Активность ксантиноксидоредуктазы в бедной тромбоцитами и богатой плазме как индикатор окислительного стресса у пациентов, нуждающихся в заместительной почечной терапии

Абстрактный фон: Ксантиноксидоредуктаза(XOR) представляет собой фермент гидроксилазу, участвующий в метаболизме пуринов. Активность XOR может варьироваться: гомодимерный белок может превращаться в две разные изоформы XD (антиоксидант) и XO (прооксидант). Окислительный стресс и воспаление, которые сопровождаютхроническая болезнь почек(ХБП), диализ и трансплантация почки приводили к активации тромбоцитов. Целью настоящего исследования было определение влияния применяемой заместительной почечной терапии на активность ксантиноксидоредуктазы и ее изоформы.

Материалы и методы. В группу исследования вошли 117 пациентов, разделенных на 4 группы: пациенты, находящиеся на гемодиализе - 30, пациенты на перитонеальном диализе - 30, пациенты, перенесшие трансплантацию почки - 27, и пациенты, получавшие консервативное лечение {{5}. } пациентов. Контрольную группу составили 30 здоровых добровольцев. Результаты. Были обнаружены значительные различия в активности XOR в плазме с низким содержанием тромбоцитов (PPP) внутри исследуемых групп (p=0.001). Выявлена ​​связь между типом заместительной почечной терапии всех изоформ оксидоредуктазы при ППП (р<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Theпричина хронической болезни почектакже отразилось на различиях в активности XD и XO в ППС.

Выводы. Тип заместительной почечной терапии, применяемой у пациентов с ХБП, возраст пациентов, продолжительность диализа, причины ХБП и стадия прогрессирования существенно влияют на активность XOR и его изоформ.

Ключевые слова: Ксантиноксидоредуктаза, тромбоциты, заместительная почечная терапия,Хроническая болезнь почек, Антиоксидантные ферменты

КАК ВРЕМЯ ДЕЙСТВУЕТ ЦИСТАНШЕ?

Фон

Ксантиноксидоредуктаза (XOR) — фермент гидроксилазы, участвующий в метаболизме пуринов. Он катализирует окисление гипоксантина до ксантина и ксантина до мочевой кислоты (МК). Активность XOR может варьироваться: гомодимерный белок может превращаться в две разные изоформы. Ксантиндегидрогеназа (XD) экспрессируется преимущественно в здоровых тканях, а ксантиноксидаза (XO) генерируется путем посттрансляционной модификации XD, окисления остатков цистеина, а также ограниченного протеолиза, играя доминирующую роль в клетках и тканях при повреждениях [1-3]. ]. Активности указанных изоформ противоположны друг другу [4]. XOR действует в присутствии НАД+ как дегидрогеназа, а с молекулярным кислородом как оксидаза. Способность XOR быстро превращаться из антиоксиданта в окислитель при различных типах повреждений тканей является важным элементом быстрого врожденного иммунного ответа, полезного, например, при бактериальной или грибковой инфекции [5].

Промежуточные продукты реакции ксантиндегидрогеназы (XDO) и кислорода могут реагировать как с НАД+, так и с О2, но обладают более высоким сродством к НАД+ [6]. Эта промежуточная изоформа не выделена, но определение ее активности облегчает отслеживание трансформации XD в XO [7].

Активность XOR сыворотки при различных заболеваниях широко исследовалась. Причиной интереса к этому ферменту является двойственность его действия: способность продуцировать антиоксиданты и, с другой стороны, создавать активные формы кислорода. Повышение активности XOR происходит при таких патологических состояниях, как вирусный гепатит, инфекционный мононуклеоз, аутоиммунные заболевания, пневмония, шизофрения и диабет II типа. Увеличение активности XOR наблюдается также в сыворотке крови пациентов после трансплантации почки или печени [8]. Показано, что ген, кодирующий XOR, может отвечать за созревание почек и адипогенез в почках, а также предотвращать трансформацию эпителиальных клеток в мезенхимальную ткань [9]. Однако, насколько нам известно, нет опубликованных отчетов по исследованию активности XOR в плазме с низким содержанием тромбоцитов (PPP) и плазме, богатой тромбоцитами (PRP) у пациентов, проходящих заместительную почечную терапию. Важность активности XOR у этой группы пациентов связана с повышенной активацией тромбоцитов, вызванной окислительным стрессом и воспалением, которые сопровождают хроническую болезнь почек (ХБП), диализ и трансплантацию почки. Кроме того, при диализе и трансплантации органов повреждаются ткани и сосуды, а тромбоциты первыми достигают места повреждения тканей, активно участвуя в начальных стадиях воспалительного процесса и заживлении [10].

PRP и PPP представляют собой фракции плазмы крови с разной концентрацией тромбоцитов. Содержание тромбоцитов в PRP и PPP составляет тромбоциты/мл и тромбоциты/мл соответственно. PPP и PRP получают путем многократного центрифугирования и промывания цельной крови человека при разных скоростях центрифугирования [11, 12].

PPP, как побочный продукт центрифугирования антикоагулянтной крови, имеет более низкую концентрацию тромбоцитов, чем нормальная кровь. Основными компонентами ППП являются фибриноген, фибронектин и тромбин. Биологические эффекты ППП заключаются в участии в гемостазе и коагуляции, в качестве вектора прикрепления клеток, а также в стимулировании митоза фибробластов и эпителиальных клеток [13]. Хотя PPP не так сконцентрирован в тромбоцитах, как PRP, было продемонстрировано, что PPP также может поддерживать рост и выживание клеток. PPP способствует клеточным функциям, связанным с заживлением ран, и ускоряет миграцию клеток и пролиферацию фибробластов [14, 15]. В плазме, богатой тромбоцитами, концентрация тромбоцитов выше, чем в нормальной плазме (примерно 150–400×103 клеток/дл). Это одно из наиболее распространенных определений PRP в литературе [16]. На сегодняшний день ограниченное количество исследований охарактеризовало XOR и активность его изоформы в богатой или бедной тромбоцитами плазме у пациентов, страдающих хроническим заболеванием почек. Тан и др. показали, что клетки, поврежденные активными формами кислорода (АФК) (в случае хронической заместительной почечной терапии), «утекают» изоформы XOR, что приводит к повышению уровня фермента в плазме [17]. Этот механизм объясняет более низкую активность XOR и его изоформ в тромбоцитах по сравнению с PPP. Поэтому активность оксидоредуктаз в PPP и PRP представляет большой интерес, поскольку может помочь раскрыть клеточные процессы, происходящие ежедневно. Подобные исследования также могли бы косвенно подчеркнуть тяжесть окислительного стресса у этой группы пациентов.

Берри и др. описывают также, что ксантиноксидоредуктаза распределяется в печени, тонком кишечнике, молочной железе и эндотелиальных клетках. Методы субклеточной локализации продемонстрировали наличие ксантиноксидоредуктазы как в цитоплазме, так и на клеточных мембранах. Они также указывают на то, что ксантиноксидаредуктаза плазмы может возникать из-за затенения ксантиноксидоредуктазы клеточными мембранами или ее утечки из цитоплазмы. Это одна из причин, по которой мы тестируем активность XOR в PPP и PRP, чтобы различать активность фермента в тромбоцитах и ​​других клетках крови, содержащихся в плазме [18]. На основании активности антиоксидантных ферментов мы также можем определить, какой тип заместительной почечной терапии с меньшей вероятностью подвергнет пациента окислительному стрессу. Из-за двойственной природы XOR понимание взаимосвязи между типом заместительной почечной терапии и активностью изоформ XOR может быть очень интересным и полезным при выборе типа заместительной почечной терапии.

Материалы и методы

Этическое одобрение и согласие

Биоэтическая комиссия Поморского медицинского университета в Щецине одобрила проведенное исследование (№ KB-0012/36/11). Все участники, включая здоровых добровольцев контрольной группы, были проинформированы о цели и объеме исследования и дали согласие на сдачу образцов и публикацию полученных данных.

Исследовательская группа

В исследовании приняли участие 147 участников: контрольная группа из 30 здоровых добровольцев (NK) и 117 пациентов с хронической болезнью почек (ХБП), посещавших клинику нефрологии, транспланетологии и внутренних болезней Поморского медицинского университета в Щецине. Пациенты были разделены на 4 группы в зависимости от получаемого лечения: 30 пациентов до и после гемодиализа (ГД А и ГД В): 30 пациентов получали перитонеальный диализ (ПД); 27 больных до и после трансплантации почки (5–7 сутки после операции) (ТЕ, ТЕ А); Консервативное лечение (ХТ) (ХБП 2–5 стадии) получали 30 пациентов. Пол, возраст, продолжительность диализа, причина и стадия хронической болезни почек, концентрация креатинина в основной и контрольной группах приведены в таблицах 1 и 2.

Образцы

У всех участников исследования были взяты образцы крови (K2EDTA (8 мл), 3,8% тринатрийцитрат (9:1; об/об) и сыворотка (8 мл). Кровь гемодиализованного пациента брали из артериовенозной фистулы; всем остальным участникам применялась периферическая венепункция. Образцы были взяты у пациентов, находящихся на гемодиализе, до (HD A) и примерно через 10 минут после остановки насоса (HD B). Кровь трансплантированного пациента собирали до трансплантации (ТЕ) и через 5–7 дней после операции (ТЕ А). Пациенты, включенные в группу ТЕ, не принадлежали к группе пациентов, находящихся на гемодиализе или перитонеальном диализе в этом исследовании. Это были пациенты, имеющие право на трансплантацию, со всей Польши. Подавляющее большинство пациентов с трансплантацией почки предварительно проходили модальный анализ. K2EDTA и образцы свернувшейся крови центрифугировали при 2600 об/мин в течение 10 минут при 20 градусах для получения плазмы и сыворотки соответственно. Для получения плазмы, богатой тромбоцитами (PRP) и плазмы, бедной тромбоцитами (PPP), кровь, собранную с цитратом, центрифугировали в условиях при 1100 об/мин в течение 10 мин при 20 градусах. Полученную PRP перенесли в новую пробирку и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 мин при 20 градусах: бедную тромбоцитами плазму (PPP) перенесли в отдельную пробирку; осадок тромбоцитов дважды промывали и суспендировали в буфере Tyroda (рН 7,4). Плазму, сыворотку, PPP и PRP замораживали при -80 градусах до проведения анализов. У пациентов, находящихся на гемодиализе, кровь собирали перед введением гепарина и после диализа, продолжавшегося в среднем 4–5 ч (период полувыведения гепарина - 4 ч), чтобы исключить любое возможное влияние гепарина на активность XOR.

Активность ксантиноксидоредуктазы в бедной тромбоцитами плазме и тромбоцитах

Определения проводили на спектрофотометре Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Изменения угасания регистрировали при 340 нм (XD) и 302 нм (XDO, XO) в течение 5 минут при 30 градусах. Ферментативную активность измеряли по образованию мочевой кислоты и НАДН (увеличение А340 и А302) и выражали в мЕ× мл-1 (миллиединицы на миллилитр). Ферментативную активность рассчитывали с учетом начальных скоростей реакции. Образование мочевой кислоты измеряли при 302 нм (изоформы XDO и XO), поскольку ее оптическая плотность там все еще высока, тогда как изменения концентрации НАД+ не вносят вклада. Для расчета активности изоформ ксантиноксидоредуктазы НАДН+ Н+: ε302=2.30× 103 [л∙моль-1 см-1] использовали коэффициент экстинкции НАДН+ Н+ ε340=6.22×103 [л∙моль-1 см-1 ]. л∙моль-1 см-1 ] [7, 19–22].

Таблица 1. Общая характеристика больных на гемодиализе (ГД), перитонеальном диализе (ПД), получавших консервативное лечение (ХБП), трансплантированных почках (ТЕ) и контрольной группе (С), участвовавших в исследовании (среднее значение ± стандартное отклонение)

P* - статистическая значимость различий между группами HD, PD и CKD, TE и C точный критерий Фишера для качественных переменных; для количественных переменных - однофакторный дисперсионный анализ и; P** - статистическая значимость различий между группами ГБ, БП и ХБП и TE точный критерий Фишера для качественных переменных для количественных переменных однофакторный дисперсионный анализ или; СД – диабетическая нефропатия; ГА – гипертоническая болезнь; ГИК — клубочковое воспаление почки; АДПКД – поликистоз почек, наследуемый по аутосомно-доминантному типу; НС – статистически значимых различий нет.

Таблица 2. Общая характеристика пациентов, находящихся на гемодиализе (Б - до ГД, А - после), консервативно лечившихся на перитонеальном диализе (ПД) (ХБП) до и после трансплантации почки (ТЕ Б и ТЕ А) и контрольной группы (НК), принимавших участие в исследовании. исследование (среднее ± стандартное отклонение)

P * - статистическая значимость для различий между группами HD A, HD B, PD и CKD, TE и C для количественных переменных - ANOVA Краскала Уоллиса, однофакторный дисперсионный анализ или t-критерий Стьюдента P ** - статистическая значимость для различий между группами HD A , HD B, PD и группы CKD и TE для количественных переменных ANOVA Крускала Уоллиса или однофакторного анализа ANOVA Kt/V - индекс диализа (объемная доля V, очищенная клиренсом K в момент времени t) NS статистически значимых связей не обнаружено

Статистический анализ. Для оценки распределений использовали тест KS (Колмогорова-Смирнова), который в случае некоторых переменных (активность изоформ XD и XDO в PRP) показал ненормальное распределение параметров. Для анализа количественных данных использовались точные критерии Фишера и хи-квадрат. Используя t-критерий Стьюдента и анализ ANOVA для одномерных систем, оценивали различия между связанными (парными) и несвязанными (неспарными) переменными в случае переменных с нормальным распределением. В случае переменных с ненормальным распределением был проведен анализ ANOVA Крускала-Уоллиса для оценки различий между параметрами, а также непараметрический критерий Манна-Уитни U для непарных данных или Уилкоксона для парных данных. Для определения многофакторной оценки связей между изучаемыми параметрами использовалась модель линейной множественной регрессии. Статистический анализ результатов проводили с использованием программы Statistica 12 (StatSoft).