Производные анастатина облегчают ишемически-реперфузионное повреждение миокарда за счет антиоксидантных свойств

Для получения дополнительной информации обращайтесьtina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный:(±)-Анастатины А и В представляют собой флавоноиды, выделенные из Anastatica hierochuntica. В предыдущем исследовании были разработаны двадцать четыре новых ди- и тризамещенных производных анастатинов, и была оценена их предварительная антиоксидантная активность. В настоящем исследовании дополнительно изучались защитный эффект миокардиальной ишемии-реперфузии (И/Р) и систематическая антиоксидантная способность 24 производных. Соединение 13 было самым мощным среди всех исследованных соединений, что увеличило выживаемость клеток H9c2 до 80,82 процента. Антиоксидантную способность соединения 13 оценивали по антиоксидантной способности восстанавливать железо, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислота) поглощать радикалы и 2,2-дифенил{ {20}}анализы пикрилгидразила. Было обнаружено, что соединение 13 значительно уменьшает площадь инфаркта и улучшает гистопатологические изменения и изменения электрокардиограммы у крыс с повреждением миокарда I/R. Кроме того, соединение 13 снижало скорость утечки сывороточной лактатдегидрогеназы, креатинкиназы и малонилдиальдегида из тканей миокарда крыс и повышало уровень активности глутатиона и супероксиддисмутазы послеИ/Р повреждение миокардау крыс. В совокупности мы пришли к выводу, что соединение 13 оказывает сильное кардиозащитное действие против повреждения миокарда I/R как in vitro, так и in vivo благодаря его обширной антиоксидантной активности.

Ключевые слова: производные флавоноидов; клетки H9c2; гипоксия/реоксигенация; кардиопротекторные эффекты

Нажмите здесь, чтобы получить больше информации о продукте

1. Введение

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является ведущей причиной смерти во всем мире [1]. Своевременное восстановление кровотока позволяет эффективно улучшить клинический исход заболевания; однако реперфузия не лишена риска из-за степени повреждения клеток, вызванного самой реперфузией. Поэтому крайне важно разработать эффективные терапевтические стратегии против ишемически-реперфузионного (И/Р) повреждения миокарда [2]. Механизм И/Р повреждения миокарда очень сложен; он включает апоптоз, окислительный стресс [3], перегрузку кальцием [4] и воспаление [5].Окислительный стрессможет привести к апоптозу через различные пути передачи сигнала, включая киназу, регулируемую сигналом (ERK), амино-концевую киназу c-Jun (JNK), активацию p53 (опухолевый белок p53) и вариант p66shc. Более того, избыточное производство активных форм кислорода (АФК) может вызвать необратимое повреждение клеточных мембран и клеточных молекул, таких как ДНК, нуклеиновые кислоты, белок, липиды, и запустить цепные реакции, еще больше повреждающие ткань миокарда. Окислительный стресс [6], вызванный дисбалансом между образованием свободных радикалов и удалением АФК, играет важную роль в патогенезе И/Р-повреждения I. Поэтому стратегии, защищающие миокард от окислительного стресса, высоко оцениваются при лечении. И/Р повреждения миокарда. Таким образом, благодаря их потенциальной способности нейтрализовать свободные радикалы, стратегии на основе антиоксидантов полезны при лечении травм I/R.

В клинических исследованиях антиоксиданты использовались для сниженияИ/Р повреждение миокардав основном делятся на два типа: ферменты и неферменты. Ферменты, такие как каталаза и глутатионпероксидаза, снижают концентрацию перекиси водорода, чтобы предотвратить повреждение клеток; неферментативные антиоксиданты, такие как витамин Е, витамин С, бета-каротин и т. д., ослабляют реакцию тканей на окислительный стресс, уменьшая повреждение тканей и способствуя функциональному восстановлению. Однако применение обоих в настоящее время имеет определенные ограничения. Большая молекулярная масса ферментных препаратов не способствует всасыванию [8]. Существуют также определенные проблемы со стабильностью неферментов, что приводит к плохой стабильности лекарств, поэтому они легко окисляются [9].ФлавоноидыСообщается, что , как разновидность неферментативных антиоксидантов, обладают целым рядом мощных свойств, включая антиоксидантные, противораковые, антиапоптотические и сердечно-сосудистые свойства [10]. Они предотвращают образование высокореакционноспособных оксидов и ингибируют окислительные реакции, удаляя АФК, такие как водородные радикалы и пероксинитрит. Анастатины А и В [11] — флавоноиды с гепатопротекторной активностью. Anastasius A и B являются активными компонентами Anastatica hierochuntica (подтип Anastatica, семейство Brassicaceae). В настоящее время имеется очень мало сообщений о химическом синтезе и структурных модификациях анастатинов А и В. В 2003 г. были выделены активные соединения из Anastatica hierochuntica, и было обнаружено, что они обладают гепатозащитным действием против индуцированной D-галактозамином цитотоксичности в первично культивируемых мышиных гепатоцитах. Накашима и Эман также показали, что соединения проявляют антиоксидантную и противораковую активность in vitro. Однако фармакологические эффекты анастатинов А и В и их производных, а также способы их синтеза остаются неясными. Поэтому мы стремились синтезировать анастатины А и В и некоторые их производные и оценить их антиоксидантную активность в условиях гипоксии.реоксигенация(H/R), которая эффективна для изучения И/Р повреждения миокарда [12].

В предыдущем исследовании мы синтезировали анастатины А и В и их аналоги и оценили их антиоксидантные способности, используя модель окислительного повреждения, вызванного H2O2 (перекисью водорода) на культуре клеток13. Наши предыдущие результаты показали, что анастатины А и В обладают мощной гепатопротекторной активностью, которая, по-видимому, связана с их антиоксидантными способностями.

В настоящем исследовании анастатины А и В и 24 их производных были синтезированы и оценены на антиоксидантные свойства с использованием тестов на снижение активности и удаление радикалов. Кроме того, для оценки кардиозащитного действия соединений использовали простую клеточную модель H/R и крысиную модель I/R повреждения миокарда.

2. Результаты

2.1. Создание модели H/R

Концентрацию обработки Na2S, O4 оценивали, как показано на рисунке 1A, и выживаемость клеток H9c2 снижалась с увеличением концентрации Na2S2O4. При 4 мМ Na, S, Oa жизнеспособность клеток снизилась менее чем до 50 процентов (13,7, 25 и 43,4 процентов соответственно при времени реоксигенации 2,1 и 0 ч). , а уровень снижения жизнеспособности клеток был ниже. Поэтому для имитации гипоксии использовали концентрацию Na2S2O4 4 мМ. На рисунке 1B показано, что обработка 4 мМ Na2S2O4 в течение 2 часов без реоксигенации (0 часов) значительно снижала жизнеспособность клеток и оставалась стабильной. В условиях концентрации NazS2O4 4 мМ в течение 2 часов, имитирующих гипоксию, 2 часа реоксигенации снижали выживаемость клеток до 17,37% (рис. 1С). Как ясно показано на рисунке 1D, 10 мкМ ресвератрола обращали вспять снижение жизнеспособности клеток, вызванное H/R, которое было более эффективным, чем такая же концентрация галловой кислоты (74,34% против 60,44% для галловой кислоты).

В результате была создана модель гипоксии/реоксигенации с использованием Na2S, O4 в конечной концентрации 4 мМ в течение 2 часов, имитирующих гипоксию, с последующим культивированием в нормальной DMEM (модификация Дульбекко среды Игла)/высокой глюкозой для имитации повреждения реоксигенации. . Ресвератрол в конечной концентрации 10 мкМ использовали в качестве положительного контроля.

2.2. Анастатины и их производные улучшают жизнеспособность клеток H9c2, подвергнутых H/R-обработке

Во-первых, мы исследовали влияние анастатинов А и В (рис. 2А, В) и их производных на жизнеспособность клеток H9c2 в МТТ(3-(4,5)-диметилтиахиазо(-z-y1){{ 10}}, 5-ди-фенитетразолиумромид) анализ [13]. Соединения 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 и 11 не были значительно цитотоксичны для клеток H9c2 (рис. 3A, B, таблица S2). Анастатины А и В, их производные и ресвератрол (положительный контроль) обращали вспять вызванное гипоксией повреждение клеток (рис. 4). В экспериментальной группе выживаемость клеток снизилась до 20,31%, ресвератрол увеличил ее до 82,68%, а анастатин А и соединения 22b, 22c, 24b, 24c, 13 и 14 увеличили выживаемость клеток до более чем 70% ( 71,49,71.00, 76,50, 73,24, 77,57, 80,82 и 77,13% соответственно). Таким образом, соединение 13 (рис. 2С) обладало самым сильным защитным действием среди производных анастатинов от H/R повреждения и использовалось в последующих экспериментах.

2.3. Соединение 13 уменьшает H/R-индуцированное повреждение клеток и окислительный стресс

Чтобы изучить антиоксидантную способность соединения, триокислительный стрессиндикаторы, LDH (лактатдегидрогеназа), GSH (L-глутатион) и SOD (супероксиддисмутаза), были выбраны для оценки антиоксидантной способности соединений. ЛДГ представляет собой стабильный цитоплазматический фермент, присутствующий в клетках миокарда, который быстро высвобождается из клеток в среду для культивирования клеток при повреждении клеточной мембраны миокарда. Чем серьезнее повреждение, тем выше уровень ЛДГ в питательной среде. Рисунок 5А продемонстрировал, что 2-часовая гипоксия с последующей 2-часовой реоксигенацией значительно увеличивала высвобождение ЛДГ (478,98 ЕД/л против 55,84 ЕД/л в контрольной группе, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Антиоксидантная способность соединения 13.

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>ресвератрол. Следовательно, антиоксидантная способность соединения 13 может быть выше, чем у других типичных антиоксидантов.

2.5. Эффекты производного анастатина 13 на повреждение миокарда I/R у крыс

2.5.1.Влияние соединения 13 на окислительный стресс и активность антиоксидантных ферментов

Уровень повреждения миокарда оценивали путем выявления маркера окислительного стресса и активности антиоксидантных ферментов. Оценивали влияние соединения 13 на активность МДА (малонового диальдегида) в ткани миокарда, а также уровни ЛДГ, КК (креатинкиназы), GSH и SODin в сыворотке крови. Как показано на рисунке 7, повреждение I / R привело к увеличению уровней ЛДГ (рисунок 7A) и CK (рисунок B) и значительному снижению активности GSH (рисунок 7C) и SOD (рисунок 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Влияние соединения 13 на изменения электрокардиограммы (ЭКГ) и частоту сердечных сокращений

Типичные изменения ЭКГ (электрокардиограммы), вызванные повреждением I/R миокарда, показаны на рисунке 8. По сравнению с нормальной ЭКГ (рис. 8A), повреждение I/R миокарда может вызвать увеличение амплитуды ORS (часть электрокардиографической волны) (рис. 8B); Слияние зубцов QRS и ST (рис. 8C); подъем сегмента ST (интервал между зубцом S и зубцом T) (рис. 8D); и инверсия сегмента ST (рис. 8E). После 15 минут лигирования ПМЖВ амплитуда QRS значительно увеличилась примерно с 0,5 мВ до 1,2 мВ в экспериментальной группе (рис. 9А), в то время как более низкое увеличение амплитуды QRS наблюдалось во всех группах лечения (от примерно от 0,4 мВ до 1, 0,8 и 0,6 мВ для группы ресвератрола, низкой дозы 13 и высокой дозы 13 соответственно) (рис. 9B-D ). Кроме того, аналогичная тенденция наблюдалась при лигировании 30 мин. Во время реперфузии амплитуда QRS начала снижаться; однако зубец QRS в модельной группе оставался самым высоким за весь период. Через 20 мин реперфузии амплитуда QRS в модельной группе снизилась примерно до {{30}},8 мВ, значение в группе лечения составило примерно 0,6, 0,5, 0,5 мВ для группа ресвератрола с низкой дозой 13 и высокой дозой 13 соответственно. В целом, лечение ресвератролом, низкой дозой 13 и высокой дозой 13 уменьшало патологическое увеличение амплитуды QRS по сравнению с экспериментальной группой как во время ишемии, так и в начале процесса реперфузии, что может быть связано с их миокардиозащитной активностью.

Наряду с мониторированием ЭКГ внимательно выявляли изменения частоты сердечных сокращений. Как показано в Таблице S3, 30-минутное перевязывание резко снизило частоту сердечных сокращений во всех группах, в то время как не было обнаружено никаких существенных различий между любой из групп лечения и экспериментальных групп. Через 2 часа реперфузии частота сердечных сокращений увеличилась, но никаких существенных изменений не было обнаружено ни в одной из групп.

2.5.3. Эффекты соединения 13 на область инфаркта и гистопатологические изменения

Для оценки степени повреждения миокарда ткани сердца окрашивали ТТС (2,35-трифенилтетразолия хлорид) и выявляли гистопатологические изменения. Как показано на Фигуре 10, в группе имитации не наблюдалось никаких изменений в миокарде после окрашивания TTC, в то время как в группе I/R наблюдалась шкала около 30 процентов белых областей инфаркта. В группе ресвератрола и в группах с низкой дозой 13 площадь инфаркта значительно уменьшилась примерно до 10 процентов, а площадь инфаркта в группе с высокой дозой 13 была сведена к минимуму до 5 процентов. На фигуре 10 показан результат окрашивания HE (гематоксилин-эозином): увеличение клеток сердца, частичное растворение мембран и ядер и воспалительная клеточная инфильтрация наблюдались в срезах тканей из модельной группы. Однако предварительная обработка соединением 13 значительно уменьшала эти гистопатологические изменения. Результаты окрашивания TTC и окрашивания HE показали, что соединение 13 может снижать индуцированный I/R инфаркт миокарда дозозависимым образом.

3. Обсуждение

Нацелившись на потенциальную антиоксидантную активность анастатинов А и В, наша лаборатория синтезировала 24 производных анастатинов и провела предварительный анализ цитотоксичности соединений в отношении ФХ-12 и их цитопротекторной активности при окислительном повреждении, индуцированном НО [13] . В этом исследовании мы в основном провели углубленную биологическую оценку 13 из 24 производных с самой сильной антиоксидантной активностью.

В настоящем исследовании I/R-повреждение миокарда было установлено в клетках H9c2 путем индукции с помощью H/R-обработки. Результаты исследования показали, что анастатины А и В и их изученные производные улучшали жизнеспособность клеток H9c2 после обработки H/R. Было обнаружено, что соединение 13 является наиболее активным среди 26 исследованных соединений, и поэтому оно было выбрано для дальнейшей оценки. Активность LDH (маркер повреждения клеток), SOD и GSH (маркеры окислительного стресса) была обнаружена в супернатантах клеток H9c2 после обработки H/R. Мы обнаружили, что предварительная обработка тестируемыми соединениями значительно снижала уровни ЛДГ и повышала уровни СОД и GSH в клетках. Таким образом, мы предположили, что производные анастатина обладают кардиопротекторной активностью, что может быть связано с их способностью подавлять окислительный стресс. Анализы DPPH и ABTS используются для оценки способности соединения поглощать радикалы [14]. В результате соединение 13 обладало высокой антиоксидантной активностью и удаляло ABTS и DPPH при низких значениях EC50, что еще больше указывает на подавление окислительного стресса. Лигирование ПМЖВ является распространенным методом, используемым для создания моделей И/Р миокарда. Оценивая амплитуду комплекса QRS до ишемии, после ишемии и после реперфузии, мы обнаружили, что предварительная обработка соединением 13 может значительно облегчить желудочковую аритмию во время ишемии и ранней реперфузии. Кроме того, соединение 13 влияло также на зоны инфаркта и гистопатологические изменения инфаркта миокарда. Эти результаты, наряду с выводами о том, что соединение 13 подавляет окислительный стресс и увеличивает уровни антиоксидантных ферментов в сыворотке крыс дозозависимым образом, показали, что соединение 13 обладает мощным действием против повреждения миокарда.

В заключение следует отметить, что производные анастатина обладали мощными антиоксидантными свойствами, при этом соединение 13 показало самую высокую антиоксидантную активность среди протестированных соединений. Механизмы, ответственные за влияние производных анастатинов на сигнальные пути, связанные с окислительным стрессом, все еще нуждаются в обсуждении. Астаксантин (подтип каротиноидов) может очищать АФК и дополнительно смягчать ишемию/реперфузионное повреждение [15]. Лекарства, способные предотвращать образование АФК, могут оказаться перспективными при заболеваниях, связанных с окислительным стрессом [4], таких как клеточная терапия и сердечно-сосудистые заболевания. Кроме того, АФК подавляют гипоксическую индукцию экспрессии гена-мишени фактора, индуцируемого гипоксией -1 (HF-1), который, как сообщается, оказывает кардиозащитное действие на ишемически-реперфузионное повреждение [16]. Мы предполагаем, что ROS и регуляторный белок HIF-1 могут играть решающую роль в кардиозащитном действии соединения 13. Турнефолиевая кислота B (TAB), полученная из китайских фитотерапии, защищает миокард от I/R повреждения миокарда [17]. ]. Исследование выявило важную роль TAB в стрессе эндоплазматического ретикулума (ER), апоптозе и путях PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа) / AKT (протеинкиназа B) при лечении I / R-повреждения миокарда. Другие пути, такие как путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [18] и сигнальный путь AMPK (аденозин-5'-монофосфат-активируемая протеинкиназа) [19], также могут быть вовлечены в повреждение I/R миокарда. Таким образом, следующим шагом является изучение регуляторных белков ROS и HIF-1 и использование TAB-опосредованных путей для изучения механизмов, с помощью которых 13 оказывает антиоксидантное действие и защищает I/R миокарда. Более того, эксперименты на клеточном уровне в этом исследовании также должны проводиться на клеточных линиях человека.

4. Материалы и методы

4.1. Клеточная культура

Клеточная линия кардиомиоцитов крысы H9c2 была приобретена у Nanjing Kebai Biotechnology Company (Нанкин, Китай). Клетки культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Hyclone, США) и добавляли 10% FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Ланьчжоу, Китай) и 1% пенициллин/стрептомицин (Hyclone, Мальборо, Массачусетс, США) во влажной среде. инкубатор на 37 градусов с 5 процентов CO2.

4.2. Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа МТТ. Клетки H9c2 высевали в 96-луночный планшет в количестве 1×10* клеток/лунку в течение 24 часов. После этого клетки обрабатывали анастатинами А и В и их производными в течение 48 ч или предварительно обрабатывали анастатинами А и В и их производными с последующей обработкой H/R. Затем добавляли МТТ (20 мкл/лунку) и культивировали при 37°С в течение 4 часов. Поглощение измеряли при 578 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Tecan, Infinite 50). Жизнеспособность клеток в контрольной группе считалась 100-процентной.

4.3. Модель гипоксии/реоксигенации (H/R) и введение лекарств

4.3.1. Модель H/R

NazS, O4 использовался для имитации гипоксического состояния, которое реагирует с [20] кислородом и снижает напряжение кислорода. Различные семь концентраций 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 мМ были проведены для определения оптимальных концентраций Na2S, O4. Для выбора оптимального времени гипоксии проводили посевы 0.5, 1, 2, 3 или 4 ч после обработки раствором Na2S2O4. Культивирование в среде с нормальной DMEM/высокой глюкозой в течение 0, 1, 2, 3 или 4 часов проводили, чтобы имитировать время реоксигенации [21].

4.3.2. Администрация по наркотикам

Для введения лекарств анастатины А и В и их производные (химическая структура в таблице S1) были разделены на две группы: анастатины А и их производные и анастатины В и их производные. В качестве положительного контроля использовали ресвератрол, который, как сообщалось, обладал кардиозащитным эффектом благодаря своей антиоксидантной активности. Чтобы определить концентрацию положительного контроля, ресвератрол и другое антиоксидантное соединение, галловую кислоту (3-100 мкМ), оценивали с использованием анализа МТТ, в котором клетки обрабатывали в течение 48 часов [22]. Как правило, клетки H9c2 предварительно обрабатывали анастатинами A и B и их производными (10 мкМ конечной концентрации), а также 10 мкМ ресвератрола в течение 30 минут перед обработкой H/R.

4.4.Оценка антиоксидантной способности

4.4.1. Анализ железовосстанавливающей антиоксидантной способности (FRAP)

Анализ FRAP проводили по методу Ойвуана [23]. Всего было пипетировано 25 мкл 1-процентного феррицианида калия K3Fe(CN)6 и 10 мкл соединения 13, витамина с (аскорбиновая кислота, Vc) и ресвератрола (0.{{8} } мМ) плюс 1 × PBS (pH =6,6). Смесь выдерживали на водяной бане при 50°С в течение 20 мин с последующим быстрым охлаждением льдом. Затем последовательно добавляли 25 мкл 10-процентного раствора трихлоруксусной кислоты (TCA), 0,1-процентного хлорида железа (FeCl) и дистиллированную воду. Смесь переносили в 96-луночный планшет и анализировали оптическую плотность при 650 нм. Раствор Vc (20-200 мкг/мл) использовали для построения стандартной кривой. Антиоксидантные способности рассчитывали по линейной калибровочной кривой и представляли в виде эквивалентов Vc.

4.4.2. Метод ABTS

Активность по удалению радикалов ABTS [24] выполняли в соответствии с Sugahara et al. и Рэ и др. Раствор ABTS разбавляли для корректировки поглощения спектрофотометрически при 650 из 0,70±0,02 нм, и активность удаления ABTS измеряли в соответствии с следующую формулу: E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(Acontrol-Ablank))× 10, где Control представляет собой оптическую плотность контрольной реакции, содержащей 130 мкл ABTS. · плюс рабочий раствор и 5,5 мкл разбавителя образца (ДМСО), а Абланк – это поглощение 130 мкл натрий-ацетатного буфера и 5,5 мкл ДМСО. A представляет собой оптическую плотность 130 мкл ABTS плюс рабочий раствор (натрий-ацетатный буфер) и 5,5 мкл соединения 13 (0,02-20 мМ), а Az представляет собой оптическую плотность 130 мкл натрий-ацетатного буфера и 5,5 мкл соединения 13 （ 0,02-20 мМ）. Все смеси встряхивали в течение 30 с и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин с последующим измерением оптической плотности при 650 нм. ECs0 рассчитывали, используя линейную зависимость между концентрацией соединения и вероятностью процента ингибирования ABTS.

4.5. Модель ишемии-реперфузии

4.5.1.Уход за животными

Крысы Sprague Dawley (SD) были получены из Центра лабораторных животных Военной академии медицинских наук НОАК (Пекин, Китай). Пятьдесят самцов крыс SD массой от {{0}} г были акклиматизированы в течение одной недели при комнатной температуре 23±1 градуса с 12-часовым циклом свет/темнота, а также кормом и водой. Крысы были разделены на пять групп: контрольная группа (крысы не получали лечения, но фиктивная операция), модельная группа (крысы получали носитель и операцию МИ/Р), группа ресвератрола (крысы получали 200 мг/кг ресвератрола и МИ/Р). операция), группа с низкой дозой 13 (крысы получали 100 мг/кг соединения 13 и операцию MI/R) и группу с высокой дозой 13 (крысы получали 200 мг/кг соединения 13 и операцию MI/R). Соединения готовили в 0,5% растворе карбоксиметилцеллюлозы натрия и вводили в виде суспензии из расчета 1 мл/кг перорально один раз в день в течение семи дней. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Академическим комитетом Тяньцзиньского университета науки и технологий.

4.5.2. Экспериментальный протокол

Крыс линии Sprague Dawley анестезировали 2%-ным уретаном (0,8 мл/100 г), а затем проводили ишемию миокарда путем лигирования левой передней нисходящей линии (LAD). Сердце обнажают через левый грудной разрез и накладывают шелковый шов 4-0 для выполнения регионарной ишемии в течение 30 минут ишемии с последующей 2-часовой реперфузией. Признаки ишемии миокарда подтверждались подъемом сегмента ST и увеличением амплитуды комплекса QRS. В ходе эксперимента крысы находились на аппарате ИВЛ DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Пекин, Китай). Частоту сердечных сокращений и ЭКГ контролировали с помощью системы сбора биологических сигналов MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Пекин, Китай). После наблюдения за процессом ишемии/реперфузии крыс умерщвляли, а образцы крови и гомогенаты сердца использовали для обнаружения повреждения миокарда с использованием коммерческих наборов для обнаружения.

4.5.3. Окрашивание TTC и окрашивание HE

Протяженность ишемической области количественно определяли окрашиванием трифенилтетразолийхлоридом (ТТС). Образцы сердца были немедленно заморожены при температуре {{0}} градусов в течение 10 минут и были сделаны пять тонких срезов толщиной от 1 до 2 мм. Затем срезы помещали в 1-процентный ТТС-фосфатный буфер (рН=7.0), окрашивали при 37°С в течение 20 мин и фиксировали в формалине. Изображения были получены с помощью цифровой камеры, а процент зоны инфаркта (TTC-отрицательный) и зоны риска (TTC-положительный) измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ [25]. Для окрашивания HE область инфаркта вырезали и фиксировали в 10-процентном формальдегиде, а затем заливали в парафин. После этого ткани окрашивали ГЭ (гематоксилин-эозином) и исследовали под световым микроскопом. Осушенные закладные секции и герметизирующие секции были заказаны биотехнологической компанией Tianjin YiSheng Yuan (Тяньцзинь, Китай).

4.6. Спектрофотометрические коммерческие наборы

Коммерческие наборы, используемые в этом исследовании, были приобретены у Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай) и Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Нанкин, Китай). ), активность креатинкиназы (CK), глутатиона (GSH) и супероксиддисмутазы (SOD). Активность малонового диальдегида (МДА) измеряли с использованием гомогената сердца крысы. Все коммерческие наборы были проведены в соответствии с инструкциями производителя.

4.7. Процесс статистики

Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Экспериментальные данные были обработаны с помощью программного обеспечения GraphPad Prism7, и экспериментальный результат каждой группы был выражен как среднее значение ± стандартное отклонение (x ± s). Для сравнения статистической значимости между группами использовали t-критерий. п<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

использованная литература

1. Узденский А.Б.; Демьяненко С. Ацетилирование и деацетилирование гистонов при ишемическом инсульте. Нейронная регенерация. Рез. 2021, 16, 1529–1530. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

2. Ли, Х.; Инь, А .; Ченг, З .; Фэн, М .; Чжан, Х .; Сюй, Дж.; Ван, Ф .; Qian, L. Ослабление сигнального пути амплификации Na/K-ATPase/Src/ROS с помощью pNaktide улучшает повреждение миокарда при ишемии-реперфузии. Междунар. Дж. Биол. макромол. 2018, 118, 1142–1148. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Левин Р.М.; Ся, Л.; Вэй, В .; Шулер, К.; Леггетт, RE; Лин, ADY Влияние спор с разбитой оболочкой Ganoderma Lucidum на окислительный стресс мочевого пузыря кролика с использованием модели ишемии / реперфузии in vivo. Мол. Клетка. Биохим. 2017, 435, 25–35. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Тан, З.; Лю, Х .; Песня, X .; Линг, Ю.; Он, С.; Ян, Ю .; Ян, Дж .; Ван, С.; Ван, X .; Чен, А. Хонокиол после лечения улучшает ишемию / реперфузию миокарда за счет усиления аутофагического оттока и снижения внутриклеточной продукции АФК. хим. биол. Взаимодействовать. 2019, 307, 82–90. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Хаузенлой, ди-джей; Йеллон, Д.М. Ишемически-реперфузионное повреждение миокарда: забытая терапевтическая цель. Дж. Клин. расследование 2013, 123, 92–100. [Перекрестная ссылка]

6. Ю, С.; Ли, Д.; Ли, З .; Ю, Д .; Чжай, Г. Влияние сакубитрила/валсартана на воспаление и окислительный стресс в модели сердечной недостаточности, вызванной доксорубицином, у кроликов. Акта Фармацевт. 2021, 71, 473–484. [Перекрестная ссылка]

7. Ван Ю.; Че, Дж.; Чжао, Х .; Тан, Дж.; Shi, G. Платикодин D ингибирует окислительный стресс и апоптоз в кардиомиоцитах H9c2 после гипоксии/реоксигенации. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 2018, 503, 3219–3224. [Перекрестная ссылка]

8. Павлович М.; Б. Нафради Роустер, П. Высокостабильный нанокомпозит, имитирующий ферменты, обладающий антиоксидантной активностью. J. Коллоидный интерфейс Sci. 2019, 543, 174–182. [Перекрестная ссылка]

9. Ци, Гц; Ванги, WZ; Он, Ю.Я. Антиоксидантная система Deinococcus radiodurans. Рез. микробиол. 2019, 171, 822–831. [Перекрестная ссылка]

10. Шао Л.; Шао, Ю.; Юань, Ю. Флаванон пиноцембрина ингибирует жизнеспособность клеток при PC -3 раке предстательной железы человека, вызывая клеточный апоптоз, выработку АФК и остановку клеточного цикла. Акта Фармацевт. 2021, 71, 669–678. [Перекрестная ссылка]