Отбеливающая активность компонентов, выделенных из пульпы Trichosanthes

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Жунчао Чжан, 1, 2 Сюцинь Ху, 1 Бо Чжан, 1 Чжэнь Ван, 1 Чуньсян Хао, 1 Цзе Синь, 1 и Цинмэй Го 2

Абстрактный: Отбеливаниерынок косметики имеет светлое будущее, и чистые натуральные отбеливающие продукты традиционной китайской медицины всегда были в центре внимания исследователей. В этом исследовании отбеливающий активный ингредиент пульпы китайской медицины Trichosanthes был впервые выделен и очищен.отбеливаниемеханизм прояснился. Для их выделения и очистки использовали хроматографические методы, такие как силикагель, ODS и ВЭЖХ. Клетки В16 использовали для измерения антиоксидантной активности,тирозиназаактивность и активность удаления меланина. Всего было выделено 20 соединений, в том числе п-гидроксибензальдегид (1), салициловая кислота (2), ванилиновая кислота (3), изованиловая кислота (4), протокатехуат (5), транс-коричная кислота (6), {{9 }}кумаровая кислота (7), транс-феруловая кислота (8), дрекслерол-Б (9), циклогексанол 3-пальмитат (10), 5-ацетоксиметил-2-фуральдегид (11), 5-гидроксиметилфурфурол (12), диосметин (13), апигенин (14), хризоберил (15), лютеолин (16), 4'-гидроксискутелларин (17), кверцетин (18), 3',{{31} }дигидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4'-метоксифлавон (19) и ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид (20). Среди них соединения 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 обладают хорошим антиоксидантным восстанавливающим действием; соединения 3, 4, 5, 6 и 7 обладают высоким ингибированием черни; соединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 обладают очевидной ингибирующей активностью в отношении тирозиноксидазы. 1е результаты заложили основу для дальнейшего развития и использования ресурсов целлюлозы Trichosanthes, а также обеспечивают основу для развития природныхотбеливаниекосметика.

Цистанхе траваэтонатуральный отбеливающий ингредиент.

1. Введение

Trichosanthes kirilowii Максим. многолетнее вьющееся травянистое растение семейства тыквенных. Его плоды, семена, кожура и корень широко используются в качестве традиционных китайских лекарств. В течение длительного времени мякоть Trichosanthes часто выбрасывается при производстве и переработке Semen Trichosanthis и Pericarpium Trichosanthis, что приводит к значительным потерям. В настоящее время отчеты о мякоти Trichosanthes в основном сосредоточены на сравнении содержания сахара, аминокислот, витаминов и других питательных веществ [1–4]. О химическом составе пульпы Trichosanthes сведений нет. Поэтому необходимо систематически изучать химические составляющие пульпы.

В то же время, с быстрым развитием экономики, косметика становится не только товаром высокого потребления, но и самым популярным «предметом первой необходимости» для женщин. Во многих классических книгах по китайской медицине или materiamedica записано, что мякоть Trichosanthes выполняет функциюотбеливаниеи эффекты удаления морщин [5-7]. 1e предыдущие результаты нашей исследовательской группы показывают, что водный экстракт мякоти Trichosanthes имел более высокуютирозиназаингибирующая активность, а скорость ингибирования тирозиназы составляла около 70 процентов. 1eобщийотбеливаниев качестве контрольных веществ использовали препараты витамин С (ВК) и арбутин [8]. Предварительно было доказано, что экстракт мякоти трихозантеса оказывает определенное отбеливающее действие за счет ингибирования активности тирозиназы. Поэтому очень важно изучить химический состав и механизм отбеливания пульпы Trichosanthes.

отбеливаниеМеханизм можно резюмировать как ингибирование синтеза меланина и ускорение переноса меланина. 1д Процесс образования меланина в меланоцитах выглядит следующим образом:тирозиназаокисляет тирозин до полиморфной БА (ДОФА); затем он окисляется до допахинона. После ряда метаболических реакций образуется меланин. Тирозиназа является единственным ферментом, ограничивающим скорость в реакционном процессе, и его активность определяет количество синтезируемого меланина. При повышении активности тирозиназы увеличивается синтез меланина; при ингибировании активности тирозиназы синтез меланина снижается [9]. 1e активный центр тирозиназы имеет двойной активный центр меди, и каждый ион меди соединяется с 3 гистидиновыми остатками с 1 или 2 валентностями соответственно. Следовательно, восстановление с антиоксидантным действием может взаимодействовать с атомом меди в активном центре тирозиназы или восстанавливать промежуточное соединение в процессе синтеза меланина, чтобы ингибировать образование меланина [10, 11]. Кроме того, ингибирование перехода зрелых меланоцитов в кератиноциты также может играть роль в отбеливании.

Технология клеточных культур используется для определения эффектаотбеливаниеактивные ингредиенты натирозиназаактивности и продукции меланина в меланоцитах in vitro. Клеточная линия мышиной меланомы 1e (клетки B16) получена из клеток меланомы кожи мыши, и ее основная структура, особенно в отношении синтеза меланина, в основном такая же, как и у нормальных клеток меланомы человека. Поскольку культивировать первичные клетки меланомы кожи человека очень сложно, модель мыши можно использовать в качестве тест-клетки для определенияотбеливаниеактивные ингредиенты. Поэтому клетки В16 использовали для измерения антиоксидантной активности, активности тирозиназы и активности по удалению меланина, а также предварительно определяли отбеливающие активные компоненты и связанный с ними механизм. Результаты заложили основу для дальнейшего развития и использования ресурсов целлюлозы Trichosanthes, а также послужили основой для разработки натуральной отбеливающей косметики.

2. Эксперименты

2.1. Материалы.

Trichosanthes trichosanthis был собран с базы выращивания лекарственных трав Hebao в Пиньине, Цзинань. Образцы 1e были идентифицированы профессором ЦинмейГо из Шаньдунского университета традиционной китайской медицины. После удаления кожуры и семян получали мякоть плода. После сублимационной сушки целлюлозу измельчали, перемешивали и, наконец, помещали в эксикатор для дальнейшего использования.

свежий цистанхесэхинакозидпоследствия

2.2. Жизнеспособность клеток.

Клетки B-16 (клетки мышиной меланомы) были приобретены у KeyGEN и выдерживались в среде DMEM с добавлением 10-процентной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) при температуре 37 градусов во влажной атмосфере с 5-процентным содержанием CO2. 1en, В-16клетки высевали в 96-луночные планшеты (10 × 104 клеток/лунку) на 24 ч инкубации.

2.3. Приготовление различных экстрактов.

Сырье мякоти Trichosanthes kirilowii составляло 4,5 кг. 1е пульпу замачивали в 10 кратном количестве 95-процентного этанола 3 раза. Экстракты 1e объединяли и концентрировали примерно до 3,0 л. Экстракт этилацетата получали путем диспергирования этанольного экстракта в 15 л воды, экстрагируя его этилацетатом до тех пор, пока экстракт не становился бесцветным. Экстракты 1e объединяли и концентрировали при пониженном давлении.

Этилацетатный экстракт смешивали с силикагелем (100–200 меш) в соотношении 1:2 (экстракт: силикагель, об/мин). в). 1 растворитель выпаривали, гель сохраняли. 1e стеклохроматографическая колонка (8{{30}} мм × 1200 мм) была заполнена силикагелем 200–300 меш и D101 макропористой смолы, а затем колонку элюировали этилацетатом, петролейным эфиром (10, 25, 50, 75 и 100 процентов) и метанолом, этилацетатом (5 процентов, 10 процентов, 25 процентов, 50 процентов). , 75 процентов и 100 процентов), чтобы собрать каждый поток. Наконец, каждая фракция была собрана и настроена на следующие концентрации: 0,003125 мг/мл, 0,00625 мг/мл, 0,0125 мг/мл, 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл. мл, 1,0 мг/мл и 2,0 мг/мл, а затем использовали для обработки культивируемых клеток. В конце обработки в каждую лунку добавляли по 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл). 1е инкубировали в течение 20 мин при 37°С. 1-супернатант отбрасывали и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО. 1е поглощение измеряли при 490 нм. 1-й опыт был повторен 3 раза. 1е коэффициент выживаемости рассчитывали следующим образом:

процент выживаемости=(экспериментальная группа, пустая группа)/(контрольная группа - пустая группа) × 100 процентов.

Оптимальную концентрацию (C1) каждой фракции рассчитывали в соответствии с функциональной взаимосвязью между выживаемостью и концентрацией каждой фракции. C1 разбавляли в 2, 4, 6 и 8 раз для получения концентраций C2, C3, C4 и C5 соответственно. 1e различные экстракты пульпы показаны в таблице 1.

Таблица 1: Полярные экстракты пульпы Trichosanthes и оптимальная концентрация.

2.4. Эксперимент по отбеливанию

2.4.1. Антиоксидантный тест.

Для определения жизнеспособности клеток использовали анализ МТТ (набор МТТ, Kaiji Biology). 1en, клетки B-16 высевали в 96-луночные планшеты (10 × 104 клеток/лунку) на 24 часа и обрабатывали различными экстрактами или соединениями в течение 24 часов. После обработки культуральную среду удаляли и дважды промывали PBS. 1en, добавляли 0,05% H2O2 и клетки культивировали в течение 4 часов. После этого клетки В-16 инкубировали в 20 мкл раствора МТТ (5 мг/мл) при 37°С в течение 4 ч. 1en, культуральный супернатант удаляли, а остаток растворяли в 100 мкл ДМСО. 1e определяли оптическую плотность при 490 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов (Tecan Trading AG). 1е эксперименты проводились параллельно 3 раза.

2.4.2. Ингибирование производства меланина.

Продукцию меланина определяли, определяя содержание меланина в клетках с помощью пиролиза NaOH [12]. Клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования в течение 24 часов при плотности клеток 10 × 104 клеток/лунку 1 en, клетки обрабатывали различными экстрактами или соединениями в течение 24 часов. После этого супернатант клеточной культуры (300 мкл) удаляли, а остаток растворяли в NaOH (1 мл, 1,0 моль/л) в течение 24 ч при комнатной температуре. 1епоглощение измеряли при 475 нм, используя микропланшет-ридер (Tecan Trading AG). 1е эксперименты проводили параллельно в 3 повторах. 1e IC50 определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния), а в качестве положительного контроля использовали арбутин (IC50 =15,6 мкл).

2.4.3. Определение активности тирозиназы.

Супернатант клеточной культуры удаляли, а остаток растворяли в Tritonx-100 (90 мкл) итирозиназа(10 мкл, 1,0 мг/мл, Sigma, T3824 25ku). После смешивания смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. 1e измеряли оптическую плотность при 475 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов (Tecan Trading AG). 1е эксперименты проводились параллельно 3 раза. 1e IC50 определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., Сан-Диего, Калифорния), а в качестве положительного контроля использовали арбутин (IC50 =15,6 мкл).

2.5. Извлечение и изоляция. Этилацетатный экстракт растворяли в метаноле и колонку заполняли силикагелем 200–300 меш, который уравновешивали петролейным эфиром. 1en — градиентное элюирование, состоящее из петролейного эфира и этилацетата в соотношениях 2:1, 1:1 и 1:2; ацетат этила; этилацетат и метанол в соотношениях 2:1, 1:1 и 1:2; и метанол использовали в сочетании с ТСХ для получения соединений А (11,5 г), В (10,4 г), С (12,1 г), D (5,2 г) и Е (6,1 г).

А разделяли хроматографией на колонке с полиамидом, используя дихлорметан и метанол в соотношениях 2:1, 1:1 и 1:2 в качестве растворителя для элюирования. 1е элюат контролировали с помощью ТСХ. Пятна с одинаковым коэффициентом удерживания (rf) объединяли и получали А1 и А2. 1en, А1 получали методом ТСХ с использованием дихлорметана и метанола в соотношении 1:1 в качестве проявляющего агента и несколько раз очищали на гель-колонке. Наконец, были получены соединение 1 (17 мг) и соединение 2 (27 мг). А2 очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента дихлорметан и метанол в соотношениях 1:1 и 1:2. Получали соединение 3 (11 мг), соединение 4 (12 мг) и соединение 5 (23 мг). B разделяли с помощью обращенно-фазовой хроматографии среднего давления C18 (RP-C18), используя метанол, воду при градиентном элюировании следующим образом: 0 процентов, 10 процентов, 15 процентов, 20 процентов, 25 процентов, 30 процентов, 35 процентов, 40 процентов, 50 процентов, 75 процентов, 90 процентов и 100 процентов. 1e скорость потока 10 мл·мин–1. 1e потоковые фракции с одинаковым rf были объединены, и были получены B1 и B2. В1 повторно очищали на колонке с гелем, используя метанол в качестве растворителя для элюирования. Соединения (24 мг), 7 (21 мг) и 8 (18 мг) получали после многократного элюирования. В2 очищали на колонке с гелем и метанолом и получали соединение 9 (11 мг). С разделяли с помощью RP-C18 и элюировали метанолом и водой при скорости потока 10 мл·мин-1. 1e проточные фракции с одинаковым значением rf объединяли и получали C1, C2 и C3. C1 готовили на гелевой колонке и элюировали метанолом, получая соединение 10 (13 мг). С2 разделяли на колонке с силикагелем и элюировали этилацетатом и метанолом с градиентным элюированием в соотношениях 2:1, 1:1 и 1:2. С2 очищали препаративной жидкофазной экстракцией, соединения 11 (15 мг) и 12 (14 мг). C3 отделяли на полиамидной колонке, элюировали метанолом и водой и очищали с помощью ВЭЖХ. Были получены соединения 13 (34 мг), 14 (42 мг) и 15 (38 мг). D разделяли с помощью RP-C18 и элюировали метанолом и водой. Скорость потока 1e составляла 10 мл·мин-1. Соединения 16 (36 мг), 17 (19 мг) и 18 (37 мг) получали методом ВЭЖХ. Соединения 19 (29 мг) и 20 (34 мг) получали градиентным элюированием с использованием этилацетата и метанола в соотношениях 1:1 и 1:2, а затем 100% метанола на колонке с силикагелем.

herba epimedium sagittatum на коже

3. Результаты и обсуждение

3.1. Определение активных экстрактов (E1–E11).

Оптимальная концентрация (а именно, C1) каждого экстракта была рассчитана и показана в таблице 1. Эксперимент с антиоксидантами 1e показывает, что все экстракты обладают антиоксидантным восстанавливающим эффектом, но по сравнению с VC антиоксидантный эффект каждой группы слабее. 1eантиоксидантная активность Е1, Е3, Е4, Е7 и Е11 уменьшалась при повышении концентрации, как показано на рисунке 1. 1е тест ингибирования меланина показал, что все полярные компоненты в мякоти Trichosanthes kirilowii ингибируют синтез меланина. В частности, скорость ингибирования меланина была значительно выше для E2, E3 и E4, чем у положительного контроля арбутина, как показано на рисунке 2. 1e результатытирозиназаактивности показывают, что все полярные компоненты в мякоти Trichosanthes kirilowii ингибируют активность тирозиназы, и тенденция ингибирования аналогична ингибированию меланина. 1e ингибирование активности тирозиназы было значительно выше для E2, E3, E4 и E8, чем у положительного контроля. В целом экстракты из петролейного эфира обладают слабым ингибирующим действием на тирозиназу.1e Экстракты из этилацетата обладают высоким ингибирующим действием на тирозиназу, особенно полярные компоненты из этилацетата. 1e экстракты из н-бутанола также обладают сильным ингибирующим действием на тирозиназу, как показано на рисунке 3.

3.2. Выделение и идентификация мономерных компонентов.

20 соединений разделяли с помощью хроматографических колонок с силикагелем и ОДС, а также с помощью препаративной ВЭЖХ. На основе анализа данных ЯМР и МС была выяснена их структура. 1e 20 соединений представлены в табл. 2, а конкретные аналитические данные мономеров приведены в приложении 1.

3.3. Валидационный анализ эффективных соединений

3.3.1. Валидационный анализ антиоксидантных соединений.

E1, E2, E3, E4 и E5 обладают антиоксидантным действием. 1e основными соединениями, выделенными из вышеуказанных компонентов, были дрекслерол-Б (соединение 9), циклогексанол 3-пальмитат (соединение 10), 5-ацетоксиметил-2-фуральдегид (соединение 11), 5-гидроксиметилфурфурол ( соединение 12), диосметин (соединение 13), апигенин (соединение 14), хризоберил (соединение 15), лютеолин (соединение 16), 4'-гидроксискутелларин (соединение 17), кверцетин (соединение 18), 3', {{ 25}}основными соединениями были гликозиды, что указывает на то, что гликозиды обладают хорошей антиоксидантной активностью. Фенольные кислоты, такие как 5-ацетоксиметил-2-фуральдегид (соединение 11), 5-гидроксиметилфурфурол (соединение 12), диосметин (соединение 13), апигенин (соединение 14), хризоберил (соединение 15) , лютеолин (соединение 16), 4'-гидроксискутелларин (соединение 17), кверцетин (соединение 18) и 3',5-дигидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4'-метоксифлавон, также обладают хорошей антиоксидантной активностью благодаря фенольной гидроксильной группе и ненасыщенным двойным связям [26, 27]. 1e результаты показаны на рис. 4.

Рисунок 4: Выживаемость клеток (в процентах) в эксперименте с антиоксидантами различных соединений из экстрактов трихосантеса.

3.3.2. Валидационный анализ соединений, ингибирующих меланин.

E11, E12, E13, E16, E17 и E18 оказывают хорошее ингибирующее действие на синтез меланина. Основные соединения, выделенные из указанных выше компонентов, представлены в таблице 2. По методу, описанному в разделе 2.4.2, определяли влияние каждого соединения на синтез меланина. Каждое соединение оценивали при следующих концентрациях: 1000 мкг/мл, 800 мкг/мл, 400 мкг/мл, 200 мкг/мл и 100 мкг/мл. Каждое измерение проводили в трех экземплярах и рассчитывали степень ингибирования синтеза меланина.

Протокатехуат (соединение 5), 5-ацетоксиметил-2-фуральдегид (соединение 11), 5-гидроксиметилфурфурол (соединение 12), диосметин (соединение 13), п-гидроксибензальдегид (соединение 1), салициловая кислота (соединение 2), ванилиновая кислота (соединение 3), изованиловая кислота (соединение 4), транскоричная кислота (соединение 6), 4-кумаровая кислота (соединение 7), апигенин (соединение 14), хризоберил (соединение 15). ), лютеолин (соединение 16), 4'-гидроксискутелларин (соединение 17), кверцетин (соединение 18), 3',5-дигидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4' -метоксифлавон (соединение 19), офлоксацин-7-O- -D-глюкозид (соединение 20) могут ингибировать выработку меланина [28]. В частности, ванилиновая кислота (соединение 3), изованиловая кислота (соединение 4), протокатехуат (соединение 5), транс-коричная кислота (соединение 6) и 4-кумаровая кислота (соединение 7) обладают сильным ингибированием меланина. 1e результаты показаны на рисунке 5.

3.3.3. Проверка и анализ соединений, ингибирующих активность тирозиназы.

Е2, Е3, Е4, Е7, Е8 и Е9 обладают хорошим ингибирующим действием натирозиназаМероприятия. 1e основные соединения, выделенные из вышеуказанных компонентов, представлены в таблице 2. В соответствии с методом, представленным в разделе 2.4.3, в качестве контроля использовали арбутин, а концентрация соединения составляла 1000 мкг/мл, 800 мкг/мл, 400 мкг/мл. , 200 мкг/мл и 100 мкг/мл. Каждое измерение проводили 5 раз и рассчитывали степень ингибирования тирозиназы. 1е результаты представлены на рис. 6.

1e результаты показывают, что диосметин (соединение 13), апигенин (соединение 14), хризоберил (соединение 15), лютеолин (соединение 16), 4'-гидроксискутелларин (соединение 17), кверцетин (соединение 18), 3',{{10} }дигидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4'-метоксифлавон (соединение 19), ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид (соединение 20), п-гидроксибензальдегид (соединение 1), салициловая кислота (соединение 2), ванилиновая кислота (соединение 3), изованиловая кислота (соединение 4), протокатехуат (соединение 5), транскоричная кислота (соединение 6), 4-кумаровая кислота (соединение 7 ), и транс-феруловая кислота (соединение 8) имеют очевидныетирозиназаингибирующая деятельность.

Цистанхе ингибирует активность тирозиназы.

Нажмите на картинку и получите более подробную информацию.

Гидроксизамещенные соединения в бензольном кольце, такие как п-гидроксибензальдегид (соединение 1), салициловая кислота (соединение 2), ванилиновая кислота (соединение 3), изованиловая кислота (соединение 4), протокатехуат (соединение 5), транс-коричная кислота ( соединение 6), 4-кумаровая кислота (соединение 7), транс-феруловая кислота (соединение 8) и флавоноиды проявляли высокое ингибирование тирозиназы, причем скорость ингибирования пара-замещенных соединений была значительно выше, чем у орто-замещенных соединений. . Например, ингибирующая активность п-гидроксибензальдегида была значительно выше, чем у салициловой кислоты, а ингибирующая активность ванилиновой кислоты была значительно выше, чем у изованиловой кислоты. При этом ингибирующая активность п-гидроксибензальдегида была значительно выше, чем у салициловой кислоты, ванилиновой кислоты, изованиловой кислоты и протокатехуата. Причина может заключаться в том, что нуклеофильные группы вокруг активного центратирозиназа, такие как –SH, –NH2 и –OH, занимают пространство вокруг активного центра и, таким образом, предотвращают атаку тирозина на активный центр. Наконец, синтез меланина ингибировался [28]. 1д ингибирующая активность соединений, содержащих о-дигидрокси, была сильнее, чем у пара-гидроксисоединений, а ингибирующая активность протокатехуата была значительно выше, чем у ванилиновой кислоты. 1e вышеперечисленные явления существуют и у флавоноидов. Скорость ингибирования флавоноидов, содержащих 7- и 4'-гидроксильные группы, была значительно выше, чем при замещении 7- и 4'-гидроксильных групп. Например, ингибирующая активность хризоберила была значительно выше, чем у диосметина, тогда как ингибирующая активность диосметина была выше, чем у 3',5-дигидрокси-7-(-D-глюкопиранозилокси)-4. ′- метоксифлавон и ципрофлоксацин-7-O- -D-глюкозид. 1e Степень ингибирования флавоноидов, содержащих 3-гидрокси, была значительно выше, чем у соединений без 3-гидрокси или при замене 3-гидрокси. Например, ингибирующая активность кверцетина была значительно выше, чем у 4'-гидроксискутелларина, но ингибирующая активность 4'-гидроксискутелларина была выше, чем у кверцетин-3-о глюкозида. Кроме того, ингибирующая активность коэллина была выше, чем у апигенина, но ниже, чем у лютеолина. Предполагается, что заместители в кольце B, особенно гидроксильная группа, могут усиливатьтирозиназаингибирующей активностью, а ортодигидроксигруппа В-кольца обладала большей ингибирующей активностью [29].