидролизовали в 6M HCl и оценивали на содержание гидроксипролина путем измерения поглощения восстановленных образцов (в 0.1M HCl) при 558 нм с использованием Beckman. Спектрофотометр DU-64 (Beckman Coulter Inc, Бреа, Калифорния). Содержание гидроксипролина определяли по стандартной кривой транс-L-гидрокси-L-пролина (Sigma-Aldrich). Содержание коллагена экстраполировали путем умножения измерений гидроксипролина на 6,94 (на основе гидроксипролина, составляющего ~14,4% аминокислотного состава коллагена в большинстве тканей [21]), а затем выражали как долю сухой массы ткани, чтобы получить концентрацию коллагена (которая выражается в процентах).

Анализ содержания соединительной ткани для оценки степени фиброза определяли количественно путем оценки изменений общего содержания соединительной ткани в пределах паренхиматозной ткани с использованием ранее описанного метода [13]. Для выполнения этого анализа парафиновые срезы тканей легких овец окрашивали с использованием трихромного красителя Массона, который окрашивает соединительную ткань в синий цвет. Впоследствии изображения среза легкого, окрашенного трихромом Массона, были получены с помощью цифровой камеры, соединенной с микроскопом и компьютером. Десять полей были случайным образом захвачены при увеличении x400, за исключением крупных кровеносных сосудов и бронхов. Затем изображения были проанализированы с помощью Image-Pro Plus (версия 6.3 для Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Мэриленд, США) с использованием инструмента выбора цвета для измерения площади окрашенных в синий цвет тканей (коллагена и других соединительных тканей) в каждом поле. зрения. Затем значения для каждого из десяти изображений усреднялись для каждого слайда. Долю окрашенной в синий цвет площади ткани выражали в процентах от общей площади поля (процент площади окрашенной в синий цвет ткани на общую площадь поля). Захват изображения и анализ выполнялись вслепую на закодированных слайдах.

статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism для Windows версии 5.01 (Graph-Pad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Параметры оценивались по Гауссу

распределение с использованием нормальности Д'Агостино и комплексного теста Пирсона. Для параметрических данных были проведены парные двусторонние t-критерии для сравнения между сегментами легких, которым вводили только блеомицин, с контрольными сегментами, которым вводили физиологический раствор, и сегментами легких, которые получали инфузию блеомицина и пиноцембрина. Для данных, которые не соответствовали предположениям о распределении Гаусса, использовался критерий знакового ранга Уилкоксона для сопоставленных пар. Во всех случаях р-значение менее 0,05 определялось как значимое различие. Все значения представлены как средние значения (± SEM).

Полученные результаты

Здоровье животных и безопасность введения пиноцембрина

Медицинские осмотры регулярно проводились в течение всего периода лечения и испытаний до эвтаназии. Это было сделано для того, чтобы убедиться, что лечение пиноцембрином не вызвало неблагоприятных проблем со здоровьем или неблагоприятных побочных эффектов у овец, проходящих испытания. Все животные оставались здоровыми на протяжении всего периода лечения пиноцембрином (с 8-й по 12-ю неделю, рис. 2). В течение этого периода животные продолжали прибавлять в весе в ожидаемом нормальном диапазоне для этих овец, имели нормальное количество лейкоцитов, и не было других неблагоприятных событий для здоровья.

Введение пиноцембрина улучшает снижение функции легких, связанное с развитием блеомицин-индуцированного легочного фиброза.

На рис. 3 показана функция легких различных сегментов легких после еженедельного лечения пиноцембрином в течение четырех недель. Измеряемым параметром функции легких была растяжимость в локальных сегментах легкого, и ее называют сегментарной растяжимостью (Cseg). Как правило, более низкие уровни податливости означают более плохую функцию в сегменте легкого (т. е. его труднее раздувать, а легкое жестче). Как и ожидалось, сегменты легких, которые получали только повреждающий агент блеомицин без пиноцембрина, имели значительно более низкую среднюю растяжимость сегментов, чем необработанные здоровые контрольные сегменты легких (рис. 3А). Сегменты легкого, которые получали повреждающий агент блеомицин с введением пиноцембрина, имели более высокую среднюю сегментарную податливость, которая существенно не отличалась от необработанных здоровых контрольных сегментов легких (рис. 3А). Другой используемой оценкой функции легких было процентное изменение растяжимости по сравнению с исходным уровнем (Eig 3C). Это измеряло изменение комплаентности от начала исследования (до лечения блеомицином и пиноцембрином) до завершения последнего лечения пиноцембрином. Оценка показала, что растяжимость сегментов легких, обработанных пиноцембрином, значительно улучшилась после еженедельного введения пиноцембрина в течение 4-недельного периода лечения (рис. 3C).

Введение пиноцембрина снижает индуцированное блеомицином накопление воспалительных клеток в жидкости БАЛ.

На рис. 4 показаны данные о клетках БАЛ после еженедельной инфузии пиноцембрина в течение 4-недельного периода лечения. Клетки БАЛ брали из сегментов легких в течение 12-й недели исследования, за два дня до выбраковки овец. Количество клеток, оцененное в жидкости БАЛ, представляло собой только нейтрофилы и сумму основных воспалительных клеток, включая нейтрофилы, эозинофилы и лимфоциты. Как и ожидалось, здоровые сегменты легкого контрольной группы, которые не подвергались лечению, имели относительно небольшое количество воспалительных клеток в жидкости БАЛ (рис. 4).

Напротив, сегменты легкого, поврежденные блеомицином без пиноцембрина, имели значительно большее количество нейтрофилов и других воспалительных клеток в БАЛ по сравнению со здоровыми контрольными сегментами (рис. 4). Сегменты легких, которые получали повреждающий агент блеомицин и подвергались лечению пиноцембрином, показали значительно более низкие количества нейтрофилов и воспалительных клеток по сравнению с количеством клеток, взятых из сегментов легких, которые получали только блеомицин без пиноцембрина (рис. 4).

Влияние пиноцембрина на паренхиматозные Т-клетки легких

На фиг.5 показаны данные Т-клеток после четырех инфузионных обработок пиноцембрином, вводимых один раз в неделю. Т-клетки оценивали в паренхиме дифференцированно обработанных сегментов легких, образцы которых брали при вскрытии (12-я неделя). Как и ожидалось, здоровые контрольные сегменты легких, которые не подвергались лечению, имели относительно низкое количество CD8t и CD4* Т-клеток в паренхиме легких (рис. 5).

Напротив, сегменты легкого, поврежденные блеомицином, без обработки пиноцембрином, имели значительно более высокие количества Т-клеток CD8 и CD4* в паренхиме легких по сравнению со здоровыми контрольными сегментами (рис. 5). Сегменты легких, которые получали повреждающий агент блеомицин и подвергались обработке пиноцембрином, показали значительно более низкие количества CD8t и CD4 плюс Т-клетки в паренхиме легких по сравнению с количеством клеток, взятых из сегментов легких, которые получали только блеомицин без пиноцембрина (рис. 5). ).

каждый проверенный параметр (Eig⑥). Важно отметить, что сегменты легкого, которые получали повреждающий агент блеомицин и лечились пиноцембрином, имели более низкие средние баллы по каждому оцениваемому параметру (рис. ⑥). Лечение пиноцембрином значительно уменьшило воспаление и общую оценку патологии по сравнению с сегментами, которые получали только инфузию блеомицина (рис. 6). В то время как сегменты легкого, которые получали инфузию блеомицина и пиноцембрина, имели более низкие показатели фиброза по сравнению с сегментами, которые получали инфузию только блеомицина, разница не была статистически значимой (рис. 6).

Влияние пиноцембрина на содержание соединительной ткани

Микроскопические наблюдения срезов, окрашенных трихромом по Массону, показали, что лечение пиноцембрином уменьшало количество соединительной ткани, вызванное инфузией блеомицина (рис. 7А). EigZB показывает данные по проценту площади соединительной ткани, окрашенной трихромом по Массону, после четырех еженедельных обработок пиноцембрином. Данные на фиг. 7B показали, что обработка пиноцембрином значительно снижала процент синего окрашивания в сегментах легких, подвергшихся воздействию блеомицина, по сравнению с легкими, обработанными блеомицином, которые не подвергались обработке пиноцембрином (рис. 7B). На рис. ZC показаны данные анализа гидроксипролина на содержание коллагена после четырехнедельного лечения пиноцембрином. Данные на фиг. 7C были получены от всех 10 животных в испытании и показали, что инфузия только блеомицина (без пиноцембрина) значительно повышала концентрацию белка коллагена по сравнению с соответствующими измерениями здоровых контрольных сегментов легких, которые не получали ни блеомицин, ни пиноцембрин. Однако введение пиноцембрина не уменьшало индуцированное блеомицином увеличение концентрации коллагена (рис. 7С).

Обсуждение

В этом исследовании использовалась физиологически и фармакологически значимая модель легочного фиброза на овцах [12,13] для подтверждения эффективности пиноцембрина. В целом мы обнаружили, что лечение пиноцембрином эффективно уменьшало экспериментально вызванную патологию легких и не вызывало неблагоприятных последствий для здоровья у всех десяти овец, принимавших участие в испытании.

каждый проверенный параметр (рис. ⑥). Важно отметить, что сегменты легкого, которые получали повреждающий агент блеомицин и лечились пиноцембрином, имели более низкие средние баллы по каждому оцениваемому параметру (рис. ⑥). Лечение пиноцембрином значительно уменьшило воспаление и общую оценку патологии по сравнению с сегментами, которые получали только инфузию блеомицина (рис. 6). В то время как сегменты легкого, которые получали инфузию блеомицина и пиноцембрина, имели более низкие показатели фиброза по сравнению с сегментами, которые получали инфузию только блеомицина, разница не была статистически значимой (рис. 6).

Влияние пиноцембрина на содержание соединительной ткани

Микроскопические наблюдения срезов, окрашенных трихромом по Массону, показали, что лечение пиноцембрином уменьшало количество соединительной ткани, вызванное инфузией блеомицина (рис. 7А). EigZB показывает данные по проценту площади соединительной ткани, окрашенной трихромом по Массону, после четырех еженедельных обработок пиноцембрином. Данные на фиг. 7B показали, что обработка пиноцембрином значительно снижала процент синего окрашивания в сегментах легких, подвергшихся воздействию блеомицина, по сравнению с легкими, обработанными блеомицином, которые не подвергались обработке пиноцембрином (рис. 7B). На рис. ZC показаны данные анализа гидроксипролина на содержание коллагена после четырехнедельного лечения пиноцембрином. Данные на фиг. 7C были получены от всех 10 животных в испытании и показали, что инфузия только блеомицина (без пиноцембрина) значительно повышала концентрацию белка коллагена по сравнению с соответствующими измерениями здоровых контрольных сегментов легких, которые не получали ни блеомицин, ни пиноцембрин. Однако введение пиноцембрина не уменьшало индуцированное блеомицином увеличение концентрации коллагена (рис. 7С).

Обсуждение

В этом исследовании использовалась физиологически и фармакологически значимая модель легочного фиброза на овцах [12,13] для подтверждения эффективности пиноцембрина. В целом мы обнаружили, что лечение пиноцембрином эффективно уменьшало экспериментально вызванную патологию легких и не вызывало неблагоприятных последствий для здоровья у всех десяти овец, принимавших участие в испытании.

Влияние пиноцембрина на гистопатологию

Eig6 показывает данные оценки гистопатологии после четырех обработок пиноцембрином один раз в неделю. Учитываемые гистопатологические параметры включали воспаление, фиброз и общую патологию. Как и ожидалось для нормального здорового легкого, контрольные сегменты легкого, которые не подвергались лечению, имели низкие баллы по каждому оцениваемому параметру патологии (рис. 6). Напротив, сегменты легкого, поврежденные блеомицином, без обработки пиноцембрином, имели значительно высокие средние баллы для

каждый проверенный параметр (Eig⑥). Важно отметить, что сегменты легкого, которые получали повреждающий агент блеомицин и лечились пиноцембрином, имели более низкие средние баллы по каждому оцениваемому параметру (рис. ⑥). Лечение пиноцембрином значительно уменьшило воспаление и общую оценку патологии по сравнению с сегментами, которые получали только инфузию блеомицина (рис. 6). В то время как сегменты легкого, которые получали инфузию блеомицина и пиноцембрина, имели более низкие показатели фиброза по сравнению с сегментами, которые получали инфузию только блеомицина, разница не была статистически значимой (рис. 6).

Влияние пиноцембрина на содержание соединительной ткани

Микроскопические наблюдения срезов, окрашенных трихромом по Массону, показали, что лечение пиноцембрином уменьшало количество соединительной ткани, вызванное инфузией блеомицина (рис. 7А). EigZB показывает данные по проценту площади соединительной ткани, окрашенной трихромом по Массону, после четырех еженедельных обработок пиноцембрином. Данные на фиг. 7B показали, что обработка пиноцембрином значительно снижала процент синего окрашивания в сегментах легких, подвергшихся воздействию блеомицина, по сравнению с легкими, обработанными блеомицином, которые не подвергались обработке пиноцембрином (рис. 7B). На рис. ZC показаны данные анализа гидроксипролина на содержание коллагена после четырехнедельного лечения пиноцембрином. Данные на фиг. 7C были получены от всех 10 животных в испытании и показали, что инфузия только блеомицина (без пиноцембрина) значительно повышала концентрацию белка коллагена по сравнению с соответствующими измерениями здоровых контрольных сегментов легких, которые не получали ни блеомицин, ни пиноцембрин. Однако введение пиноцембрина не уменьшало индуцированное блеомицином увеличение концентрации коллагена (рис. 7С).

Эффективность пиноцембрина для улучшения некоторых параметров заболевания в модели экспериментального заболевания легких у овец

В текущем исследовании мы обнаружили, что пиноцембрин способен улучшать некоторые параметры заболевания в модели легочного фиброза у овец. Наши основные выводы заключались в том, что введение пиноцембрина способно улучшить функцию легких, ослабить воспаление легких и снизить общую оценку патологии, вызванную повреждением блеомицином. Важно отметить, что статистический анализ данных показал, что эти показатели заболевания были значительно улучшены в сегментах легких, обработанных пиноцембрином, по сравнению с соответствующими данными для сегментов легких, поврежденных блеомицином, и сегментов легких, не подвергавшихся лечению.

В модели индуцированного блеомицином легочного фиброза у овец повреждение блеомицином вызывает потерю локализованной податливости легких (показатель жесткости легких) в сегментах легких, которым вводили блеомицин [12-14, 16, 22, 23]. В текущем исследовании , мы обнаружили, что лечение пиноцембрином значительно улучшало функциональную податливость в сегментах легких, поврежденных блеомицином. Это продемонстрировало, что лечение пиноцембрином поврежденных сегментов легкого приводит к тому, что эти сегменты функционируют на более высоких уровнях, чем если бы их не лечили.

В текущем исследовании идентификация воспалительных клеток лаважа легких, извлеченных из сегментов легких, показала, что лечение пиноцембрином значительно снижает количество воспалительных клеток, которые занимают лиминальные пространства альвеол и мелких дыхательных путей. Основным типом воспалительных клеток, который был уменьшен в жидкости лаважа легких, были нейтрофилы, количество которых снизилось с 7,4% от общего количества клеток БАЛ в сегментах легких, получавших блеомицин без лекарственного лечения, до 3,7% в сегментах легких, обработанных пиноцембрином и поврежденных блеомицином. Связанное с пиноцембрином снижение количества CD4 и CD8 Т-клеток в паренхиме легкого полностью соответствовало уменьшению воспалительных клеток, извлеченных из жидкости лаважа легких сегментов легких, подвергшихся воздействию пиноцембрина и блеомицина. CD4 и CD8 плюс Т-клетки являются важными компонентами клеточных ветвей многих иммунных реакций. В целом, эти данные подтверждают мнение о том, что пиноцембрин обладает сильными противовоспалительными свойствами в изученной модели заболевания.

С точки зрения оценки гистопатологии средние оценки воспаления и общей патологии были улучшены в поврежденных сегментах легкого после лечения пиноцембрином. Важно отметить, что эти показания были статистически ниже в поврежденных легких, обработанных пиноцембрином, по сравнению с экспериментально поврежденными легкими без обработки пиноцембрином. Хотя средние баллы патологии фиброза были ниже в поврежденных легких, обработанных пиноцембрином, по сравнению с экспериментально поврежденным легким без лечения пиноцембрином, они не достигли статистической значимости.

Поскольку данные оценки патологии фиброза не были окончательными для пиноцембрина, анализ гидроксипролина проводили на образцах ткани из дифференцированно обработанных сегментов легких. Анализ гидроксипролина измеряет уровень коллагена в образце белка и является золотым стандартом считывания для количественного определения уровней фиброза в тканях. Этот анализ показал, что пиноцембрин не уменьшал отложение внеклеточного коллагена, связанное с повреждением блеомицином. Анализ трихрома Массона (еще одна считывающая мера, которая часто используется для оценки степени фиброза) показал, что процент синего окрашивания (то есть показатель содержания соединительной ткани) был значительно ниже в срезах легких, обработанных блеомицином, и обработанных пиноцембрином, по сравнению с обработанными блеомицином. участки легких, не подвергавшиеся медикаментозному лечению. В совокупности данные анализа гидроксипролина и трихрома Массона позволяют предположить, что пиноцембрин обладает способностью восстанавливать некоторые белки внеклеточного матрикса (показано данными трихрома Массона), но не обязательно коллаген (что подтверждается данными анализа гидроксипролина). В целом, данные оценок фиброза, трихрома Массона и анализов гидроксипролина показали, что пиноцембрин обладает лишь умеренными антифибротическими и антиремоделирующими свойствами.

Ранее было показано, что многие биологически активные соединения обладают противовоспалительными, а также антифибротическими свойствами за счет модуляции нескольких профибротических и провоспалительных биомаркеров, таких как TNF, TGF-эндотелин -1, IFN-y, интерлейкины, VEGF, FGF. -2, PDGF MMP-9, TIMP, NF-kB и коллаген-I [24]. Кроме того, было обнаружено, что введение противовоспалительных соединений мышиным моделям легочного фиброза, которым вводили блеомицин, часто приводило к уменьшению фиброзной патологии. Это было особенно актуально, если противовоспалительные молекулы применялись на ранней стадии после воздействия блеомицина во время воспалительной (профибротической) стадии патологии в этих моделях [25]. Важно, однако, то, что когда многие из этих противовоспалительных молекул были протестированы в клинике для лечения фиброзных состояний, они оказались неэффективными [25]. пиноцембрин также ингибировал провоспалительные цитокины TNF-c, IL-1 и IL-6 и ослаблял воспалительные реакции за счет подавления сигнального пути NF-K 9, 10. Дальнейшие механистические исследования с LPS мыши и блеомицином модели предположили, что TLR4 (toll-подобный рецептор 4) и инфламмасомы причинно связаны с подавлением пиноцембрином передачи воспалительных сигналов NF-K [2]. Как и во всех моделях легочного фиброза, индуцированных блеомицином, время введения препарата имеет решающее значение для определения относительного антифибротического и противовоспалительного вклада лечения [25. Время лечения пиноцембрином в текущем исследовании составляло 7 дней после последней инфузии блеомицина, что в этой модели находится в начале фиброзной фазы [12,13]. Хотя воспаление было намного меньше в тот момент времени-7, оно все же присутствовало, поэтому мы не можем исключить, что некоторые из слабых антифибротических эффектов пиноцембрина были связаны с его противовоспалительной активностью.

Ранее мы использовали эту модель легочного фиброза у овец для оценки терапевтического потенциала двух других препаратов, результаты которой могут быть полезны для сравнения эффектов пиноцембрина, обнаруженных в текущем исследовании. Мы протестировали ингибитор ионного канала KCa3.1 под названием сеникапок [15, 16], а также исследовали эффективность одобренного FDA препарата пирфенидона на модели [14]. Опубликованные планы исследований были в основном аналогичны текущему исследованию пиноцембрина, при этом в каждом исследовании использовалось 10 овец в группе. Периоды медикаментозного лечения были одинаковой продолжительности и составляли от четырех до пяти недель для каждого препарата. Основное отличие заключалось в том, что в исследованиях сеникапока и пирфенидона препараты вводили перорально, а пиноцембрин вводили внутрилегко в локальные сегменты легких. Кроме того, в настоящем исследовании пиноцембрин не вводился в легкие целиком, в то время как в исследованиях пирфенидона и сеникапока препараты вводились в легкие целиком. Анализ данных между этими исследованиями показывает, что уровни улучшения маркеров болезни, растяжимости легких, общей оценки патологии и воспаления были на том же уровне для испытания пиноцембрина по сравнению с другими испытаниями лекарств, проведенными на модели овец. Одним из основных различий между этими исследованиями было то, что в ранее опубликованных исследованиях введение пирфенидона или сеникапока приводило к значительному снижению концентрации белка коллагена, что оценивалось с помощью анализа гидроксипролина [14, 16]. препаратов позволяет предположить, что значительное улучшение функции и патологии легких происходит преимущественно за счет противовоспалительного действия пиноцембрина и в меньшей степени за счет его антифиброзного действия.

В текущем исследовании было обнаружено, что четыре дозы пиноцембрина по 7 мг, вводимые в легкие с недельными интервалами, хорошо переносятся и не вызывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Это согласуется с данными рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования с участием 58 здоровых пациентов, которые показали, что внутривенная инъекция пиноцембрина хорошо переносилась в дозе до 120 мг в сутки [26]. В исследовании оценивались как однократные, так и многократные режимы дозирования, и было обнаружено, что не было серьезных проблем с безопасностью, которые препятствовали бы любому будущему клиническому развитию введения пиноцембрина посредством инъекций [26]. Данные текущего исследования показали, что прямая внутрилегочная доставка пиноцембрина не только безопасна и жизнеспособна, но и подтверждает мнение о том, что этот флавоноид может быть полезен для лечения ряда воспалительных заболеваний легких. Астма является важным аллергическим заболеванием дыхательных путей, которое поддается доставке пиноцембрина в легкие. Предварительные данные, подтверждающие антиастматические эффекты пиноцембрина, были представлены в исследовании, в котором внутрибрюшинные инъекции пиноцембрина ингибировали аллергические заболевания дыхательных путей у мышей [20]. Таким образом, можно разумно ожидать, что локальная доставка пиноцембрина исключительно в легкие будет более эффективной при лечении астмоподобных состояний в клинике.

Вывод

В заключение, сильные и значимые данные, полученные в этом исследовании, согласуются с тем, что пиноцембрин обладает биологической активностью и улучшает ключевые параметры заболевания в условиях модели на животных. Поразительные противовоспалительные и умеренные антифиброзные ремоделирующие эффекты введения пиноцембрина, вероятно, были связаны с его способностью улучшать легочную патологию и функциональную комплаентность.