Противовоспалительные принципы из иголок Pinus Taiwanensis Hayata и исследования in silico их потенциального омолаживающего действия

Абстрактный:Пинусигольчатый чай очень популярен в восточных странах, таких как Япония, Россия, Корея и Китай. Утверждается, что чай из сосновых иголок обладает значительнымомолаживающий эффект,но до сих пор нет четких доказательств в поддержку этого. В настоящем исследовании пятнадцать неописанных соединений (1–5), а также семьдесят два известных соединения были очищены и охарактеризованы из биоактивной фракции метанольных экстрактовП. тайванскийиглы.

Лучшие продукты Cistanche с антивозрастными травами

Большинство изолятов исследовали на предмет ихпротивовоспалительная биоактивностьпо модели клеточных нейтрофилов и шести соединений (45, 47, 48, 49, 50, и51) выставилзначительное ингибирование образования супероксидных анионови высвобождение эластазы со значениями IC50 в диапазоне от 3,3± 0.9–8.3± 0.8 µМ. Этипротивовоспалительные ингредиентыбыли подвергнуты стыковочным вычислениям для оценки их аффинности связывания с рецептором грелина, играющим важную роль в регуляции метаболизма, сомолаживающие эффекты. Соединения49, 50, и51 образовывал устойчивый комплекс с рецептором грелина за счет водородных связей и различных типов взаимодействий.

1. Введение

Пинусрод (Pinaceae), включающий более 100 видов и в основном распространенный в Северном полушарии, обычно представляет собой вечнозеленые деревья, а некоторые — кустарники.1]. Древесина сосны легкая и часто используется для изготовления мебели. Однако различные фармакологические эффекты хвои на побегах сосны зафиксированы в древних книгах традиционной китайской медицины. В «Каноне травяного фонда божественного земледельца» сосновые иглы способствуют росту волос, продлевают жизнь и утоляют жажду. В «Taiping Shenghui Fang» было записано, что сосновые иголки можно варить с алкоголем и проявлять омолаживающий эффект. В настоящее время сосновые иглы перерабатываются в чай ​​и популярны в Азии. В Корее составляющиеП. густая флораигольчатый чай, а также егоантиоксидантная и антибактериальная биоактивность были тщательно исследованы [2,3]. С начала прошлого века было идентифицировано более семисот соединений изХвоя сосны. Большая часть опубликованной литературы посвящена эфирному маслуП. густоцветковая[4,5], П. халепенсис[6,7], П. нигра[4,8], иП. сильвестрис[4,9]. Охарактеризованные компонентыПинусхвоя в основном состоит из бензоидов, дитерпеноидов, флавоноидов, лигнанов, монотерпеноидов и сесквитерпеноидов.10]. ИглыП. густая флораиП. моррисониколасообщалось об их антиоксидантной биологической активности [11–14]. Кроме того, этилацетатный экстракт хвоиП. моррисониколаингибирует экспрессию белка и мРНК NO иiNOS в макрофагах RAW 264.7, индуцированных ЛПС, проявляет значительную противовоспалительную биологическую активность.13]. Сверхкритический жидкий экстрактП. густая флораиглы продемонстрировали ингибирующий эффект на продукцию NO, индуцированную ЛПС, путем снижения экспрессииiNOS и снижение экспрессии IL-6 и IL-1 и активация белков STAT1 и STAT3 в макрофагах, индуцированная LPS.15]. Экстракт этанола изП. Тунбергиииглы показали значительный противовоспалительный эффект в макрофагах и подавляли отек уха, вызванный арахидоновой кислотой, и ингибировали ферментативную активность миелопероксидазы.16]. Более того, ферментированныйП. моррисониколахвоя показала свою превосходную антиоксидантную и противовоспалительную биологическую активность, модулируя NF-κсигнальный путь В [17]. 

Грелин — это пептидный гормон, состоящий из двадцати восьми аминокислот, первоначально обнаруженный в желудке.18,19]. Это эндогенный лиганд для стимулятора секреции гормона роста (GHSR), который является членом -ветвь в GPCR класса A (рецепторы, связанные с G-белком) [18,19]. Грелин — единственный пептидный гормон, вызывающий чувство голода для повышения аппетита.20]. Многие исследования показали, что грелин играет важную роль в регуляции обмена веществ, энергетического баланса, памяти, сердечно-сосудистых и желудочно-кишечных функций в организме человека.21–23]. Грелин также участвует в различных физиологических и патофизиологических механизмах в организме человека, таких как старение.24,25], и это может быть связано с противовоспалительной активностью [26,27]. В 2014 году наша группа впервые идентифицировала уникальные ацилированные тетрагликозиды флавоноидов, называемые теагрелинами, в чае Чин-шин улун и продемонстрировала их стимулирующую активность в отношении высвобождения гормона роста (GH).28]. Два других подобных соединения были очищены в чае Ши-жи-чуен улун, и их биологическая активность в отношении рецептора грелина также была подтверждена.29]. Четыре тигрелина вызывали чувство голода посредством того же регуляторного пути, что и грелин. Не ограничиваясь чаем, соединения со сходной структурой или биологической активностью с тигрелинами также были исследованы вПолигонум многоцветковый(Он хоуу) [30], Гинкго билоба[31], Морус белый[32], иЦистанхе трубчатая [33]. Эти результаты поддерживают нас в поиске естественных принципов омоложения путем скрининга грелиноподобных соединений чая, обладающих противовоспалительным действием. В дополнение к прямому промотированию высвобождения гормона роста в клеточных моделях, молекулярное моделирование некоторых потенциальных соединений может быть более эффективным при изучении возможных кандидатов.34]. Вычислительные методы применялись для разработки и оценки фармакологических гипотез. Молекулярный докинг является одним из наиболее часто используемых методов и с высокой точностью предвосхищает конформацию и сродство связывания лиганда с активным карманом.35,36]. Методы стыковки эффективно ищут многомерные пространства для возможного взаимодействия и используют функцию оценки, которая правильно ранжирует кандидатов.37]. 

В 2018 г. из хвои были выделены три соединения.П. моррисониколаи проявлял значительную сосудорасширяющую активность, и среди этих компонентов сообщалось об одном со структурой, подобной чайному грелину.38]. В Тайване,П. тайванскийиглы обычно сушат и запекают, а затем заваривают в виде чая из-за их известной биологической активности.П. тайванскийХаята — один из местных и эндемичных видов Тайваня. Ее также называют тайваньской красной сосной или сосной хуаншань. В пучке две хвоинки длиной 8–11 см, слегка жесткие и прямые, он растет по всему острову от низких до больших высот и часто образует чистый лес.39]. При предварительном исследовании этилацетатный слой метанольных экстрактовП. тайванскийиглы продемонстрировали значительное ингибирование образования супероксидных анионов и высвобождения эластазы при IC50 значения 0.8± {{0}}.2 и 1.0± 0.1 µг/мл соответственно (таблица S1). Таким образом, в настоящем исследовании биологически активные компонентыП. тайванскийбыли исследованы иглы, и очищенные соединения были оценены на предмет их противовоспалительного действия. биоактивность на модели клеточных нейтрофилов. Кроме того, изоляты изП. тайванскийиглы с противовоспалительной биологической активностью были подвергнуты стыковочным вычислениям иисследованы на предмет их взаимодействия с рецептором грелина.

2. Материалы и методы

2.1. Общие экспериментальные процедуры

ультрафиолетовые (УФ) спектры получали на спектрометре Hitachi U-2001 UV/V.инфракрасные (ИК) спектры исследовали на спектрофотометре Jasco FT/IR-4100.1H-, 13C-, и двумерные спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были записаны на приборе Bruker AV-400ЯМР-спектрометр. Химические сдвиги показаны наδ значения (ppm) с тетраметилсиланомв качестве внутреннего стандарта.δH иδC значения были для химических сдвигов сигналов,соответственно. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением высокого разрешения (HR-ESI-MS) былапроведено на спектрометре JEOL JMS-700 (работающем в режиме отрицательных ионов).

2.2. Растительный материал

ИглыП. тайванскийбыли собраны в Пули, Наньтоу, Тайвань и идентифицированыпрофессор Шэн-Янг Ван (кафедра лесного хозяйства, Национальный университет Чун-Син,Тайчжун, Тайвань). Образец ваучера (PCKuo_2016003) был помещен в гербарийium Фармацевтической школы Национального университета Ченг Кунг, Тайнань, Тайвань.

2.3. Извлечение и изоляция

2.4. Спектральные и физические данные 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Дигидрокси -70 -(4-гидрокси-3-метоксифенил)пропан-80 -илокси] -2-гидроксибензойная кислота (2)Бесцветный сироп; [ ]25 D плюс 5,3 (c 0.1, МеОН); УФ (МеОН)λМакс(бревноε) 284 (3.59), 253 (3,80) нм; РДРВ (c 3.51 × 10−4 М, МеОН)λМакс(∆ε) 248 (плюс 1,33), 224 (плюс 1,03),214 (плюс 1,10) нм; ИК (аккуратно)νМакс3425, 2927, 1541, 1384, 1271 см−1;1Рука13С ЯМР; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− вычислено для C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Гидроксиагаровая кислота (3)

Бесцветный порошок; тр: 263◦С (разл.); [ ]25 D плюс 30,8 (c 0.1, МеОН); УФ (МеОН)λМакс(бревноε) 225 (ш) (3,83) нм; ИК (аккуратно)νМакс3450, 2937, 1648, 1252 см−1;1H-ЯМР (CD3ОД,400 МГц) δ 0.63 (3H, с, CH3-20), 1,09 (1Н, ддд,J = 13.6, 13.6, 3.6 Гц, H-3a), 1.21 (3H, с, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, с, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, дд,J = 9.2, 2,8 Гц, H-12), 4,53 (1H, с, H-17a), 4,91 (1H, с, H-17b), 5,88 (1H, шир.с, H-14);13C-ЯМР (CD3ОД, 100 МГц)δ 13,5 (СН3-20), 14,9 (СН3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (СН3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (С-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− вычислено для C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Изопропил-3-оксоциклогекс-1-ен-1-карбоновая кислота (4)

Бесцветный таблитчатый кристалл; тр: 235◦С (разл.); [ ]25 D плюс 28,6 (c 0.3, МеОН); УФ (МеОН)λМакс(бревноε) 237 (ш) (3,40) нм; ИК (аккуратно)νМакс3456, 2925, 1635, 1395 см-1;1H-ЯМР (CD3ОД,400 МГц) 0,88 (3H, д,J = 6.8 Гц, канал3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Гц, канал3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, м, H-4b), 2,09 (1H, м, H-5), 2,31 (1H, гепт,J = 6,8 Гц, H-8), 2,50 (1H, дддд,J = 19,2, 9,2, 4,8, 2,4 Гц, H-6a), 2,70 (1H, дддд,J = 19,2, 5,2, 5,2, 1,2 Гц, H-6b), 6,32 (1H, дд,J = 2.4, 1,2 Гц, H-2);13C-ЯМР (CD3ОД, 100 МГц)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (С-6), 27,1 (С-8), 53,7 (С-5), 128,7 (С-2), 160,6 (С-1), 174,8 (С-7), 205,7 (С-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− вычислено для C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Стираксиноловая кислота (5)

Бесцветный сироп; УФ (МеОН)λМакс(бревноε) 308 (2,89), 237 (ш) (3,37), 222 (ш) (3,70) нм;ИК (аккуратно)νМакс3421, 2926, 1572, 1395, 1268 см-1;1H-ЯМР (CD3OD, 400 МГц) 1,82 (2H, tt,J {{0}}.0, 6,8 Гц, H-8), 2,61 (2H, т,J {{0}}.0 Гц, H-7), 3,56 (2H, т,J = 6,8 Гц, H-9), 3,83 (3H, с, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2,4 Гц, H-4), 7,31 (1H, д,J = 2.4 Гц, H-6);13C-ЯМР (CD3ОД,100 МГц)δ 32,7 (С-7), 35,6 (С-8), 56,6 (ОСН3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (С-6), 131,9 (С-5), 149,2 (С-3), 150,7 (С-2), 176,2 (С-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−вычислено для C11H13O5, 225.0763).

2.5. Противовоспалительное исследование биоактивности

2.5.1. Подготовка нейтрофилов человека

Исследование было проведено с одобрения Институционального наблюдательного совета Мемориальной больницы Чан Гунг (IRB № 201800369A3). Образцы крови были взяты у здоровых доноров-людей (возраст от 20 до 30 лет), а нейтрофилы были выделены и очищены в соответствии с протоколами, описанными ранее.40]. 

2.5.2. Генерация супероксидных анионов

Измерение Анализ для измерения образования супероксидных анионов был основан на SOD-ингибируемом восстановлении феррицитохрома.c как описано ранее [40].

2.5.3. Анализ высвобождения эластазы

Дегрануляцию азурофильных гранул определяли путем измерения высвобождения эластазы, как описано ранее [1].40]. 

2.5.4. Статистический анализ Результаты представлены в виде среднего± стандартная ошибка среднего (SEM). Расчет 50-процентных ингибирующих концентраций (IC50) выполняли с использованием программного обеспечения PHARM/PCS v.4.2. Статистические сравнения были сделаны между группами с использованием Стьюдента.t-тест. значенияp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Исследование молекулярной стыковки

in silicoоценка проводилась с помощью программного обеспечения AutoDock Vina [41]. Кристаллическая структура рецептора грелина была охарактеризована.42] и а . Файл PDB был загружен из банка данных белков (идентификатор PDB: 6KO5). Трехмерные структуры лигандов были построены в программе Chem3D. Было проведено добавление водорода, измерение заряда Гастайгера для атомов белка и выбор гибких торсионов для лигандов. AutodockTools (версия ADT 1.5.6). Размер сетки был рассчитан на 18,5 Å.× 18.5 Å × 18,5 Å и центр сетки в размерах (x, y и z соответственно): 9,7, –19,2, 14,6. Энергия аффинности связывания представлена ​​в виде баллов докинга и показана в ккал/моль. Лучшим взаимодействием считалась только самая результативная поза. Визуализация лучших взаимодействий со стыковкой была проанализирована в клиенте Biovia Discovery Studio 2020 [43].