Тканеспецифическая экспрессия рецептора SARS-CoV-2, ангиотензинпревращающего фермента 2, в мышиных моделях хронической болезни почек
Mar 22, 2022
С января 2020 г. коронавирусная болезнь 2019 г. (COVID-19), вызванная коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), является глобальной проблемой общественного здравоохранения. Инфекция SARS-CoV-2 устанавливается, когда вирусный белок S связывается с ангиотензинпревращающим ферментом 2 хозяина (ACE2) и проникает в клетку1,2. Следовательно, повышенная экспрессия ACE2 в органах, которые являются потенциальными мишенями для SARS-CoV-2, может увеличить риск заражения COVID- 19. ACE2 — это фермент, играющий важную роль в ренин-ангиотензиновой системе (РАС), где он превращает ангиотензин (Ang) II в Ang1-7 и образует компонент ACE2-Ang{{21 }}MAS-рецепторная ось3. Он также оказывает органопротекторное действие, противодействуя активности оси рецепторов ангиотензина ACE-Ang II типа 1 (AT1)4-7. Предыдущие отчеты показали, что ACE2 изменяет свои тканеспецифические паттерны экспрессии при различных состояниях, включая сердечно-сосудистые заболевания, сахарный диабет (СД) ипочечные заболевания 8–11. Легочная экспрессия ACE2, которая особенно важна для инфекции SARS-CoV-2, снижена при липополисахарид-индуцированном остром респираторном дистресс-синдроме12. Другой отчет показывает, что экспрессия ACE2 выше у пожилых мужчин13. На кафедре медицинских наук и кардиоренальной медицины Высшей школы медицины Йокогамского городского университета, 3-9 Фукуура, Канадзава-ку, Иокогама 236-0004, Япония. 2Программа сердечно-сосудистых и метаболических нарушений, Медицинская школа Duke-NUS, Сингапур, Сингапур. 3Медицинский факультет, Маунт-Синай, Бет-Исраэль, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США. 4Кафедра молекулярной биологии Высшей школы медицины Йокогамского городского университета, Иокогама, Япония. 5Кафедра оториноларингологии, хирургии головы и шеи, Медицинский факультет, Городской университет Йокогамы, Иокогама, Япония. 6Внутренняя медицина, Стоматологический университет Канагава.
Ключевые слова;Болезнь почек; почки; почечный ACE2; почечные ткани; почечная недостаточность
CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК
кроме того, назальная и жаберная экспрессия ACE2 выше у взрослых, чем у детей14. Однако, насколько нам известно, в нескольких исследованиях изучалось, как экспрессия ACE2 в легких изменяется при других заболеваниях. Пациенты с хроническимБолезнь почек(ХБП) имеют риск тяжелого течения COVID-19, но нет данных о повышенной распространенности COVID-19 у пациентов с ХБП15–21. Учитывая тот факт, что ACE2 необходим для инфекции COVID-19, эти данные могут свидетельствовать о том, что легочная экспрессия ACE2 не повышена у пациентов с ХБП. Примечательно, что клеточная экспрессия ACE2 предположительно связана с восприимчивостью к риску заражения SARS-CoV, что связано с SARS-CoV-222. Тот факт, что дети с низким уровнем экспрессии ACE2 менее восприимчивы к COVID-19, чем взрослые23, также подтверждает эту гипотезу. Поэтому мы провели эксперименты для изучения изменений в экспрессии ACE2 в легких у двух типов мышей с моделью CKD: индуцированных аденином (т. е. адениновых мышей) и индуцированных аристолоховой кислотой (AA) (т. е. мышей AA), чтобы опровергнуть эту гипотезу. Связь экспрессии ACE2 с блокаторами RAS также была исследована. До сих пор было показано, что использование блокаторов RAS в некоторых случаях повышает экспрессию ACE2 в органах24-27. Недавние эпидемиологические исследования показали, что использование блокаторов РАС не увеличивает риск COVID-1928–30. Кроме того, экспрессия ACE2 в легких не увеличивалась, когда блокаторы RAS вводили нормальным мышам31. Однако не было сообщений о влиянии блокаторов РАС на легочную экспрессию ACE2 в контексте ХБП; этот момент имеет важное значение для будущего лечения COVID-19 и его последствий. Здесь мы исследовали изменения экспрессии ACE2 в легких из-за лечения блокаторами RAS у мышей с моделью ХБП.
Полученные результатыУ мышей с моделью ХБП, индуцированной аденином, наблюдалась значительная потеря веса, ухудшение функции почек и повышенное артериальное давление (АД) по сравнению с контрольной группой. Исходная масса тела (МТ) и систолическое АД были идентичны между контрольной и адениновой группами. МТ увеличивалась со временем в контрольной группе, тогда как в группе аденина она снижалась; это увеличение массы тела значительно различалось между группами (рис. 1А). Систолическое АД было значительно повышено в группе аденина по сравнению с контрольной группой с течением времени (рис. 1В). Через 2 недели экскреция альбумина с мочой была значительно повышена в группе, получавшей аденин, по сравнению с контрольной группой (мыши с аденином 41.0±8,3 мкг/день по сравнению с контролем 13,6±1,7 мкг/день, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
Экспрессия ACE2 в почках была значительно снижена у мышей с моделью ХБП, индуцированной аденином, по сравнению с контрольной группой, в то время как экспрессия ACE2 в легких не отличалась между группами..Гистология почек показала неоднородное расширение и атрофию канальцев, а также клеточную инфильтрацию впочечныйинтерстиций у адениновых мышей. Окрашивание ACE2 наблюдалось в основном в проксимальных канальцах в обеих группах, но степень окрашивания была снижена в группе аденина (рис. 2А). Уровни белка ACE2 впочки(оценка с помощью вестерн-блоттинга) показали значительное снижение в группе аденина по сравнению с контрольной группой как через 2, так и через 4 недели (2 недели: адениновые мыши 0,55±0.{{ 9}}4 по сравнению с контролем 1.00±0,10, P<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">почечный ACE2Экспрессия мРНК показала значительное снижение в группе аденина через 2 недели (мыши с аденином 0,61±0,04 по сравнению с контролем 1,00±0,03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ
У мышей с моделью CKD, индуцированной AA, наблюдалась значительная потеря веса и ухудшение функции почек по сравнению с группой, получавшей носитель, в то время как АД не различалось между группами.Исходная МТ и систолическое АД были одинаковыми в группах, получавших носитель, и группы АК. МТ со временем увеличивалась в группе, получавшей носитель, и снижалась в группе, принимавшей АА; это увеличение массы тела значительно различалось между группами (рис. 3А). Однако различий в систолическом АД между группами не было (рис. 3Б). По сравнению с группой, получавшей носитель, наблюдалось значительное повышение уровней креатинина и азота мочевины в плазме, а также экскреция альбумина с мочой в группе AA (креатинин: мыши AA 0,40±{{6} }.03 мг/дл по сравнению с носителем 0,14±0,01 мг/дл, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
Экспрессия ACE2 в почках была значительно снижена у мышей с моделью ХБП, вызванной AA, по сравнению с контрольной группой, в то время как уровни белка ACE2 в легких не различались между группами.. Гистологический анализ почек показал канальцевую атрофию и клеточную инфильтрацию впочечныйинтерстиция в группе АА. Окрашивание ACE2 наблюдалось в основном в проксимальных канальцах в обеих группах, но степень окрашивания была снижена в группе АА (рис. 4А). Уровни белка ACE2 впочкипоказали значительное снижение в группе AA по сравнению с группой, получавшей носитель (мыши AA {{0}},22±0,03 по сравнению с носителем 1,00±0,08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">почечный ACE2Экспрессия мРНК была значительно снижена в группе AA (мыши AA {{0}},30±0,02 по сравнению с носителем 1.00±0,06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
Окрашивание ACE2 наблюдалось в клетках альвеолярного эпителия 2 типа (рис. 4B), и не было различий в уровне легочного белка ACE2 между группами (рис. 4D). Экспрессия мРНК ACE2 в легких была значительно ниже в группе AA, чем в группе с носителем (мыши AA 0,76±0,04 по сравнению с носителем 1.{{11} }±0,04, П<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Олмесартан ослаблял повышение АД и экскреции альбумина с мочой, а также уменьшал потерю веса у мышей с ХБП, индуцированной аденином.Лечение олмесартаном ослабляло потерю веса у адениновых мышей (рис. 5А). Лечение олмесартаном также значительно снижало систолическое АД как в контрольной группе, так и в группе аденина (мыши с аденином 131,5±0,4 мм рт.ст. по сравнению с контрольной группой 121,2±0,7 мм рт.ст., P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Олмесартан не влиял на экспрессию ACE2.В контрольной группе и группе аденина уровни экспрессии мРНК и белка ACE2 в почках не изменялись при лечении олмесартаном (рис. 6А, С). Не было никаких изменений в уровнях экспрессии мРНК ACE2 или белка в легких между контрольной и адениновой группами (рис. 6B, D). Также не было существенной разницы в активности ACE2 в плазме (фиг. 6E). Также была исследована экспрессия мРНК ACE2 в верхних дыхательных путях (глотке), но существенных различий между группами не наблюдалось (дополнительная фигура S1).
ОбсуждениеПандемия COVID-19 оказала глубокое влияние на весь мир. Для пожилых людей и людей с сопутствующими заболеваниями информация о риске заражения и тяжести течения COVID-19 имеет решающее значение. Во всем мире были проведены многочисленные эпидемиологические исследования COVID-19, которые показали, что у пациентов с ХБП более вероятно развитие тяжелого течения COVID-1917, но заболеваемость COVID-19 может не повышаться у пациентов с ХБП 15–21. Примечательно, что результаты нескольких метаанализов показали, что распространенность ХБП у пациентов с COVID составляет 1,7–5,2%-1915–17,21. Кроме того, анализ 5700 пациентов с COVID-19 в Нью-Йорке
Йорк показал, что 8,5%почечная болезнь19. Учитывая, что оценочная распространенность ХБП составляет 9,1% во всем мире18 и примерно 15% в США20, риск заражения SARS-CoV-2 может не увеличиваться в связи с наличием ХБП. ACE2 играет важную роль в передаче COVID-191,2. Кроме того, уровень экспрессии ACE2 в клетках дыхательных путей связан с риском заражения SARS-CoV, коронавирусом, аналогичным возбудителю COVID-1922. Поскольку COVID-19 является респираторным заболеванием, экспрессия ACE2 в легких является важным компонентом передачи болезни. В настоящем исследовании мы предположили, что отсутствие увеличения экспрессии ACE2 в легких при ХБП связано с отсутствием повышенной заболеваемости COVID-19. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что дети с низким уровнем экспрессии ACE2 менее восприимчивы к COVID-19, чем взрослые. Мы использовали два типа мышей с моделью ХБП в наших экспериментах, чтобы изучить изменения в легочной экспрессии ACE2 в связи с патогенезом ХБП. Аденин-индуцированная ХБП является репрезентативной моделью заболевания на животных32. Чрезмерное введение аденина может вызвать ХБП, вызываяпочечныйканальцевая непроходимость и дегенерация, а такжепочечныйинтерстициальный фиброз из-за отложения 2-8-дигидроксиаденина32,33. Напротив, AA-индуцированная ХБП вызывается индуцированием фиброза из-за AA-индуцированного повреждения канальцев34. Эти две модели были выбраны потому, что было показано, что АД повышается в модели ХБП, индуцированной аденином35, в то время как в модели ХБП, индуцированной АК, оно не повышается36. Примечательно, что артериальная гипертензия является частым осложнением, наблюдаемым у пациентов с ХБП; мы предположили, что было бы полезно исследовать, влияет ли наличие или отсутствие гипертонии на легочную экспрессию ACE2 в патогенезе ХБП. Результаты показали, чтопочечный ACE2уровни белка были снижены в обеих моделях ХБП. У адениновых мышей не было значимой разницы в уровнях мРНК через 4 недели, но наблюдалось снижение уровня белка. Одной из причин такого несоответствия может быть участие трансляционной репрессии. Ламберт Д.У. и др. показали, что miR-421 репрессирует трансляцию белка ACE2, не влияя на уровни транскриптов ACE237. Другое исследование также показало, что сывороточная миР-421 была увеличена у пациентов с ХБП или гипертонией38,39. Так, в группе адениновых мышей с более длительным периодом ХБП и АГ (4 недели) miR-421
может увеличиваться и подавляться трансляция белка, что приводит к несоответствию между экспрессией мРНК и белка. Уровни легочного белка ACE2 не различались в обеих моделях ХБП по сравнению с контрольной группой и носителями. Хотя интригует тот факт, что экспрессия мРНК ACE2 в легких была снижена в модели ХБП, вызванной AA, наши результаты были более заметными, поскольку мы не обнаружили различий в уровнях белка ACE2 в легких, которые непосредственно влияют на инфекцию SARS-CoV-2. Кроме того, активность ACE2 в плазме не отличалась в обеих моделях ХБП по сравнению с контрольной группой и носителями. Считается, что растворимый ACE2 в плазме расщепляется и высвобождается из клеток тканей. Сообщалось, что повышенная активность ACE2 в плазме связана с увеличением высвобождения белка ACE2 из тканей, что свидетельствует о снижении уровня белка ACE2 в тканях40. Таким образом, результаты настоящего исследования о том, что активность ACE2 в плазме не изменилась при ХБП, указывают на то, что высвобождение белка ACE2, экспрессируемого в тканях, не изменяется при ХБП, что подтверждает выводы о том, что экспрессия белка ACE2 в тканях не изменяется при ХБП. контексте ХБП. Связь между COVID-19 и блокаторами РАС постоянно находится в центре научных дискуссий. Предыдущие исследования на животных показали, что блокаторы RAS усиливают экспрессию ACE2 в тканях, что привело к опасениям, что использование блокаторов RAS может увеличить риск заражения SARS-CoV-2. Однако использование блокаторов РАС в этих предыдущих исследованиях приводило к усилению тканевого АПФ2 только при определенных патологических состояниях24,27; эта активация не превышала нормального диапазона. Другое исследование, посвященное изучению легких ипочечный ACE2экспрессия у нормальных мышей, получавших блокаторы РАС, не увеличивалась по сравнению с контрольной группой31. С другой стороны, было сообщение о том, что блокаторы РАС, такие как кандесартан и каптоприл, увеличивали легочную экспрессию ACE2 у нормальных крыс41. В реальной клинической практике некоторые эпидемиологические исследования, касающиеся использования блокаторов РАС у пациентов с COVID-19, продемонстрировали, что использование этих препаратов не увеличивает риск COVID-1928–30. Однако влияние блокаторов РАС на легочную экспрессию ACE2 все еще остается спорным. В предыдущих исследованиях не изучалось влияние блокаторов РАС на легочную экспрессию АПФ2 в контексте ХБП, хотя блокаторы РАС необходимы для лечения пациентов с ХБП. Настоящее исследование было проведено для устранения этого пробела в литературе. Чтобы более точно смоделировать реальную клиническую практику, мы использовали модель аденин-индуцированной ХБП, которая демонстрирует сопутствующую гипертензию. Результаты показали, что введение олмесартана, блокатора РАС, не увеличивало легочную экспрессию ACE2 по сравнению с контрольной группой. Кроме того, экспрессия мРНК ACE2 в верхних дыхательных путях, начальной мишени инфекции SARS-CoV-2, не повышалась в ответ на лечение олмесартаном.Почечный ACE2уровни белка были снижены в модели CKD; введение олмесартана не повышало уровень почечного белка ACE2 у контрольных и адениновых мышей. Отсутствие восстановления почечного ACE2 у адениновых мышей, получавших олмесартан, могло быть связано с использованием другой модели ХБП по сравнению с предыдущим исследованием27, а также с относительно короткой продолжительностью лечения блокаторами ангиотензиновых рецепторов25,27. Однако лечение олмесартаном улучшало некоторые параметры почечной недостаточности, включая экскрецию альбумина с мочой. Эти результаты подтверждают необходимость дальнейшего использования блокаторов РАС у пациентов с COVID-19 с ХБП.
CISTANCHE УЛУЧШИТ ПОЧЕЧНУЮ ИНФЕКЦИЮ
Это исследование имело некоторые ограничения. Во-первых, он изучил только изменения в легочной экспрессии ACE2 у мышей с моделью ХБП, тогда как напрямую не исследовал инфекцию SARS-CoV-2. Во-вторых, мы наблюдали за адениновыми мышами в течение 4 недель, а за мышами АА в течение 8 недель в этом исследовании, но результаты могут отличаться при более длительном периоде наблюдения. В-третьих, экспрессия ACE2 в легких может различаться у мышей и людей. В-четвертых, у пациентов с ХБП тяжесть COVID-19, вероятно, будет выше, но мы не можем указать на основной механизм тяжести. В-пятых, восприимчивость к COVID-19 определяется не только уровнем экспрессии легочного ACE2, но и многими другими факторами. В заключение, мы не обнаружили изменений в экспрессии легочного белка ACE2 у мышей с моделью CKD, независимо от статуса гипертонии. Кроме того, использование блокаторов рецепторов ангиотензина у мышей с моделью ХБП не увеличивало легочную экспрессию ACE2. Эти результаты предполагают гипотезу о том, что риск заболеваемости COVID-19 может не повышаться у пациентов с ХБП из-за их стабильной легочной экспрессии ACE2. Эти результаты также предоставляют важные базовые научные доказательства того, что блокаторы РАС можно безопасно использовать при лечении пациентов с COVID-19 с ХБП.
Материал и методы Животные.Это исследование было выполнено в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по использованию экспериментальных животных. Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по изучению животных Йокогамского городского университета (номер утверждения: FA{{{{10}}}}}), что соответствовало рекомендациям ARRIVE. Были предприняты усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и обеспечить минимальные страдания. Мышей содержали в контролируемой среде с 12-часовым циклом свет-темнота при температуре 25 градусов. Мышам был предоставлен свободный доступ к пище и воде. Мыши модели CKD. Эксперименты проводились на 8-9-недельных самцах мышей C57BL/6 J после 1-недельной акклиматизации во всех группах. В эксперименте с аденином мышам давали диету, смешанную с 0,2% аденина (0,2% аденина плюс 0,3% NaCl, 3,6 ккал/г, CE{{ 18}}; CLEA, Токио, Япония; группа аденина) или стандартная диета (0,3% NaCl, 3,6 ккал/г, CE-2; CLEA; контрольная группа) в течение 2 или 4 недель. В эксперименте с АК мышам внутрибрюшинно вводили АК (3 мг/кг) два раза в неделю в течение 4 недель с последующим 4-недельным восстановительным периодом; группе носителя вводили носитель (75% диметилсульфоксид). В эксперименте по лечению олмесартаном мышей случайным образом разделили на четыре экспериментальные группы: (1) контрольная группа; (2) группа аденина, получавшая диету, смешанную с 0,2% аденина; (3) контрольная группа, получавшая олмесартан, получавшая антагонист рецептора AT1 олмесартан в питьевой воде (4 мг/кг/день; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Токио, Япония); и (4) группа аденина-олмесартана, дозы которой идентичны таковым в группах 2 и 3.
Измерение АД.Систолическое АД измеряли методом хвостовой манжетки (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Токио, Япония), как описано ранее42,43. Все измерения проводились между 9:00 и 14:00 ч. У каждой мыши проводили не менее 10 измерений, и для анализа использовали среднее значение.Количественный анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени.Тотальную РНК экстрагировали из легкого,почечныйи ткани глотки с использованием ISOGEN (Nippon Gene, Токио, Япония); кДНК синтезировали с использованием системы SuperScript III First-Strand System (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Количественный анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени проводили с использованием системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7000; Продукты обратной транскрипции инкубировали с TaqMan PCR Master Mix и специальным зондом TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), как описано ранее44,45. Использовали следующий зонд TaqMan: ACE2 (Mn01159003_m1). Уровни мРНК нормализовали к уровням 18S рРНК.
Вестерн-блоттинг анализ.Экспрессию белка анализировали вестерн-блоттингом с использованием гомогенатов тканей, как описано ранее45,46. Вкратце, экстракт общего белка готовили из тканей с буфером для образцов, содержащим додецилсульфат натрия. Концентрацию белка в каждом образце измеряли с помощью NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Равные количества белкового экстракта из каждого образца ткани (ткань легкого: 24 мкг, ткань почки: 10 мкг) фракционировали на 5-20-процентном полиакриламидном геле (Atto, Токио, Япония). Затем разделенные белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану с использованием системы сухого блоттинга iBlot (Invitrogen). Мембраны блокировали на 1 ч при комнатной температуре фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сухого обезжиренного молока. Мембраны инкубировали с первичными антителами к ACE2 (Ab108252 1:500 [легкие] или 1:1000 [почки], Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) и -актином (A{{16}). }:10 000, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Мембраны промывали и затем инкубировали со вторичными антителами в течение 60 мин при комнатной температуре. Сайты реакций антитело-антиген визуализировали с помощью усиленного хемилюминесцентного субстрата (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Изображения анализировали количественно с использованием ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Сравнить уровни экспрессии белка ACE2 в легких ипочечные тканиу нормальных мышей на той же мембране был проведен дополнительный вестерн-блоттинг (дополнительная фигура S2). Описанное количество белка было фракционировано в гели ((A) легкие: 24/10/1 мкг, почки: 24/10/1 мкг, (B) легкие: 24/12 мкг. , почки: 0,2/0,15/0,1 мкг); использовались те же первичные антитела к ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Для изучения специфичности антител использовали селективный блокирующий пептид ACE2- (ab198988). Вестерн-блоттинг показал единственную белковую полосу, которая была уничтожена селективным блокирующим пептидом ACE 2- (дополнительная фигура S3).
Иммуногистохимический анализ.легкие ипочечныйткани мышей фиксировали 4-процентным параформальдегидом и затем заливали в парафин. Срезы толщиной четыре микрометра депарафинизировали и регидратировали; выделение антигена проводили с помощью микроволнового нагрева. Срезы блокировали для снижения активности эндогенного биотина с помощью реагента, блокирующего пероксидазу (Dako, Carpinteria, CA, USA), и обрабатывали в течение 60 минут 10-процентной нормальной козьей сывороткой в фосфатно-солевом буфере. Затем срезы инкубировали с антителом против ACE2, разбавленным до 1:500 (Ab15348, Abcam). Для изучения специфичности антител также исследовали иммуноокрашивание путем исключения первичных антител и использования селективного блокирующего пептида ACE2- (ab15352). Окрашивание ACE2 в легких ипочечная тканьнаблюдалось, чего не наблюдалось, когда антитело было предварительно абсорбировано с помощью селективного блокирующего пептида ACE2- (ab15352) или при отсутствии антитела ACE2. (Дополнительный рисунок S4).
CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ
Биохимический анализ.После вдыхания 5-процентного изофлуранового наркоза образцы крови собирали путем пункции сердца в сытом состоянии путем пункции сердца. Подопытных животных умерщвляли гуманным способом после наркоза. Образцы цельной крови центрифугировали при 3000 об/мин (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Токио, Япония) при 4 градусах в течение 10 минут для отделения плазмы. Полученные образцы плазмы хранили при температуре -80 градусов до использования. Уровни креатинина плазмы, азота мочевины, креатинина мочи и альбумина мочи измеряли с помощью автоматического анализатора Hitachi 7180 (Hitachi, Токио, Япония).
Плазменная активность ACE2.Активность ACE2 измерялась компанией TechnoPro R&D (Токио, Япония) с использованием набора для анализа активности ACE2 (SensoLyte 390) при температуре 27°С. Образцы разбавляли 1:10 с использованием буфера для анализа, поставляемого с набором для анализа активности ACE2. Анализ проводили в 384-луночных планшетах. Образцы плазмы, только буфер для анализа (фон) или 4-метил-кумарин-7-амид (0,16–5 мкМ) в качестве эталонного стандарта добавляли в реакционный планшет OptiPlate-384 F при 10 мкл/лунка. Десять, раствор субстрата ACE2 (0,05 мМ 4-метилкумарил-7-амид/Dnp в буфере для анализа) добавляли по 10 мкл на лунку. После реакции интенсивность флуоресценции (Ex/Em =330 нм/390 нм) измеряли с интервалами 5- мин в течение 3 ч с использованием планшет-ридера EnSpire (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Интенсивность флуоресценции образцов в каждый момент времени рассчитывали по интенсивности флуоресценции образцов. Наклон каждой пробы (ОЕЕ/мин) определяли из линейной аппроксимации графика в период от 30 до 90 мин после начала измерения.
Статистический анализ.Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия анализировали следующим образом. Двусторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным анализом Бонферрони был проведен для определения различий во времени между аденином и контрольными группами (рис. 1, 2), группами АК и носителя (рис. 3А, В) или аденином и олмесартаном. группы (рис. 5, 6 и S1). Непарные t-критерии использовались для определения различий между мышами AA и мышами-носителями (рис. 3C-F, 4). Р-значения<0.05 were="" considered="" statistically="">
