Эффект снижения мочевой кислоты и механизм актеозида и эхинакозида, экстрагированного из Cistanche Tubulosa
Mar 03, 2025
Абстрактный:Стремиться исследовать эффекты понижения мочевой кислоты и механизмы актеосида (AS) и эхинакозида (ECH), извлеченных изCistanche Tubulosa.
МетодыМодель крысы гиперурикемии (HUA) была установлена с использованием оксоната калия (1,5 г · кг -1 · d -1) в сочетании с аденином (100 мг · кг -1 · D -1). Крысы модели HUA были случайным образом разделены на контрольную группу модели, группу аллопуринола (30 мг · кг -1 · D -1), как низкие и высокие (50, 100 мг · кг -1 · d {{13}) Dose Group Mg · кг -1 · D -1) дозы. Нормальная контрольная группа была ранее установлена. После четырех недель введения анализатор биохимии крови использовался для обнаружения уровней SUA мочевины, CREA, аденозин -деаминазы (ADA) и мочевой кислоты (UUA) в моче. Иммуноферментный анализ, связанный с ферментом, использовали для обнаружения уровней ксантиноксидазы (XOD) в сыворотке. Ткань почек собирали, а коэффициент почек был взвешен и рассчитывали. Окрашивание гематоксилин эозин (HE) использовалось для наблюдения за почечными патологическими изменениями. Иммуногистохимия (IHC) и ПЦР в реальном времени использовали для обнаружения уровней экспрессии белка и мРНК транспортера URATE 1 (URAT1), транспортера глюкозы 9 (GLUT9), транспортера органического аниона 1 (OAT1) и органического анионного транспортера 3 (OAT3) в ткани почек. Результаты AS и ECH могут улучшить функцию почек у модельных крыс HUA, снижать уровни мочевой кислоты в крови, способствовать экспрессии мочевой кислоты, понижающего уровня ADA и XOD в сыворотке, а также повышать экспрессию белка и мРНК URAT1 и GLUT9 в почечной ткани, одновременно повышая экспрессию белка и мРНК на OAT1 и OAT3 в ткани почек.
Выводы. Фенилетаноидные гликозиды как и ECH из Cistanche Tubulosa могут оказывать эффекты снижения мочевой кислоты, улучшая функцию почек у модельных крыс HUA, снижения уровней ADA и XOD и регулируя экспрессию URAT1, GLUT9, OAT1 и OAT3.
Ключевые слова: Cistanche Tubulosa; актеозид; эхинакозид; гиперурикемия; уменьшение мочевой кислоты; механизм
Экстракт Cistanche Tubulosa с 16% актеозидом
Гиперрикемия (HUA) представляет собой метаболическое заболевание, вызванное неупорядоченным метаболизмом пурина в организме человека, что приводит к повышенным уровням мочевой кислоты в крови [1]. Обычно диагностируется, когда уровни мочевой кислоты в крови превышают 7. 0 mg · dl⁻⁻ (416. 0 µmolt·L⁻⁻) у мужчин и 6. 0 mg · dl⁻⁻ (357. 0} cmol·) in). Развитие гиперурикемии в первую очередь связано с такими факторами, как диета с высоким содержанием пищи, хроническое употребление алкоголя, употребление лекарств и гипотиреоз. Это не только увеличивает риск сердечно -сосудистых заболеваний, диабета и гипертонии [3-4], но также значительно влияет на здоровье пациентов.
В настоящее время клиническое лечение гиперурикемии в основном включает лекарства, которые ингибируют выработку мочевой кислоты и способствуют экскреции мочевой кислоты. Однако эти методы лечения имеют определенные ограничения для пациентов с нарушением функции печени или почек [5-6]. Следовательно, изучение эффективных лекарств с низкими побочными эффектами имеет большое значение для профилактики и лечения гиперурикемии.
Cistanche Tubulosa (Schenk) R. Wightобычно используется в традиционной китайской медицине в качестве травы, тонифицирующей почки, используется для лечения таких состояний, как импотенция, бесплодие, дефицит сущности и крови, слабость в нижней части спины и колени, мышечная слабость и запор из-за сухости кишечника [7]. Исследования показали, чтоCistanche Tubulosaобладает нейропротекторным [8], противовоспалительным [9], регулированием метаболизма костей [10] и эффектами повышения эффективности у химиотерапии для больных раком [11]. Среди различных активных компонентов фенилетаноидные гликозиды являются наиболее распространенными.
Актеозид (AS) и эхинакозид (ECH), два фенилетаноидных гликозида с высоким содержанием вCistanche Tubulosa, проявлять сильную биологическую активность и обладать значительным потенциалом для разработки и применения. Следовательно, наша исследовательская группа выбрана как и ECH для дальнейшего изучения. Через сетевую фармакологию прогнозы и пре-эксперименты у мышей мы обнаружили, что фенилетаноидные гликозидные экстракты изCistanche TubulosaМожет иметь определенный эффект снижения мочевой кислоты. Однако пути и механизмы этих эффектов остаются неясными.
Таким образом, используя механизмы выработки мочевой кислоты и ее первичных путей экскреции в качестве направления исследования, мы исследовали эффекты снижения мочевой кислоты фенилетаноидных гликозидных экстрактов AS и ECH. Это исследование направлено на выяснение путей и механизмов, с помощью которых AS и ECH оказывают свои эффекты снижения мочевой кислоты.
1 материалы
1.1 Экспериментальные животные
Семьдесят мужские крысы SPF-Dawley (SD), весом 150–180 г, были приобретены у экспериментального центра животных Синьцзянского медицинского университета. Лицензия на животноводство: scxk (xin) 2023-0001. Этот эксперимент был одобрен Комитетом по этике животных Синьцзянского автономного региона Уйгурского научного института медицины, с номером утверждения этики животных: IACUC- (Zhun) -2024-009.
1.2 Препараты и реагенты
Фенилетаноидные гликозидные экстракты (AS и ECH)отCistanche Tubulosa (purity >98%, проверенные с помощью высокоэффективной жидкой хроматографии) были извлечены, очищены и подготовлены ключевой лабораторией науки о составе Уйгур, Синьцзянский институт научно-исследовательского института медицины Уйгур. Номера партий: 20220617 (AS) и 20220526 (ECH).
Таблетки аллопуринола, Номер партии: 62208726, изготовленная Jiangsu Wanbang Biochemical Pharmaceutical Group Co., Ltd.
Оксонат калияиАденин, партийные номера: I2130050 и C2202255, приобретенные у Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
Crea (креатинин), UA (мочевая кислота), мочевина и ADA (аденозин -деаминаза), партийные номера: 141123010, 141223004, 141323008 и 043624005, приобретенные у Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.
Набор для анализа активности XOD (ксантиноксидаза), Номер партии: Y10001219, приобретенный у Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.
Антитела (Urat1, Glut9, Oat1, Oat3), номера партий: 3i5723 0, 92F0296/4, 0F33081/2I44618, приобретенные у Affinity Biosciences.
HRP-меченный козий анти-Rabbit IgG, Номер партии: 245440113, приобретенный у ZSGB-Bio.
Окрашивание гематоксилина, Номер партии: 24135741H, приобретенная у Pecijing Lanjieke Technology Co., Ltd.
Набор хромогенного реагента DAB, Номер партии: 240010512, куплен у ZSGB-Bio.
DEPC (диэтил пирокарбонат), номер каталога: d 60029-500 ML, приобретено у Amresco (США).
M5 Hiclear DL2000 ДНК -маркер, Номер каталога: MF025, приобретенный у Pecijing Genomics Biotechnology Co., Ltd.
Реагент Trizol ™, номер каталога: 15596026, приобретенный у Thermo Fisher Scientific (США).
5x All-In-One RT MastermixиEvagreen Express 2 × QPCR Mastermix Low Rox, Номера каталогов: G492 и G891, приобретенные у Applied Biological Materials Inc. (ABM).
2 Методы
2.1 Модельное создание и группировка
Семьдесят мужских крыс Sprague-Dawley (SD) акклиматизировали и разделены на две группы: нормальная контрольная группа (1 0 крысы) и контрольная группа модели (60 крыс). Нормальную контрольную группу вводили 0,5% CMC-NA через желудочный зонд. Контрольной группе модели вводили оксонат калия (1,5 г · кг) в сочетании с аденином (100 мг · кг) в дозе 10 мл · кг, один раз в день в течение 14 дней подряд. Модель считалась успешно установленной, когда уровни мочевины, CREA и SUA значительно увеличились, что измеряется биохимическим анализатором.
Крысы модели гиперурикемии были дополнительно разделены на следующие группы на основе уровней SUA, мочевины и CREA: контрольная группа модели, группу аллопуринолов (3 0 мг · кг), низкая доза как группа (50 мг · кг), высокая доза (100 мг · kg⁻⁻), нижняя доза (50 мг. ECH Group (100 мг · кг), с 10 крысами в каждой группе. Чтобы поддерживать стабильную гиперурикемию, всем группам, кроме нормальной контрольной группы, вводили оксонат калия (500 мг · кг) в сочетании с аденином (100 мг · кг) через утра через дневной зонд. Нормальная контрольная группа получила 0,5% раствор CMC-NA утром и питьевой водой во второй половине дня в дозе 10 мл · кг, один раз в день в течение 14 дней подряд. После этого введение моделирующих агентов было остановлено, а соответствующие лекарства постоянно вводились ежедневно в течение дополнительных 14 дней.
2.2 Сбор образцов
После окончательной дозы крыс постились в течение ночи (вода не была ограничена). Моча из каждой группы была собрана для тестирования мочевой кислоты. В массе тела измеряли после поста, а образцы крови собирали под наркозом. Сыворотка была разделена центрифугированием и хранилась для будущего использования. Ткани почек были собраны и взвешены. Одна почка была фиксирована в 4% растворе параформальдегида, в то время как другая была заморожена в жидком азоте для дальнейшего анализа.
2.3 Измерение мочевой кислоты в моче крыс
Образцы мочи из каждой группы центрифугировали (3, 000 r · min⁻⁻, 10 мин, радиус центрифуги 14 см), и супернатант был собран. Образцы мочи разбавляли 1: 9 с физиологическим раствором и анализировали на содержание мочевой кислоты с использованием биохимического анализатора.
2.4 Измерение ADA, мочевины, CREA и SUA в сыворотке крыс
Образцы крови из каждой группы центрифугировали (3, 000 r · min⁻⁻, 10 минут, радиус центрифуги 14 см) и сыворотка была собрана. Уровни ADA, мочевины, CREA и SUA в сыворотке измеряли с использованием биохимического анализатора.
2.5 Измерение XOD в сыворотке крыс
Изменения в уровнях XOD в сыворотке крыс измеряли с использованием ферментативного анализа в соответствии с инструкциями производителя. Первоначальная абсорбция (a₁) и конечная абсорбция (A₂) при 290 нм были записаны, и было рассчитано ΔA (ΔA=a₂ - A₁). ΔA был заменен в формулу:
Xod (nmol⁻⁻ · min⁻⁻ · ml⁻⁻)=[Δa × Система реакционной системы Общий объем ÷ (коэффициент молярной экстинкции моровой кислоты × Длина оптического пути) × 10⁹] ÷ Объем образца ÷ время {{2} × ΔA,
Рассчитать количество мочевой кислоты, катализируемой на минуту на миллилитр сыворотки.
2.6 Измерение коэффициента почек
Ткани почек собирали, промывали физиологическим раствором, а избыточная вода удаляли. Вес органа была точно измерена, и коэффициент почек был рассчитан следующим образом:
Коэффициент почек=Вес почки (мг) / масса тела (G).
2.7 Гистопатологическое наблюдение за ткани почек с помощью окрашивания.
Ткани почек, фиксированные в 4% растворе параформальдегида, дегидратировали с градуированными концентрациями этанола, очищали ксилолом, встраивали в парафин и сезились на 4- мкм срезы. Срезы депарафинизировали ксилолом, гидратировали градуированным этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином (HE) и герметизировали нейтральной жевательной резинкой. Морфологические изменения в ткани почек наблюдались под световым микроскопом, а изображения были получены при увеличении 400 ×.
2.8 Обнаружение экспрессии белка URAT1, GLUT9, OAT1 и OAT3 в ткани почек с помощью IHC
Ткани почек, фиксированные в 4% растворе параформальдегида, дегидратировали с градуированными концентрациями этанола, очищали ксилолом, встраивали в парафин и срези. Были выполнены извлечение антигена и блокировки козьей сыворотки. Первичные антитела (URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3) добавляли при разведении 1: 200 и инкубировали в течение ночи на 4 градуса. На следующий день секции промывали PBS, высушены на воздухе и инкубировали с меченным биотином козьего анти-кролика IgG на 37 градусов в течение 30 минут. Срезы промывали PBS и инкубировали с хромогенным реагентом DAB в течение 10 минут с последующим промыванием PBS, окрашиванием гематоксилином в течение 3 минут, дифференцировке с раствором этанола соляной кислоты, литий -карбонатным синим, дегидратацией с градиентным этанолом, очисткой с помощью ксилола и герметизации нейтральной камни.
Для каждой крысы были выбраны два случайных 4 0 0 × поля почек. Положительное окрашивание (коричнево-желтое) было проанализировано, и интегрированная оптическая плотность (IOD) каждого поля была измерена с использованием Image-Pro Plus 6.0 для статистического анализа.
