Общие гликозиды Cistanche Deserticola способствуют восстановлению неврологической функции, индуцируя регенерацию нервно-сосудистых сосудов
Mar 29, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* и Yong Jiang1*
Фон:Сообщается, что традиционная китайская медицина Cistanche Deserticola действует при сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваниях. Однако его активные компоненты для защиты от ишемического инсульта не ясны. Мы стремились изучить активные компоненты C. Deserticola против ишемического инсульта, а также его потенциальные механизмы.
Методы:Мы исследовали защитное действие на головной мозг экстрактов C. Deserticola, общих гликозидов (TG), полисахаридов (PS) и олигосахаридов (OS) на крысиной модели окклюзии-реперфузии средней мозговой артерии (MCAO/R). 2, 3, 5-окрашивание трифенилтетразолия хлоридом (ТТС) использовали для оценки объема церебрального инфаркта, а анализ Evansblue применяли для оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Затем экспрессии CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, клаудин-5, окклюдин, Keap-1 и Nrf{{13 }} анализировали с помощью вестерн-блоттинга или иммунофлуоресценции, а активности MDA, SOD, CAT и GSH-Px анализировали с помощью наборов.
Полученные результаты:Лечение ТГ заметно снижало показатели неврологического дефицита и объемы инфаркта, стимулировало ангиогенез и ремоделирование нейронов, а также эффективно поддерживало целостность гематоэнцефалического барьера по сравнению с экспериментальной группой. Кроме того, ТГ значительно снижали уровни МДА и повышали антиоксидантную активность (СОД, КАТ и GSH-Px) в головном мозге. Между тем, TG значительно подавляли экспрессию Keep-1 и облегчали ядерную транслокацию Nrf-2. Напротив, никаких защитных эффектов не наблюдалось для групп PS и OS.
Вывод:ТГ являются основными активными компонентами C. Deserticola против MCAO / R-индуцированного повреждения головного мозга, и защита в основном осуществляется через путь Nrf -2/Keap-1.
Ключевые слова:Цистанхе пустынная,церебральная травма, общие гликозиды, полисахариды, олигосахариды, путь Nrf-2/Keap-1
цистанхе амазонка пустынная
ВВЕДЕНИЕ
Инсульты считаются основной причиной смерти и инвалидности в мире (Donnan et al., 2008). Почти 87 процентов всех случаев инсульта вызваны ишемическим инсультом (Ovbiagele and Nguyen-Huynh, 2011). В настоящее время наиболее эффективным и единственным одобренным FDA препаратом для лечения ишемического инсульта является рекомбинантный тканевый активатор плазминогена. Однако большое количество пациентов с инсультом не реагируют на этот препарат из-за его узкого терапевтического окна и серьезного риска геморрагических осложнений (Lee et al., 2012; Schellinger and Kohrmann, 2014). Основной проблемой тромболитической терапии является ишемия/реперфузия (И/Р), которая считается основной причиной повреждения головного мозга и нарушения функции. Реперфузия после церебральной ишемии увеличивает риск кровоизлияния в мозг, приводя к нейрососудистым повреждениям и выработке избыточных активных форм кислорода (АФК), которые повреждают гематоэнцефалический барьер (Alluri et al., 2015). Ряд исследований подтвердил, что нарушение ГЭБ является основной причиной патогенеза ишемического инсульта (Cao et al., 2016b).
ГЭБ состоит в основном из эндотелиальных клеток, перицитов, астроцитов, нейронов и базальных мембран. Основными компонентами ГЭБ являются эндотелиальные клетки церебральных микрососудов, которые соединены плотными контактами, таким образом, ограничивая проникновение экзогенных молекул в головной мозг. Патологические изменения плотных контактов, особенно окклюдина, клаудина-5 и zonulaoccludens-1 (ZO-1), существенно влияют на функцию ГЭБ во время ишемического инсульта, особенно на проницаемость барьера (Liuet al., 2014). ; Ху и др., 2018; Лю и др., 2019). В периоды И/Р избыток АФК является одним из основных факторов, приводящих к прямому повреждению нейронов головного мозга (Ding et al., 2014). Перепроизводство АФК приводит к деградации определенных соединений и нарушению ГЭБ, в результате чего экзогенные молекулы проникают в мозг через ГЭБ, что приводит к усугублению повреждения головного мозга (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Таким образом, защита ГЭБ антиоксидантами рассматривается как потенциальный способ предотвращения реперфузионного повреждения.
Помимо разрушения ГЭБ, И/Р может привести к нейроваскулярному повреждению и гибели нейронов (Jung et al., 2010). показали, что АФК усугубляет тяжесть инсульта и неврологические нарушения (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Хотя клинические испытания не дали удовлетворительных результатов, нейропротекция по-прежнему остается перспективной стратегией лечения острого ишемического инсульта (Moretti et al., 2015). Таким образом, поиск эффективных нейропротекторных препаратов для лечения инсульта является преимуществом для пациентов, перенесших инсульт.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) принимает меры для устранения внутреннего дисбаланса в организме (Gaire, 2018). Из-за сложного патогенеза ишемических инсультов многофакторное действие ТКМ и ее активных компонентов играет решающую роль в лечении инсультов. Цистанхе пустынная YC Ma, широко распространенная в засушливых или полузасушливых районах Монголии и Северо-Западного Китая, уже более 1,000 лет широко используется в Китае для лечения различных заболеваний, таких как забывчивость и депрессия. Современные фармакологические исследования показали, что сырые экстракты C. Deserticola продемонстрировала множественную фармакологическую активность, такую как улучшение функций обучения и памяти, нейропротекция, повышение иммунитета, антиоксидантное, омолаживающее и противоусталостное действие (Ko and Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Химический анализ C. Deserticola показал, что его основные составляющие включают фенилэтаноидные гликозиды, иридоидные гликозиды, полисахариды и олигосахариды (Jiang and Tu, 2009). Однако активные компоненты C. Deserticola для защиты головного мозга не очень ясны.
Нейропротекторное свойство C. Deserticola подразумевает его терапевтический потенциал при когнитивных заболеваниях, таких как инсульт и депрессия, а также болезнь Альцгеймера (Wang et al., 2017). Однако исследования влияния C. Deserticola на инсульты, включая ее активные компоненты и механизмы действия, очень ограничены. В настоящей работе мы исследовали защитный эффект трех экстрактов C. Deserticola, общих гликозидов (ТГ, фенилэтаноидных гликозидов и других гликозидов), полисахаридов (ФС) и олигосахаридов (ОС) при церебральных травмах И/Р. Наши результаты могут способствовать точному клиническому применению C. Deserticola и предоставить кандидата на лечение ишемического инсульта.
Цистанхе имеет ттерапевтический потенциалпри когнитивных заболеваниях, таких как инсульт и депрессия,а также болезнь Альцгеймера.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химикаты и реагенты
Стебли Cistanche Deserticola были приобретены в Алашане, Внутренняя Монголия, и идентифицированы одним из авторов (P.-F. Tu). TG, PS и OS были приготовлены в соответствии с нашим ранее описанным методом (Gao et al., 2015). . Количественный анализ ТГ был выполнен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как описано ранее (Li et al, 2019), и его хроматограмма показана на рисунке 1. Основными компонентами ТГ являются эхинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'- ацетилактеозид; их содержание составляет 163,05 мг/г, 4,125 мг/г, 41,66 мг/г, 22,655 мг/г и 12,045 мг/г соответственно. Содержание PS и OS составляет 69,42 процента и 65,24 процента соответственно, что определено с помощью ВЭЖХ и фенол-сернокислотного анализа соответственно (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).
Стандартные образцы эхинакозида (A0282), тубулозида A (A0942), актеозида (A0280), изоактеозида (A0281) и 2'-ацетилактеозида (A0943) были приобретены у Chengdu MustBiotechnology (Сычуань, Китай). Чистота всех стандартов составляет более 98 процентов. Наборы красителей Ниссля H&E были куплены у Boster (Ухань, Китай). Эдаравон (T0407-1) был куплен у TargetMol (Шанхай, Китай). Кроличьи антикрысиные MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) и мышиные антикрысиные CD31 (ab24590) были приобретены у Abcam Inc (Кембридж, Массачусетс, США). Кроличьи антикрысиные препараты Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) и Occludin (BS72035) были куплены у Bioworld Technology (Нанкин, Китай). Компания Cell SignalingTechnology Inc. (Бостон, Массачусетс, США) была источником кроличьего анти-крысиного синапсина -1 (SYN, 5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA, 19245T). GAPDH (HRP-60004) был приобретен у Proteintech Group, Inc. (Чикаго, США). Вторичные антитела поставлялись компанией Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Пекин, Китай). Hoechst 33258 был получен от Beyotime (Цзянсу, Китай).
РИСУНОК 1|Хроматограммы ВЭЖХ ТГ (A) и стандартных ссылок (B).
Животные
Крысы Sprague-Dawley (самцы, весом 250–300 г) были получены из Vital River Laboratory Animal Technology (Пекин, Китай) и помещены в кондиционируемую комнату с 12-часовым циклом свет/темнота. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE по исследованиям на животных (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Научно-медицинского центра Пекинского университета (LA2019123).
Протоколы экспериментов на животных
Крыс подвергали MCAO/R, как описано ранее (Wang et al., 2018). Вкратце, левую общую сонную артерию (ОСА), наружную сонную артерию (НСА) и внутреннюю сонную артерию (ВСА) обнажали, и 3-0 нейлоновый монофиламентный шов накладывали из НСА в ВСА до достижения средней мозговой артерии ( МКА). Через 1,5 ч окклюзии СМА моделировали реперфузию путем удаления нити. Во время операции температура тела всех крыс поддерживалась на уровне 37,0°С.
Администрация по наркотикам
Крыс случайным образом разделили на шесть групп с использованием программного обеспечения SPSS версии 22.0, как описано (Jiang et al., 2014): нормальная группа (NOR); группа моделей (MOD); группа эдеавона (положительный препарат, 6 мл/кг, EDI); группа ТГ (280 мг/кг, ТГ); Группа ФС (280 мг/кг, ФС) и группа ОС (280 мг/кг, ОС). ТГ, ФС и ОС вводили внутримышечно один раз в день после MCAO/R в течение 14 дней. Группы NOR и MOD лечили физиологическим раствором. Номера животных показаны в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1|Количество животных для разных экспериментальных групп и различные параметры через 14 дней после введения.
Измерение веса и шкалы модифицированного неврологического дефицита (mNSS)
Массу тела контролировали на 14-й день с использованием цифровых весов ADVENTURE™ (OHAUS, Нью-Джерси, США). NSS оценивали в соответствии с методом, описанным FJ Wang (Wang et al., 2018), с небольшими изменениями.
2, 3, 5-Окрашивание трифенилтетразолия хлоридом (ТТС)
Объем инфаркта измеряли, как описано ранее (Wanget al., 2015). Вкратце, мозг был разделен на семь равномерно расположенных коронарных блоков (2 мм). Эти срезы окрашивали 2-процентным ТТС (Coolaber, Пекин, Китай) при 37° в течение 15 мин. Объем инфаркта (в процентах)=(объем ипсилатерального ишемического полушария – объем контралатерального ишемического полушария)/объем контралатерального ишемического полушария × 100.
Окрашивание по Нисслю и H&E
Крыс глубоко анестезировали, затем весь мозг быстро извлекали из черепа, фиксировали с помощью 4-процентного параформальдегида, заливали в парафин и разрезали на срезы толщиной 7 мкм. Срезы окрашивали Нисслем и Н&Е. В этом исследовании шесть случайных полей размером 200 × 200 мкм были захвачены в каждом образце ткани с помощью светового микроскопа. Количество тел Ниссля подсчитывали с помощью программного обеспечения IPP версии 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, США).
Эванс синий анализ
Крысам вводили 2% EB (Coolaber Science & Technology Co., LTD) после MCAO/R. Через два часа крыс анестезировали, а затем быстро извлекали весь мозг и гомогенизировали в ацетоне. Супернатанты анализировали при 620 нм с помощью ридера поглощения 800 TS (BioTek, США).
Измерение активности каталазы (CAT), супероксиддисмутазы (SOD), малонового диальдегида (MDA) и глутатионпероксидазы (GSH-Px)
Все образцы сыворотки центрифугировали при 4 000 × об/мин в течение 15 минут при 4 градусах, а затем анализировали для определения активности MDA, CAT, SOD и GSH-Px в соответствии с инструкциями производителя (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd.). , Китай).
Вестерн-блоттинг анализ
Ткани головного мозга (100 мг), собранные у каждой крысы, гомогенизировали и лизировали в буфере для лизиса RIPA, а затем анализировали для определения концентрации белка с использованием набора BCA (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Суммарные белки тканей наносили на 10-процентные гели SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали с помощью 5-процентного обезжиренного молока, затем инкубировали в течение ночи с первичными антителами при 4 степени. Затем мембрану инкубировали со вторичным антителом. Вестерн-блоттинг анализировали с использованием цифровой системы обработки изображений Kodak (5200 Multi, Tanon, Китай).
Иммунофлуоресцентный анализ
Было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание на CD31, a-SMA, ZO-1, клаудин5, окклюдин, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 и Keap-1. Первичные антитела против Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, клаудин5, окклюдин, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 и Keap-1 разводили до 1:200 и 1:100 соответственно. Вторичные антитела Alexa Flur 488 мышиные антикроличьи IgG и родаминовые (TRITC) козьи антикроличьи IgG оба разбавляли до 1:200. Ядра окрашивали Hoechst 33258. Изображения получали с использованием автоматизированной системы визуализации Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, США). Экспрессию белка анализировали с использованием программного обеспечения IPP версии 6.0.
Статистический анализ
Все данные были описаны как среднее значение ± стандартное отклонение. Программное обеспечение SPSS версии 22.0было выполнено для статистического анализа. Односторонний ANOVA использовался при сравнении различных групп. P < 0,05="" считалось="" статистической="">
цистанхе бодибилдинг нейропротекция
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
ТГ увеличивают массу тела и уменьшают повреждения головного мозга у крыс MCAO/R
После 14 дней лечения с помощью TG, PS, Oss и EDI оценивали массу тела, неврологический дефицит и объемы инфаркта у крыс I/R. Результаты показали, что масса тела в группе MOD была значительно снижена, в то время как сниженная масса тела в группах TG, PS и EDI была явно увеличена (рис. 2A). Показатели неврологического дефицита были существенно снижены в группе EDI и TG (рис. 2B). Срезы головного мозга у крыс группы NOR были темно-красными, инфаркты отсутствовали, в то время как у крыс группы MOD наблюдался большой ипсилатеральный инфаркт головного мозга. После лечения ТГ объемы инфаркта значительно уменьшились (рис. 2С, D). Лечение ПС и ОС не оказало явного влияния на вышеуказанные показатели. Приведенные выше данные показали, что ТГ могут заметно облегчить повреждение головного мозга, вызванное И/Р, но не могут ФС и ОС.
РИСУНОК 2|ТГ уменьшают повреждение головного мозга, вызванное транзиторной фокальной ишемией головного мозга.
ТГ уменьшают гистопатологические повреждения у крыс MCAO/R
Чтобы определить некоторые эффекты лечения ТГ, ФС и ОС на гистопатологические повреждения, было проведено окрашивание H&E для выявления патологических повреждений. Гистоморфологические структуры головного мозга в группе ЯОР располагались закономерно. Изменения морфологии в группах ТГ были менее выраженными, чем в группе МОД. Однако группы лечения PS и OS не показали значительного улучшения морфологических изменений (рис. 3).
ТГ ослабляют повреждение нейронов у крыс, индуцированных И/Р
Окраска по Нисслю показала гистопатологические изменения нейронов в полутени зоны ишемии. Как показано на рисунке 4, нормальные нейроны имели четкое ядрышко и неповрежденную структуру. В группе МОД нейроны имели увеличенные межклеточные пространства. Тела Нисса исчезли, сморщились и покрылись глубокими пятнами. Однако эти изменения редко наблюдались в группах EDI, TG и PS. Эти результаты показали, что TG и PS могут значительно ослаблять повреждение нейронов, вызванное ишемией/реперфузией.
ТГ ослабляют нарушение ГЭБ после лечения крыс И/Р
Анализ с синим Эвансом является классическим методом исследования изменения проницаемости ГЭБ. Результаты эксперимента показали, что повышенное содержание синего Эванса наблюдалось в группе MOD, в то время как у крыс, получавших TG и EDI, наблюдалось значительное снижение синего Эванса. Более того, не было существенной разницы между группами терапии PS и OS (рис. 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что ТГ могут значительно ослабить нарушение ГЭБ.
РИСУНОК 3|ТГ уменьшают гистопатологические повреждения у крыс MCAO/R.
ТГ способствуют ангиогенезу у крыс с травмами И/Р
Более поздние исследования показывают, что ангиогенез играет критическую роль в неврологическом функциональном восстановлении и прогностическом исходе после острого ишемического инсульта (Yuen et al., 2015). Чтобы оценить влияние ТГ, ФС и ОС на ангиогенез, CD31 и a-SMA использовали для количественного определения капиллярного числа. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что группа MOD вызывала заметное снижение экспрессии CD31 (фиг. 6A, B) и a-SMA (фиг. 6C, D) в полутени ишемических областей у крыс I/R по сравнению со здоровыми крысами. Этот результат показал, что И/Р может вызывать повреждение сосудов в полутени коры ишемизированных полушарий. Тем не менее, лечение TG и EDI заметно увеличивало плотность капилляров, ангиогенез и артериогенез, на что указывало увеличение экспрессии CD31 и a-SMA. Эти результаты позволяют предположить, что ТГ могут способствовать ангиогенезу в ишемической полутени у крыс I/R, но PS и OS не могут.
ТГ увеличивают экспрессию белков плотных соединений у крыс с травмой И/Р
Нарушение ГЭБ может привести к повышению содержания воды в мозге и отеку тканей, что приведет к повреждению головного мозга. Белки плотных контактов являются важными структурными компонентами ГЭБ (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Чтобы проверить, может ли лечение TG, PS и OS после инсульта влиять на целостность ГЭБ, с помощью иммунофлуоресцентного анализа была проведена экспрессия ZO-1, клаудина-5 и окклюдина. Результаты показали, что экспрессия клаудина-5, окклюдина и ZO-1 была заметно снижена в группе MOD. Однако они были существенно повышены после 14 дней введения ТГ. Группы PS и OS не показали значительных изменений экспрессии этих белков (рис. 7). Эти данные указывают на то, что TGs могут регулировать экспрессию белков плотных контактов и, вероятно, поддерживать целостность BBB после повреждения I/R.
ТГ увеличивают покрытие перицитов капилляров у крыс с травмой И/Р
Покрытие перицитов на капиллярах играет критическую роль в поддержании целостности ГЭБ (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Таким образом, мы проверили, может ли покрытие перицитов быть увеличено при лечении ТГ, ФС и ОС. Результаты анализа интенсивности иммунофлуоресценции показали, что экспрессия как PDGFRb, так и CD31 была резко снижена в группе MOD. Введение TGs крысам I/R значительно восстанавливало или даже повышало интенсивность экспрессии PDGFRb и CD31, но никаких различий не наблюдалось в группах лечения PS и OS (фиг. 8). Таким образом, лечение ТГ может значительно увеличить охват перицитов. Эти результаты также подтвердили, что TGs могут поддерживать целостность BBB после I/R.
ТГ способствуют ремоделированию нервной системы у крыс с I/R-травмой
Согласно многочисленным исследованиям, нейрогенез после инсульта может значительно улучшить функциональное восстановление (Grefkes and Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Синаптофизин (SYN), белки постсинаптической плотности 95 (PSD-95) и белок 2, ассоциированный с микротрубочками (MAP-2), использовали в качестве маркеров для исследования пластичности нейронов в ишемической полутени коры. Чтобы оценить влияние лечения ТГ, ФС и ОС на нейрогенез у крыс с травмами И/Р, проводили иммунофлуоресценцию и вестерн-блоттинг для экспрессии SYN, PSD95 и MAP-2. Как показано на рисунках 9 и 10, уровни экспрессии SYN, PSD95 и MAP-2 у крыс I/R после 14 дней реперфузии снизились по сравнению с крысами NOR, в то время как лечение TG и PS могло значительно повысить уровень их экспрессии. . Группа OSs не имела существенных изменений по сравнению с группой MOD. Данные показали, что лечение TG и PS способно резко стимулировать ремоделирование нейронов после I/R повреждения.
ТГ изменяют экспрессию Nrf-2 и сохраняют-1 экспрессию у крыс с травмой I/R
Окислительный стресс является основным патогенетическим механизмом при И/Р-повреждении (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Исследования подтвердили, что Nrf-2 является главным регулятором антиоксидантных реакций (Thompson et al., 2015). Чтобы исследовать Nrf-2 и Keap-1 опосредованные окислительные ответы после I/R повреждения, мы оценили цитоплазматическую экспрессию, а также ядерную транслокацию Keap-1. Между тем, экспрессия Nrf{{7 }} в И/Р также анализировали мозговые ткани поврежденных крыс (Фиг.10 и 11). По данным иммунофлуоресцентного анализа было обнаружено, что Nrf-2 в основном расположен в цитоплазме в группе NOR. В группе ТГ экспрессия Nrf-2 в цитоплазматической локализации подавлялась, но повышалась в ядре, также наблюдалось снижение экспрессии Keap-1. Данные показали, что защита мозга ТГ может быть связана с модуляцией Nrf-2 и Keap-1.
РИСУНОК 4|ТГ ослабляют повреждение нейронов у крыс, получавших И/Р.
ТГ ослабляют окислительный стресс в ткани головного мозга у крыс с травмой И/Р
Для подтверждения антиоксидантного действия ТГ оценивали активность СОД, КАТ, GSH-Px и МДА у крыс с травмой И/Р. На рисунке 12 содержание МДА было заметно повышено в группе МОД, и в то же время активность СОД, КАТ и GSH-Px была снижена по сравнению с нормальными крысами. Наоборот, лечение ТГ привело к значительному снижению содержания МДА и повышение активности СОД, КАТ и GSH-Px. Эти результаты еще раз подтвердили антиоксидантную активность ТГ.
ОБСУЖДЕНИЕ
Многие исследования показывают, что ТКМ C. Deserticola обладает обширной биологической активностью, например, повышает способность к обучению, память и иммунитет (Dong et al., 2007; Jiang and Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018). ). Однако активные компоненты C. Deserticola для нейропротекции остаются неясными. Текущая работа направлена на скрининг активных компонентов C. Deserticola против ишемического инсульта на модели MCAO/R. Три экстракта из C. Deserticola (ТГ, ФС и ОС) использовали для оценки их воздействия на крыс MCAO/R, а также возможных механизмов.
Инсульт — распространенное острое цереброваскулярное заболевание. Эпидемиологические исследования показывают, что инсульт чаще встречается у мужчин, чем у женщин (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). Таким образом, в нашем эксперименте для испытаний были взяты крысы-самцы. Наши результаты доказали, что индукция И/Р ускоряет окислительный стресс и объем инфаркта, нарушая ГЭБ и приводя к повреждению нервов и сосудов головного мозга. После скрининга было обнаружено, что ТГ уменьшают объем инфаркта и способствуют ремоделированию нервной системы и ангиогенезу. Кроме того, наблюдалось, что TG сохраняли целостность ГЭБ после И/Р повреждения. Напротив, PS и OS не приносят значительного облегчения травм I/R. Таким образом, ТГ считаются основной активной фракцией C. Deserticola для нейропротекции, потенциально способствуя ремоделированию нейронов, ангиогенезу и целостности ГЭБ посредством активации пути Nrf-2/Keap-1.
РИСУНОК 5|ТГ ослабляют нарушение ГЭБ после повреждения И/Р.
Все больше данных указывает на то, что создание эффективного коллатерального кровообращения имеет большое значение для предотвращения образования инфаркта и ишемической полутени, а также является важным методом лечения на ранней стадии ишемического инсульта (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Пролиферация эндотелиальных клеток сосудов и гладкомышечных клеток после ишемического инфаркта определяет установление коллатерального кровообращения. Однако модели ишемии имеют общее явление, то есть окислительный стресс, широко распространенный в микроциркуляторном русле головного мозга. Данные исследований показали, что большое количество антиоксидантов может нарушать функцию ГЭБ и свойства ангиогенеза (Mentor and Fisher, 2017). CD31 и a-SMA являются маркерами сосудистых эндотелиальных клеток, а также гладкомышечных клеток соответственно (Saboor et al., 2016). Чтобы исследовать влияние экстрактов из C.deserticola на вышеупомянутую пролиферацию клеток, мы исследовали экспрессию CD31 и a-SMA в гомогенате полутени после ишемии головного мозга. Наши данные показали, что ТГ резко усиливали экспрессию CD31 и a-SMA. Однако существенных различий для групп с ПС и ОС не было. Таким образом, мы пришли к выводу, что ТГ могут уменьшать повреждение головного мозга, способствуя ангиогенезу за счет увеличения экспрессии CD31 и a-SMA, тогда как ФС и ОС не обеспечивают такой защиты от повреждения головного мозга. Эти результаты дополнительно подтвердили, что только триглицериды могут предотвратить церебральное повреждение И/Р.
Ишемический инсульт можно рассматривать как результат церебралишемии, вызванной нарушением пластичности нейронов или ремоделированием областей мозга. Большинство пациентов с инсультом страдают неврологическим дефицитом. Активация нейрогенеза является многообещающей стратегией для пациентов, перенесших инсульт, для улучшения их неврологических функций (Cramer and Chopp, 2000). Нейрогенез непосредственно участвует в восстановлении неврологической функции после I/Rinjury головного мозга (Zhang et al., 2019). Предыдущие исследования показывают, что ТГ могут повышать выживаемость пирамидных клеток гиппокампа и индуцировать нейрогенез (Lian et al., 2017). Окислительный стресс вызывает потерю нейронов при многих заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона, инсульт и т. д. (Duan and Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2транскрибирует множество генов, связанных с нейропротекцией в их промоторной области, в основном включая SOD, MDA, CAT и g-глутамилцистеинлигазы и т. д. (Satoh et al., 2006). Белки SYN, PSD-95 и MAP-2, тесно связанные с образованием синапсов и нейротрансмиссией, можно рассматривать как маркеры исследования пластичности нейронов в области ишемической полутени. ТГ могут значительно повышать экспрессию PSD95, SYN и MAP-2, указывая на то, что церебральная защита ТГ коррелирует с повышенной пластичностью нейронов во время И/Р. как группы ОС. Эти результаты показали, что ТГ могут повышать нейропластичность после церебральной И/Р-травмы.
Визуализирующие исследования пациентов с инсультом показали, что дисфункцию ГЭБ можно рассматривать как поразительный признак периишемического мозга (Bang et al., 2007). TJs, состоящие из цитоплазматических белков, трансмембранных белков и соединительных молекул адгезии между капиллярными эндотелиальными клетками, очень важны для поддержания целостности ГЭБ (Ye et al., 2019). Среди них ZO-1, claudin-5 и occludin являются наиболее важными белками в TJ. Все больше данных указывает на то, что повышенная проницаемость ГЭБ, вызванная ишемией, обычно коррелирует с изменениями ZO-1, клаудина-5 и окклюдина (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Лю и др., 2018). В этой работе результаты продемонстрировали, что, хотя ТГ могут значительно увеличивать экспрессию белков ZO-1, клаудин-5 и окклюдин в тканях мозга, индуцированных MCAO, ни PSs, ни OS этого не делают. ГЭБ состоит из церебральных эндотелиальных клеток и тесно связан с перицитами (Nyul-Toth et al., 2016). Перициты жизненно важны для целостности ГЭБ (Bell et al., 2010). Ишемический инсульт вызывает гибель перицитов и отслоение их от эндотелиальных клеток головного мозга в острой фазе, что приводит к дестабилизации микроциркуляторного русла и изменению свойств ГЭБ (Zechariahe et al., 2013). Наши данные показали, что ТГ могут увеличивать покрытие перицитов капилляров и повышать уровни экспрессии ZO-1, клаудина-5 и окклюдина. Эти явления доказывают, что ТГ могут эффективно защищать целостность ГЭБ после церебральной И/Р-травмы. Таким образом, ТГ могут ослаблять мозговое повреждение несколькими способами, такими как стимулирование ангиогенеза, улучшение пластичности нейронов и поддержание целостности ГЭБ.
Затем мы исследовали сигнальный путь, чтобы изучить механизм, лежащий в основе защиты мозга ТГ. Процесс повреждения И/Р является многофакторным, поэтому в патогенез вовлечены многочисленные механизмы. Окислительный стресс является фундаментальным фактором риска, способствующим И/Р-индуцированному повреждению головного мозга (Suda et al., 2013), такому как повреждение структуры ГЭБ, сосудистая эндотелиальная дисфункция и усугубление ишемического повреждения нейронов (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2015; Caglayan et al., 2013). и др., 2019; Пристли и др., 2019). Таким образом, окислительный стресс стал привлекательной терапевтической мишенью при И/Р-индуцированном повреждении головного мозга. считается важным средством, с помощью которого нейроны защищаются от окислительного стресса (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Все больше данных указывает на то, что активация Nrf-2 во время И/Р является потенциальной терапевтической мишенью для нейропротекции (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, как важный регулятор эндогенной антиоксидантной защиты, опосредует уровень гемоксигеназы 1 (HO-1) и других антиоксидантных ферментов, таких как НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктаза1 (NQO1), СОД, CAT, GSH и MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Более того, Nrf-2 играет важную регуляторную роль в ангиогенезе. Настоящее исследование показывает, что Nrf-2 может быть значительно усилен и активирован в процессе развития сосудов (Wei et al., 2013).
Как описано ранее (Jiang and Tu, 2009), ТГ содержат множество биоактивных соединений, например, эхинакозид, тубулозид А, актеозид, изоактеозид и 2'-ацетилактеозид, и некоторые из них проявляли нейропротекторные функции после церебрального И/Р повреждения (Penget al. ., 2016). Эхинакозид обладает множеством фармакологических эффектов, таких как антиоксидантное, антистарение, нейропротекция, противовоспалительное действие, стимуляция рубцевания, гепатозащита, стимуляция формирования костей и противоопухолевое действие (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Недавно эхинакозид был идентифицирован как мощный антиоксидант в центральной нервной системе (Lu et al., 2016). Эхинакозид может снижать содержание MDA и повышать активность SOD и GSH Px при ишемическом повреждении головного мозга, а анализ молекулярного докинга показал, что эхинакозид может связываться с Keap-1, что приводит к ядерной транслокации Nrf-2 (Li et al. , 2018). Исследование Xia показало, что актеозид может уменьшить объем инфаркта и содержание воды в мозге, чтобы улучшить неврологический дефицит у крыс MCAO/R за счет смягчения окислительного стресса (Xia et al., 2018). Другие исследования показали, что изоактеозид может повышать активность клеточных антиоксидантных ферментов, СОД и КАТ в клетках V79-4, обработанных водой (Chae et al., 2005). На основании приведенных выше сообщений об активных соединениях, содержащихся в ТГ, можно сделать вывод, что ТГ могут защищать от ишемического инсульта посредством путей антиоксидантного действия.
Ли сообщил о нейропротекторном действии фенилэтаноидгликозидов (PhG) на H2O2-индуцированный апоптоз в клетках PC12 через путь Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Эти PhG были значительно подавлены за счет запуска ядерной транслокации Nrf2 и повышения экспрессии HO-1, NQO1, каталитической субъединицы глутамат-цистеинлигазы (GCLC) и субъединицы-модификатора глутамат-цистеинлигазы (GCLM) (Li et al., 2018; Gong et al. др., 2019). Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что путь Nrf-2/ARE играет решающую роль в опосредованном PhG защитном действии на нервные клетки. Точно так же в этом исследовании мы обнаружили, что ТГ могут снижать уровень МДА и повышать уровни СОД, КАТ и GSH-Px у крыс I/R. В то же время ТГ могут усиливать экспрессию Nrf2 в ядре, подавлять соответствующую экспрессию в ядре. цитоплазме и значительно снижают экспрессию Keap-1. Следовательно, путь Nrf-2/Keap-1 может быть вовлечен в опосредованные ТГ нейропротекторные эффекты. В будущем будет проведена дальнейшая проверка этого пути в культуре клеток in vitro с моделями кислородно-глюкозной депривации/реоксигенации. Более того, К. Экстракты Deserticola вводили в нашем исследовании в течение 14 дней непрерывно. Поскольку нейрогенез у взрослых может повлиять на интерпретацию нейропротекторных эффектов в течение 14 дней реперфузии, нейрогенез нельзя исключать в нашем текущем дизайне эксперимента по изучению нейропротекторного эффекта КТ. Это ограничение нашего исследования.
В заключение, именно TG из C. Deserticola могут усиливать ангиогенез и нейрогенез, а также поддерживать целостность ГЭБ у крыс с травмой I/R, но не PS и OS. Эффекты могут быть опосредованы активацией пути Nrf-2/Keap-1.
