Терапевтическое действие фенилетаноидных гликозидов на циклопфосфамид-индуцированную дисзооспермию у мышей и ее механнизм

Контакт: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

ЧЖАО Дун-хэйль, ЧЖАН Лэй?, ЧЖАН Янь², ЦИ Лин', ЦЗОУ Сян-мин'

Аннотация: Цель Исследовать терапевтическое влияние фенилетаноидных гликозидов на циклофосфамидную (CTX)-индуцированную дисзооспермию у мышей и предварительно прояснить механизмы, участвующие в процессе. Методами фенилетаноидный гликозид экстрагировали экстракцией этанола, сорок самцов мышей BALB/C были случайным образом разделены на контрольную группу, модельную группу, группу низких доз фенилетаноидных гликозидов (50 мг·кг-I) и группу высоких доз фенилетаноидов гликозидов (100 мг·кг-). За исключением контрольной группы, модель мыши с дисзооспермией была установлена перитонеальной инъекцией CTX в суточной дозе 80 мг· кг-i, один раз в сутки в течение последовательных 5 д. После моделирования фенилетаноидные гликозиды вводили внутригастрально в соответствующих дозах в каждую группу фенилетаноидных гликозидов. Равный объем нормального физиологического раствора давали мышам в контрольной группе и модельной группе с помощью гастрогаважа. Все лекарства выполнялись один раз в день в течение последовательных 30 дней. Ткань яичка получали через 24 ч после последнего внутрижелудочного введения. Уровень тестостерона в гомогенате ткани яичка определяли с помощью иммуноферментного анализа. Сравнивали количество сперматозоидов, показатели подвижности и показатели тератозооспермии в различных группах. Морфологические изменения ткани яичка наблюдались при использовании окрашивания HE. Результаты По сравнению с контрольной группой количество сперматозоидов и частота подвижности были снижены, частота тератозооспермии была увеличена, а уровень тестостерона в гомогенате ткани яичка был снижен в модельной группе (P<0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" counts="" and="" the="" motility="" rates="" were="" increased,="" the="" teratozoospermia="" rates="" were="" decreased,="" and="" the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testis="" tissue="" homogenate="" were="" increased="" in="" phenylethanoid="" glycosides=""><0.05 or=""><0,01). the="" histological="" results="" showed="" atrophy="" and="" degeneration="" of="" seminiferous="" tubule,="" thicker="" seminiferous="" epithelium,="" and="" azoospermic="" lumina="" in="" the="" model="" group;="" the="" number="" of="" seminiferous="" epithelial="" layers="" was="" increased="" and="" the="" seminiferous="" cells="" orderly="" arranged,="" and="" many="" sperms="" were="" found="" in="" the="" tubules="" in="" phenylethanoid="" glycosides="" groups.="" conclusion="" phenylethanoid="" glycosides="" have="" obviously="" therapeutical="" effects="" on="" ctx-induced="" dyszoospermia="" in="" mice,="" and="" their="" mechanisms="" might="" be="" correlated="" with="" recovering="" the="" testosterone="">

Ключевые слова: фенилетаноидные гликозиды; циклофосфамид; сперматогенные нарушения; мыши, БАЛБ/С

Cistanche deserticola имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Из-за ускорения социального ритма, вредных привычек жизни и загрязнения окружающей среды, а также других факторов, аномальное качество спермы, такое как олигоспермия и астеноспермия, стало основной причиной мужского бесплодия [1]. В настоящее время существует меньше препаратов для лечения олигоспермии и астеноспермии, а терапевтический эффект не очевиден. Рецепты традиционной китайской медицины или активные ингредиенты оказывают хорошее влияние на улучшение мужской репродуктивной функции [2-6]. Однако из-за большого разнообразия рецептурных препаратов взаимосвязь между фармакологическими эффектами и эффективными ингредиентами препарата не ясна, что ограничивает продвижение и применение сперматогенных препаратов. Исследования и разработки эффективных ингредиентов традиционной китайской медицины и изучение ее терапевтических эффектов при репродуктивных травмах имеют хорошую прикладную ценность. Темфенилетаноидные гликозидыв Cistanche cistanche являются одним из самых важных активных ингредиентов в Cistanche. Обычно это природные гликозиды, содержащие сложные и оксо-гликозидные связи с β-глюкозой в качестве ядра. Они широко присутствуют в двудольных растениях 7]. Исследования [8] показали, что гликозиды цистанчефенэтанола могут защитить сперму крыс от окислительного повреждения in vitro, но сообщений о ее сперматогенезе нет. Этот эксперимент изучает терапевтические эффекты цистанчефенилетаноидные гликозидыо сперматогенезе мышей с циклофосфамид-индуцированным сперматогенезом и обеспечивает экспериментальную и теоретическую основу применения гликозидов цистанчефенэтилового спирта в лечении нарушений сперматогенеза.

1 Материал и методы

1.1 Экспериментальные животные, основные реагенты и инструменты

40 взрослых мышей SPF BALB/C, 6-8 недель, вес 20-22 г, приобретенных в Экспериментальном центре животных Школы фундаментальной медицины Цзилиньского университета, номер сертификата животного: SCXK (Кыргызстан) 2008-0005. Мышей выращивали адаптивно в течение 5 дней до эксперимента. Условия кормления: 22°C ~25°C, циркадный ритм (12 ч/12 ч), бесплатная питьевая вода и пища. Cistanche является продуктом Xinjiang Dakang Trading Company, циклофосфамид для инъекций был приобретен у Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (номер партии 11061921), набор для иммунологического анализа гомогената тестостерона яичек был приобретен у Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (номер партии 20120812), все реагенты являются аналитическими марками отечественного производства. Считыватель микропластин PLUS384 (MDC, США), инвертированный микроскоп TE2000U (Nikon, Япония), центрифуга J-26XP (Nanodrop, США).

1.2 Приготовление цистанчафенилетаноидные гликозиды

10 гЦистанхе тубулозапорошок рефлюксировали с 70% этанолом, дважды, по 2 часа каждый раз для полученияфенилетаноидный гликозидконцентрат. Концентрированный раствор подвергали колоночной хроматографии макропористой смолы D101 и элюировали 70% этанолом для полученияЦистанче фенилетаноидный гликозидалкоголь. УФ-спектрофотометр идентифицировал экстракт на длине волны 333 нм.

1.3 Подготовка животной модели и способы введения

40 самцов мышей BALB/C адаптивно кормили в течение 5 дней, и мышей случайным образом разделили на 4 группы (по 10 мышей в каждой группе): контрольная группа, модельная группа, Cistanche cistanche low phenylethanoid glycosides Dose и группа гликозидов с высокой дозой цистанчефенэтилового спирта. За исключением контрольной группы, трем другим группам мышей давали внутрибрюшинную инъекцию циклофосфамида 80 мг·кг-1 для каждой мыши в течение 5 дней подряд для подготовки животных моделей нарушения сперматогенеза. После того, как модель была подготовлена, мыши в группах с низкой и высокой дозойЦистанче фенилетаноиддавали соответственно 50 и 100 мг·кг-'·д-'. , 1 раз в день в течение 30 дней подряд. Всех мышей приносили в жертву через 24 часа после последнего введения, и были взяты двусторонние тесты. Правое яичко было зафиксировано в формальдегиде. Придаток яичка и яичка были взяты с левой стороны. Яичко гомогенизировали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант брали и хранили в холодильнике при 20°C для тестирования. Левый придаток яичка был протестирован на плотность сперматозоидов, подвижность сперматозоидов и частоту деформации.

1.4 Определение плотности сперматозоидов, подвижности сперматозоидов и частоты деформации

Поместите пробирку, содержащую 10 мл питательного раствора спермы, на водяную баню с постоянной температурой до разогрева до 37 °C, удалите соединительную ткань и жир с одной стороны придатка яичка, разрезайте ткань и поместите ее в пробирку при 37 °C на 10 минут. После того, как сперма полностью свободна, возьмите 1 каплю на пластину для подсчета клеток крови и рассчитайте плотность сперматозоидов в соответствии с методом подсчета клеток. Результат выражается в виде количества сперматозоидов на миллилитр; Кроме того, возьмите 5 мкл суспензии спермы из пробирки и смешайте ее с тем же количеством Eosin-Y Evenly, поместите ее при комнатной температуре на 10 минут, добавьте покровное стекло и наблюдайте с помощью светового микроскопа. Мертвые сперматозоиды окрашены в розовый цвет, а живые сперматозоиды не окрашены, но цитоплазма прозрачна. Подсчитайте 200 сперматозоидов на образец, рассчитайте жизнеспособность сперматозоидов, и результат будет выражен в процентах, жизнеспособность сперматозоидов = количество живых сперматозоидов / общее количество сперматозоидов × 100%. Еще 5 мкл суспензии сперматозоидов фиксировали в метаноле в течение 5 мин, сушили и окрашивали 2% водным раствором эозина в течение 1 часа, промывали и сушили феном. Ищите части с меньшим перекрытием сперматозоидов под маломощным микроскопом и используйте мощный микроскоп для последовательной проверки морфологии сперматозоидов. Каждая мышь проверила 1000 полных сперматозоидов. Головки сперматозоидов были неприцепленными, бананообразными, аморфными, толстоголовыми, двуглавыми и т. Д. Были оценены как уродства. Была рассчитана частота деформации сперматозоидов, и результаты были выражены в процентах. Частота деформации сперматозоидов = количество деформированных сперматозоидов / общее количество сперматозоидов × 100%.

1.5 Определение репродуктивных гормонов

Яичко отслаивали и помещали во флакон, а предварительно охлаждали гомогенизирующей средой (0,01 моль· L-сахароза, 0,01 моль· L-1Трис-HCl, 0,1 ммоль· Растворы L-1EDTA-Naz, рН 7,4), разрезают ткань яичка офтальмологическими ножницами, заливают ее в стеклянную гомогенизационную трубку и гомогенизируют, центрифугируют на 4 000×г в течение 10 мин при низкой температуре, берут надводный, и используют фермент связанный иммуносорбирующий реагент Уровень тестостерона в гомогенате ткани яичка определяли коробкой, и для каждого образца тестировали 3 параллельных образца. Экспериментальные этапы и методы были выполнены в соответствии с инструкциями по набору.

1.6 Морфологическое наблюдение ткани яичка

Возьмите парафиновые срезы мышиного яичка, окрашивание HE и наблюдайте за распределением сперматогонии и сперматогенных клеток в ткани яичка под световым микроскопом.

1.7 Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием статистического программного обеспечения SPSS 17.0. Плотность сперматозоидов, частота подвижности сперматозоидов, частота деформации сперматозоидов и уровень тестостерона в яичках мышей в каждой группе были выражены как z±s, а сравнение между группами проводилось путем одностороннего анализа дисперсии.

2. результаты

2.1 Плотность сперматозоидов, жизнеспособность сперматозоидов и частота деформации сперматозоидов каждой группы мышей

По сравнению с контрольной группой плотность сперматозоидов и частота подвижности сперматозоидов модельной группы снизились (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" increased=""><0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0.01). compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="">Цистанче фенэтиловый спирт гликозидгруппа повышенной плотности сперматозоидов и подвижности сперматозоидов (P<0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><>

2.2 Уровень тестостерона в тканях яичек мышей в каждой группе

Уровни тестостерона в гомогенатах ткани яичек контрольной группы и модельной группы составили (10,26±0,57) и (5,33±0,84) нмоль· L-', соответственно. Уровень тестостерона в модельной группе был значительно ниже, чем в контрольной группе (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="">Цистанче фенилетаноид гликозидгрупповыми были (7,55±1,21) и (10,35±0,94) нмоль· Л-1. Уровень тестостерона в низких и высоких дозах Цистанхефенилетаноидный гликозидгруппы были значительно выше, чем в модельной группе (P<0.05 or=""><0.01). the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" low-dose="" group=""><>

2.3 Морфология яичек мыши в каждой группе

Наблюдается с помощью светового микроскопа; сперматогенные канальцы в яичке нормальной группы плотно расположены, уровень и количество половых клеток многочисленны, семенной эпителий расположен аккуратно, а семенные канальцы все образованы сперматозоидами. В модельной группе семенные канальцы в яичках мышей атрофировались и дегенерировали, семинеферный эпителий значительно истончали, количество эпителиальных слоев уменьшали, расположение неупорядочивалось, а количество сперматозоидов в полости уменьшалось. По сравнению с модельной группой, количество семенных канальцев и семенных эпителиальных слоев в низких дозахЦистанче фенилетаноид гликозидгруппа увеличилась, расположение эпителия стало более регулярным, а повреждение семенных канальцев значительно улучшилось; высокая дозаЦистанче фенилетаноид гликозидГруппа улучшила структуру семенных канальцев более значительно, Количество и количество семенных эпителиев значительно увеличились, они расположены аккуратно, в семенных канальцах есть зрелые сперматозоиды, и структура в основном пришла в норму. См. рисунок 1 (вставка 6).