Биоанализ для мониторинга омолаживающего эффекта лечения пуповинной кровью

Контактное лицо:jerry.he@wecistanche.com

Сан-Хун Бэ1*, Ала Джо1,2*, Джэ Хён Пак1, Чул-Ву Лим1, Юрий Чой1, Джухён О2, Джи-Мин Пак1, ТэХо Конг1, Ральф Вайследер2,3, Хакхо Ли2, Джисук Мун1

1. Кафедра биотехнологии, Колледж наук о жизни, Университет ЧА, Кёнгидо, 13488, Республика Корея.

2. Центр системной биологии Массачусетской больницы общего профиля Гарвардской медицинской школы, Бостон, Массачусетс, 02114, США.

3. Кафедра системной биологии, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс, 02115, США *Эти авторы внесли равный вклад.

Автор, ответственный за переписку: Хакхо Ли, доктор философии. Центр системной биологии Массачусетской больницы общего профиля, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Бостон, Массачусетс 02114, США. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Джисук Мун, доктор философии. Кафедра биотехнологии, Колледж наук о жизни, Университет CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, Республика Корея. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

© Международное издательство Ivyspring. Это статья в открытом доступе, распространяемая на условиях лицензии Creative Commons Attribution (CC BY-NC) (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). Полные условия см. на http://ivyspring.com/terms.

Поступило: 04.10.2018; Принято: 2018. 11. 18; Опубликовано: 01.01.2019

Цистанхе обладает омолаживающим эффектом.

Абстрактный

Фон: Лечение пожилых животных плазмой ранней стадии развития (например, плазмой пуповины) показало впечатляющий потенциал для замедления возрастной деградации нейронных и когнитивных функций. Однако перевод таких результатов в клинические реалии требует эффективных способов оценки эффективности лечения; идеальные методы должны быть минимально инвазивными, подходящими для серийных анализов, экономически эффективными и количественными.

Методы: Мы разработали новый биосенсорный подход для мониторингапротив старениятерапия. Мы усовершенствовали два ключевых компонента сенсора: i) переносимый кровью метаболит был идентифицирован как суррогатный маркер старения; и ii) была разработана компактная и экономичная система анализа для применения на месте. Мы лечили старых мышей либо плазмой пуповины человека, либо физиологическим раствором; беспристрастный анализ профиля метаболитов в плазме мышей показал, что арахидоновая кислота (АК) является мощным индикатором, связанным спротив старенияэффект. Затем мы внедрили конкурентоспособный магнитоэлектрохимический датчик (cMES), оптимизированный для обнаружения АА непосредственно из плазмы. Разработанная платформа могла обнаруживать АА непосредственно из небольших объемов плазмы (0,5 мкл) в течение 1,5 часов.

Результаты: Анализ cMES подтвердил сильную корреляцию между уровнями АК иомолаживающий эффект: Уровни АК, снижаясь с возрастом, увеличивались у старых мышей, получавших плазму, что также показало улучшение способности к обучению и памяти.

Выводы. Платформа cMES расширит возможности как доклинических, так и клинических исследований.против старенияисследование, позволяющее проводить минимально инвазивное длительное наблюдение за лечением; эти возможности ускорят развитиепротив старениятерапии, улучшающие качество жизни человека.

Ключевые слова: Anti-aging, арахидоновая кислота, профилирование метаболитов, магнитоэлектрохимический сенсор, биосенсор.

Введение

Старение все чаще признается клиническим фактором риска когнитивной дегенерации (например, нейродегенерации, деменции) и других хронических заболеваний (например, рака, сердечно-сосудистых заболеваний, мышечной дегенерации) [1]. С увеличением продолжительности жизни человека и ростом пожилого населения предпринимаются значительные усилия для выяснения механизмов старения [1–3] и поиска терапевтических стратегий для замедления или даже обращения вспять процессов старения [4]. Действительно, сообщалось об многообещающих результатах исследований на животных; у взрослых мышей, которым переливали плазму от молодых мышей, восстанавливались когнитивные функции, синаптическая пластичность и активность нейронов [5]. Быстрое развитие впротив старенияожидаются методы лечения и их перевод в испытания на людях [6]. Текущие показатели для мониторинга эффектов лечения, однако, имеют ограниченную практичность, поскольку методы часто трудно применять к людям (например, инвазивная визуализация мозга, контролируемое наблюдение за поведением) и субъективны (например, анкеты об опыте пациентов). Одно из ключевых условий продвиженияпротив старенияТаким образом, терапия заключается в разработке количественных, минимально инвазивных анализов для мониторинга лечения.

Мы пришли к выводу, что метаболиты могут быть мощным источникомпротив старениябиомаркеры. Метаболиты являются важным фенотипом организма и изучаются в качестве диагностических биомаркеров других заболеваний [7]. В частности, старение обычно связано с метаболическими изменениями или дисфункцией, которые влияют на общие профили метаболитов в организме. Таким образом, вполне возможно, что отслеживание состава и/или уровней метаболитов даст информацию об эффективностипротив старениялечение. Кроме того, анализы метаболитов, особенно в форме анализов крови, могут быть количественными и минимально инвазивными; эти достоинства облегчили бы оценку различных схем лечения или групп пациентов, а также мониторинг динамики (анти-)старения посредством серийного отбора проб.

Здесь мы описываем новую биосенсорную стратегию для мониторингапротив старениялечение. Были усовершенствованы два ключевых элемента: i) переносимый кровью метаболит был идентифицирован как суррогатный маркер старения; и ii) была разработана быстрая и экономичная система анализа для применения в обычных клинических условиях. В частности, мы лечили когорту старых мышей (около 2 лет) плазмой пуповинной крови человека. Комплексный метаболический анализ крови мышей показал, что арахидоновая кислота (АК), уровень которой значительно снижался с возрастом, обратно возрастала в группе, получавшей лечение. Это наблюдение привело нас к разработке магнитоэлектрохимического сенсора для малых молекулярных мишеней: мы оптимизировали конкурентную электрохимическую реакцию, в которой АА улавливалась магнитными шариками и концентрировалась для повышения чувствительности. Разработанная платформа могла обнаруживать АА непосредственно из небольших объемов плазмы ({5}},5 мкл) в течение 1,5 часов. Используя эту платформу, мы смогли дополнительно установить положительную корреляцию между уровнями АК в крови и лучшими показателями животных в двигательных задачах.

Полученные результаты

Лечение взрослых мышей плазмой пуповинной крови На рис. 1а показана общая схема эксперимента.

В качестве агента использовали плазму, полученную из образцов пуповинной крови человека. Предыдущие исследования показали, что у старых мышей, которым вводили плазму молодых мышей, восстанавливалась функция пространственной памяти, а системное введение плазмы пуповинной крови человека улучшало когнитивные функции, зависящие от гиппокампа, у старых мышей [5, 8]. Введение плазмы, лишенной клеточных компонентов, минимизировало риск иммунного отторжения, вызванного несоответствием видов. Старые мыши (начальный возраст, 18 месяцев) были рандомизированы и получали либо плазму (группа лечения), либо солевой буфер (группа имитации) путем инъекции в хвостовую вену (130 мкл; подробности см. на рис. S1). В качестве положительного контроля использовали молодых мышей (возраст 3 месяца). Плазму, полученную из пуповинной крови, не объединяли, и каждой мыши неоднократно вводили плазму от одного и того же донора (рис. S1). После 4-недельного лечения мышей подвергали поведенческому тесту (т. е. ротароду) и брали кровь для анализа.

Рисунок 1. Экспериментальный дизайн. Плазму пуповинной крови человека вводили молодым (3-месячным), пожилым (20- и 23-месячным) и пожилым группам, получавшим плазму (20- и 23-месячного возраста). Три группы были подвергнуты 2-пробным тестам с вращающимся стержнем для измерения координации движений и обучения. Профиль нецелевого метаболита был выполнен в крови из трех групп, и наиболеепротив старения- соответствующий путь был определен с помощью биоинформатического подхода. Биосенсор был разработан для обнаружения наиболее важных метаболитов пути.

Рисунок 2. Определение биомаркеров метаболитов, связанных с лечением плазмой пуповинной крови человека. (A) Глобальный профиль возмущения метаболита. Строки соответствуют характеристикам (уникальная комбинация значения m/z и времени удерживания) от ЖХ/МС, а столбцы — к образцам. Строки иерархически сгруппированы. (B) Оценка графика PCA для уменьшения размеров. Образцы были построены в зависимости от главных компонентов (PC) 1 и 2. Значения в скобках надписей осей представляют собой пропорции дисперсии, объясненные этими компонентами. PC1, скорее всего, объясняет омолаживающие эффекты, учитывая, что группа, получавшая плазму, была намного ближе к молодой группе, чем к группе имитации. (C) Анализ обогащения пути. Метаболиты идентифицировали путем сопоставления измеренных значений m/z с информацией о молекулярной массе. Каждый кружок представляет определенный найденный путь. Для данного пути положение x или размер кружка соответствует относительной центральности метаболитов (мера влияния пути) и положение y или цвет (более низкие значения p для красного и более высокие для синего) в той степени, в которой какие метаболиты преобладают. Доминирующие пути имеют более высокие значения x и y. Соответственно, метаболизм арахидоновой кислоты (АК) был идентифицирован как наиболее вероятный путь для объясненияомолаживающие эффектыплазмы пуповинной крови.

Метаболические анализы образцов крови мышей

Сначала мы выполнили объективное профилирование низкомолекулярных метаболитов в плазме мыши. Образцы крови от всех трех групп мышей подвергали жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС). Мы обработали данные m/z с помощью MAIT (набор инструментов для автоматической идентификации метаболитов) и определили статистически значимые признаки с помощью ANOVA (8572 уникальных комбинации m/z и времени удерживания) (рис. 2а). Иерархический кластерный анализ (HCA) метаболитов выявил две ключевые закономерности: i) профили метаболитов отчетливо отличались у старых (нелеченых) и молодых мышей; и ii) профиль старых мышей, получавших плазму, был ближе к таковому у молодых мышей.

Анализ главных компонентов (PCA) выявил неотъемлемую структуру данных метаболомики (рис. 2б). Около 50% всех вариаций объяснялось первой (ПК1) и второй главной компонентой (ПК2). Все три когорты (т. е. молодые, получавшие плазму и ложные группы) располагались в дискретных позициях, что указывает на то, что были идентифицированы биологически значимые признаки для дифференциации групповых классов. Интересно, что пожилая группа, получавшая плазму, отошла от имитации в сторону молодой группы. Чтобы количественно оценить разделение групп, мы вычислили иерархическую кластеризацию двух основных компонентов. На дендрограмме молодые и обработанные плазмой группы были сгруппированы на более низком уровне различия (или более высоком уровне сходства, 1120,9), чем необработанная группа (3162,5) (рис. S2). Эти результаты показывают, что выбранные функции (переменные или строки на рис. 2а) можно использовать для вывода биомаркеров метаболитов, имеющих отношение к старению ипротив старения. Мы аннотировали признаки известными метаболитами, используя общедоступную базу данных [9].

Мы дополнительно оценили функции и взаимосвязь идентифицированных метаболитов, применяя картирование KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) [10]. Для данного пути мы измерили i) чрезмерное представительство метаболита-кандидата и ii) его важность (т. е. промежуточность) [11] в качестве ключевого промежуточного узла между парами других метаболитов (подробности см. в разделе «Методы»). Мы обнаружили, что метаболизм арахидоновой кислоты (АК) был наиболее широко представленным путем (самое высокое значение y на рис. 2c), и метаболиты в этом пути, как правило, располагались на коммуникационных путях (более высокие значения x на рис. 2c) и управлять потоком информации. Среди многих метаболитов в метаболизме АК мы выбрали саму АК в качестве биомаркера; как начальный вход в путь, одна АК может быть представителем других нарушенных метаболитов.

Конкурентный магнитоэлектрохимический сенсор (кМЭС) для обнаружения АА в плазме

Затем мы решили разработать быструю систему анализа на месте для обнаружения АА. Мы решили использовать технологию магнитоэлектрохимического зондирования [12–17]. Он объединяет обогащение и обнаружение мишеней на одной платформе: магнитные шарики (MB) используются для захвата и маркировки молекулярных мишеней, а связанные с шариками мишени обнаруживаются с помощью электрохимического зондирования. Этот подход имеет много практических преимуществ: i) нативные образцы (плазма или кровь) могут использоваться напрямую без необходимости очистки образцов; ii) анализ обеспечивает высокую чувствительность обнаружения благодаря магнитному обогащению и усилению ферментативного сигнала; iii) на основе электрической схемы обнаружения датчики можно легко миниатюризировать до портативного устройства (рис. 3а).

Однако обнаружение АА с помощью магнитоэлектрохимического зондирования представляло собой техническую проблему; поскольку АА представляет собой небольшую молекулу (~304,5 Да), иммуноанализ с использованием пары АА-антител было трудно применять. Таким образом, мы исследовали формат конкурентного анализа (cMES; конкурентный магнитоэлектрохимический датчик), для которого требовалось только одно антитело AA (рис. 3b). Для захвата мишени мы покрывали MB AA-антителами (MBAb). Мы также получили конкурирующий агент (АК-ПХ) путем конъюгации АК с окисляющим ферментом (пероксидазой хрена, ПХ). В частности, мы использовали гаптеновую форму; AA конъюгировали с бычьим сывороточным альбумином (BSA) и дополнительно конъюгировали HRP с носителем BSA (рис. S3). Для анализа cMES образцы крови смешивали с MBAb и AA-HRP. Количество AA-HRP было достаточным для насыщения сайтов связывания AA в MBAb (методы). Это может привести к дифференциальной нагрузке HRP на MB в зависимости от количества эндогенной АК в образцах. Последовательное добавление хромогенного медиатора электронов (3,3',5,5'-тетраметилбензидина, ТМБ) генерировало электрический ток, который считывался плоским электродом. Время реакции для захвата AA и инкубации TMB было оптимизировано для максимального уровня сигнала (рис. S4).

Рисунок 3. Конкурентный магнитоэлектрохимический датчик (cMES) для анализа AA. (А) Схема устройства. Устройство cMES занимает мало места и позволяет

операции на месте. (B) Мы разработали конкурентный электрохимический анализ для обнаружения AA. Магнитные шарики (MBAb) конъюгировали с антителами против АА.

Контрольные образцы содержали только AA-HRP и были смешаны с магнитными шариками. Образцы для испытаний смешивали с магнитными шариками и AA-HRP. (С) Электрические токи

измеряется портативным считывателем cMES. В анализе cMES величина тока уменьшается с увеличением концентрации АК [АК]. Сигнал от управления

образец устанавливает базовый уровень для [AA]=0 нг/мл. В качестве аналитической метрики использовалась разница тока (∆I) между контрольным и целевым образцами плазмы. (Д)

Известные количества АК добавляли в сыворотку и измеряли с помощью cMES. Предел обнаружения составил ~126 нг/мл. (E) cMES и ELISA сравнивали для

соответствие. Результаты обоих методов показали хорошее совпадение (R2=0,959). Данные отображаются как среднее значение ± SEM из трех повторных измерений.

Рис. 4. Измерения АА в образцах плазмы. (A) Анализ динамики уровня мышиной АК после инъекции плазмы. Мы вводили 13{{10}} мкл плазмы (концентрация АК=7.2 мкг/мл) мышам (n=6) и собирали кровь мышей через 3, 7 и 14 дней. Затем контролировали уровни АК в крови мышей. Уровни АК значительно увеличились на 3-й день и вернулись к нормальному уровню через 7 дней. *p < 0.05;="" **р="">< 0.01;="" ***р="">< 0.001.="" (b)="" были="" проанализированы="" образцы="" плазмы="" мыши.="" в="" контрольной="" группе="" (n="5)" молодые="" мыши="" (возраст="" 5="" и="" 8="" месяцев)="" имели="" более="" высокие="" уровни="" ак,="" чем="" старые="" мыши,="" которым="" вводили="" имитацию="" (возраст="" 20="" и="" 23="" месяца;="" n="8)." в="" группе,="" получавшей="" плазму="" (n="5)," наблюдалось="" устойчивое="" увеличение="" ак.="" *р="">< 0,05;="" **р="">< 0,01;="" ***р="">< 0,001.="" (c)="" образцы="" плазмы="" из="" тех="" же="" когорт,="" что="" и="" в="" (b),="" были="" проанализированы="" масс-спектрометрией.="" уровни="" aa="" показали="" аналогичную="" тенденцию,="" измеренную="" cmes.="" *р="">< 0,05;="" **р="">< 0,01;="" ***р="">< 0,001.="" данные="" отображаются="" как="" среднее="" ±="">

В результате конкурентного анализа величина электрического тока уменьшалась при более высоких концентрациях АК в плазме ([АК]). Поэтому мы подготовили контрольный образец, инкубируя MBAb только с AA-HRP. Контрольный образец использовали для установки верхней базовой линии (т. е. [AA]=0 нг/мл) для расчета различий сигналов; измерялись электрические токи от контроля и образца плазмы, и результирующая разность |∆I|=|Icontrol - Iplasma|был получен (рис. 3в). Такой

дифференциальные измерения также компенсировали общий фоновый сигнал.

Эксперимент по титрованию (рис. 3d) с использованием образцов с добавлением различных количеств АК показал, что предел обнаружения (LOD) составляет ~ 125,9 нг/мл. LOD анализа был в ~300-раз ниже типичной концентрации АК (38 мкг/мл) в плазме молодых мышей (5 месяцев, n=2). Основываясь на этих результатах, мы разбавили исходные образцы плазмы (в 100-кратно), добавив буферный раствор (см. Методы). Сигнал от неспецифического связывания был близок к внутреннему фоновому уровню (~ 43 нА), что потенциально было связано с высоким коэффициентом разбавления. Мы также подтвердили, что результаты анализа совпадают с результатами обычного ELISA (R2=0.961, рис. 3e). Однако анализ cMES был быстрее (1 час), чем ELISA (4 часа), в основном из-за быстрой кинетики связывания; в cMES MB улавливают AA во всем объеме образца (3-размерная диффузия), тогда как захват AA основан на 1-пространственной диффузии в ELISA на основе планшета.

Мониторинг AA у мышей, получавших плазму

Мы применили cMES для анализа уровней АК у мышей после однократной обработки плазмой. Поскольку АК естественным образом присутствует в пуповинной крови человека, инъекция плазмы дополнительно увеличивает уровни АК у мышей. Средняя концентрация АК в шести разных плазмах пуповинной крови человека составила 7,2 ± 0,5 мкг/мл (среднее значение ± стандартная ошибка среднего). Мы вводили 13 0 мкл плазмы пуповинной крови человека мышам (n=6) и контролировали их уровни АК (рис. 4а). Инъекция плазмы немедленно повысила уровень АК в крови (3-й день; p < 0,01="" по="" сравнению="" со="" всеми="" другими="" временными="" точками),="" но="" эффект="" был="" временным;="" уровни="" ак="" вернулись="" к="" норме="" через="" 7="" дней="" после="" лечения="" (p="0,34" по="" сравнению="" с="" моментом="" времени="" до="" инъекции="">

Затем мы отслеживаем уровни АК в плазме после полного графика лечения (рис. S1). Были использованы три разные когорты мышей: обработанные плазмой (n=8) и плацебо (n=8) возрастные группы (20-23 месяцев) и молодая контрольная группа (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Лечение плазмой, приводящее к улучшению когнитивных функций и поведения у старых мышей

Далее мы оценили поведенческие фенотипы когорт животных, особенно оценивая их двигательное обучение и функции памяти. Мы провели {{0}} пробные ротарод-тесты через 1 и 4 месяца после лечения плазмой или плацебо (рис. 5а); латентный период (время бега) мыши перед падением на вращающемся стержне использовали для оценки двигательной активности животного. Через 1 месяц после лечения (20-месячный возраст) латентный период как в группах, получавших имитацию, так и в группе, получавшей плазму, был значительно ниже (p < 0,0001),="" чем="" у="" молодых="" (5-месячный="" возраст).="" )="" группа="" (рис.="" 5б).="" однако="" в="" группе,="" получавшей="" плазму,="" наблюдалось="" постепенное="" улучшение="" моторного="" обучения="" и="" памяти,="" в="" то="" время="" как="" в="" группе="" с="" плацебо="" эти="" же="" способности="" снижались.="" изменения="" уровня="" аа="" предшествовали="" изменениям="" в="" поведении,="" что="" может="" служить="" ранним="">против старениялечебный эффект (рис. 5в).

Анализ ткани головного мозга (рис. 5d, 5e) показал, что у старых мышей (группа имитации) площадь DCX-позитивных клеток в субвентрикулярной зоне была меньше, чем у молодых мышей. Наоборот, площадь DCX-позитивных клеток увеличилась у животных, получавших плазму, и осталась неизменной (p=0.04), что указывает на то, что инъецированная плазма пуповинной крови стимулировала нейрогенез старого мозга. Результаты свидетельствуют о потенциальной пользе лечения плазмой для устойчивого нейрогенеза, что привело к улучшению двигательной функции в группе, получавшей лечение.

Обсуждение

Достижения в области омолаживающей терапии одновременно увеличивают потребность в объективных и количественных показателях эффективности лечения. Таким образом, мы разработали наше исследование для выявления молекулярных биомаркеров, которые могут лучше всего объяснить фенотипические особенности старения ипротив старениялечение. Наши эксперименты на животных привели к следующим наблюдениям: 1) профили метаболитов молодых и взрослых когорт мышей явно различаются; и ii) инъекция плазмы пуповинной крови человека старым мышам изменяет характер их метаболитов ближе к таковым у молодых мышей. Интересно, что мы обнаружили арахидоновую кислоту (АК) в качестве наиболее эффективного суррогатного биомаркера дляпротив старениялечение; Метаболизм АК был сильно нерегулируемым как у молодых мышей, так и у мышей, получавших плазму, и было обнаружено, что он играет ключевую роль во взаимодействии с другими метаболическими путями, такими как метаболизм линолевой кислоты [10, 18].

Далее мы разработали быструю портативную сенсорную систему (cMES) для облегчения обнаружения АА в рутинных исследованиях и клинических условиях. Мы специально интегрировали схему конкурентного анализа с иммуномагнитным обогащением, чтобы обнаружить низкомолекулярные мишени (например, метаболиты) непосредственно из образцов плазмы. Такое сочетание дает следующие преимущества. (i) Анализ выигрывает от быстрой кинетики связывания, поскольку магнитные шарики захватывают AA во всем объеме образца (3-размерная диффузия). (ii) Процессы анализа (например, этапы промывки) упрощаются благодаря использованию внешних магнитов для сбора шариков. (iii) Путем магнитной концентрации шариков, связанных с АК, вблизи электрода обнаружения общий аналитический сигнал может быть улучшен (~72 процента) [12]. Действительно, мы показали, что анализ cMES использует<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Рисунок 5. Поведенческие и молекулярные анализы. (A) 2-пробные тесты с вращающимся электродом проводились через 1 и 4 месяца после инъекции плазмы. (B) Группа, получавшая плазму

показал прогрессирующее улучшение координации движений; результат был близок к показателю молодой группы в конце (вторая попытка в 3 месяца). Время работы фиктивной группы уменьшалось с возрастом. *p < 0.05;="" **р="">< 0.01.="" (c)="" в="" группе,="" получавшей="" плазму,="" повышение="" уровня="" ак="" предшествовало="" улучшению="" моторной="" функции.="" *р="">< 0.05;="" **р="">< 0,01;="" ***р="">< 0,001.="" (d)="" клетки="" головного="" мозга="" в="" субвентрикулярной="" зоне="" были="" иммуноокрашены="" на="" маркер="" нейрогенеза,="" даблкортин="">

Масштабная линейка 50 мкм. Обратите внимание, что в группе имитации площадь DCX-позитивных клеток в субвентрикулярной зоне была значительно меньше, чем у молодых мышей, тогда как площадь увеличилась у животных, получавших плазму, и осталась неизменной. (E) Измерялась площадь DCX-положительных клеток на изображении (D). *р < 0.05;="" ***р=""><>

Было показано, что АК способствует росту мышц и развитию мозга [19, 20]. В других отчетах также подчеркивались потенциальные преимущества АА впротив старения[21, 22]. Настоящее исследование согласуется с этими выводами, но его объем был ограничен установлением коррелятивной связи между уровнями АА ипротив старенияфенотипы. Однако серийный мониторинг АК показал, что повышение уровня АК у мышей, получавших плазму, скорее всего, происходило из эндогенных источников, а не из перелитой плазмы. Более того, устойчивыйпротив старенияэффекты наблюдались у мышей-реципиентов даже через 4 месяца после окончания лечения плазмой. Улучшились моторное обучение и функции памяти; в головном мозге увеличилось количество клеток-предшественников нейронов. Эти наблюдения убедительно свидетельствуют о физиологических изменениях у мышей, получавших плазму; точный механизм еще предстоит выяснить.

Некоторые другие ограничения этого исследования должны быть рассмотрены в будущих исследованиях. Во-первых, анализ cMES необходимо уточнить для повышения точности. В частности, из-за отсутствия истинно отрицательных образцов (т. е. образцов крови без каких-либо эндогенных АК) было трудно учесть сигналы от неспецифического связывания. Возможно, эффект матриц крови может быть незначительным, поскольку мы разбавляли образцы в 100-кратном размере. Такое предположение, однако, должно быть подтверждено с использованием образцов плазмы с делецией AA, которые могут быть получены из мышиной модели с дефицитом AA [23] или путем иммунодеплеции AA. Во-вторых, мы сосредоточились на обнаружении одного метаболита в метаболизме АК для простоты, но этот подход может игнорировать биологический контекст, такой как взаимодействие между метаболитами в данном пути. Включение панели метаболитов позволит лучше фиксировать метаболические нарушения, а также повысить точность диагностики. cMES можно легко масштабировать для обнаружения различных маркеров при использовании небольших количеств образцов. В-третьих, интерполяция текущих результатов на людей будет сложной задачей. Хотя мыши и люди имеют схожие метаболические пути, скорость метаболизма у мышей в 7-раз выше, чем у людей [24]. Необходимы испытания на людях, чтобы определить оптимальные дозы плазмы для инфузии и установить базовые уровни для биомаркеров; основанные на исследованиях на животных, мы планируем такие исследования на людях. Эти усилия ускорят развитиепротив старениятерапии, улучшая качество жизни отдельных людей, а также уменьшая общественное бремя.

Методы

Экспериментальная дизайн

Плазму отделяли от пуповинной крови человека, собранной при родах. Плазму пуповинной крови вводили путем внутривенной инфузии старым мышам (18-месячного возраста), ложному контролю (18-месячному возрасту) и молодым мышам (3-месячному возрасту как положительные контроль) вводили физиологический раствор. Через 1 и 4 месяца после трансплантации были проведены 2-пробные тесты с вращающимся стержнем для оценки координации движений и долговременной памяти (рис. S1). Профиль нецелевого метаболита был выполнен в крови из трех групп, и биоинформатический анализ определилпротив старениясоответствующий путь (метаболизм арахидоновой кислоты). Биосенсор был разработан для простого и эффективного определения циркулирующей в крови арахидоновой кислоты.

Подготовка образца пуповинной крови

Пуповинная кровь человека была собрана под руководством Институционального наблюдательного совета больницы общего профиля CHA (Сеул, Корея, IRB № CHAMC-2015- 08-130-009). Пуповинная кровь человека была получена от 4 доноров и обработана антикоагулянтом цитрат-фосфат-декстроза с аденином (CPDA-1). Плазму пуповинной крови человека выделяли центрифугированием при 2,{6}} g в течение 15 мин при комнатной температуре. Образцы изолированной плазмы хранили при температуре -80 градусов и использовали с одним циклом замораживания-оттаивания при комнатной температуре.

Эксперименты на животных

Протоколы животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета CHA (IACUC). Мы использовали 18-самок мышей C57BL/6 месячного возраста для оценки метаболических нарушений и поведенческих фенотипов, которые коррелируют со старением ипротив старения. В качестве положительного контроля использовали самок мышей C57BL/6 3-месячного возраста. Всех мышей разводили при комнатной температуре в стандартном 12-часовом цикле свет-темнота. Взрослым мышам плазму пуповинной крови или физиологический раствор (130 мкл) вводили внутривенно 12 раз в течение 4 недель. Выделенную плазму пуповинной крови человека не объединяли, и данное животное получало плазму пуповинной крови от одного и того же донора. Количество животных, используемых в каждом эксперименте, описано в соответствующих разделах метода. Плазму собирали центрифугированием (3,000 г, 15 мин при комнатной температуре).

Получение метаболитов и анализ данных

Для профилирования переносимых кровью метаболитов кровь собирали у мышей путем пункции сердца в определенные моменты времени: молодая группа (3-месячный возраст, n=10), ложная группа ({{ 4}}месячный возраст, n=10; 23-месячный возраст, n=12), группа, получавшая плазму (20-месячный возраст, n {{13 }}; 23-месячный возраст, n=5). Образцы крови анализировали с использованием системы жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) (Agilent). Мы преобразовали файлы ЖХ/МС в стандартный формат mzXML (ProteoWizard) [25], а затем обработали их с помощью MAIT (набор инструментов для автоматической идентификации метаболитов) [26] для обнаружения признаков, статистического анализа и идентификации метаболитов. Статистически значимые признаки (т.е. ионизированные и/или фрагментированные метаболиты) идентифицировали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA). Эти характеристики были сопоставлены со всеми возможными предполагаемыми метаболитами в базе данных метаболомов [9] на основе соотношения массы и заряда масс-спектрального иона (допуск m/z 0.005). Мы охарактеризовали глобальные изменения метаболитов с помощью иерархического кластерного анализа и неотъемлемых структур данных метаболомики с помощью анализа основных компонентов (PCA). Два или три технических повтора (гарантирующих, что технические вариации намного меньше биологических вариаций) на мышь были включены в неконтролируемое обучение, такое как PCA и иерархическая кластеризация. Иерархическая кластеризация по основным компонентам (HCPC) выполнялась с помощью пакета R FactoMineR [27]. Для функционального анализа наиболее вероятные метаболические пути, нарушаемые старением и обработкой плазмой, определяли с помощью анализа путей KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. Гипергеометрическое распределение использовалось для измерения чрезмерного представительства соответствующих метаболитов в конкретных путях KEGG.

Приготовление иммуномагнитных шариков

Магнитные шарики (5 мг), покрытые эпоксидными группами (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen), суспендировали в 100 мкл 0,1 М раствора фосфата натрия. Добавляли сто микрограммов антител против арахидоновой кислоты (Biomatik) и тщательно перемешивали. Добавляли сто микролитров 3 М раствора сульфата аммония и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем дополнительно инкубировали при 4 градусах в течение ночи с медленным вращением при наклоне. Реакцию конъюгации проводили при рН=7.4. Эти процессы индуцируют образование ковалентной связи между эпоксидными (гранулами) и аминными (антитело) группами, что мы ранее подтвердили, подвергая конъюгаты антитело-гранулы воздействию рН [29]. В среднем на одну гранулу иммобилизовали 2,4×104 антител. Магнитные шарики, конъюгированные с антителами, разделяли с помощью постоянного магнита, дважды промывали раствором PBS и ресуспендировали в 200 мкл PBS с 1% BSA. Бусины хранились при 4 градусах до одного месяца.

Конъюгация HRP с арахидоновой кислотой

Затем HRP конъюгировали с BSA с помощью химии восстановительного аминирования. В частности, 100 мкг АК, конъюгированной с БСА (RPU51089, Biomatik), растворяли в 0,5 мл 0,2 М карбонатно-биокарбонатного буфера (pH 9,4) и добавляли к 1 мг лиофилизированного EZ-link. Плюс активированную пероксидазу (Thermo Scientific) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мкл цианоборгидрида натрия (Thermo Scientific) и смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Наконец, добавляли 20 мкл буфера для гашения (Thermo Scientific) с последующей 15-минутной инкубацией при комнатной температуре. Гель-электрофорез и анализ белковых полос подтвердили конъюгацию HPR с BSA-AA (рис. S3a). Конъюгированную с HRP АК собирали и концентрировали с помощью центробежного фильтра Amicon Ultra 100K (Millipore). Оставшуюся пероксидазу и БСА-АА четыре раза отмывали PBS.

Электрохимическое обнаружение АК в образцах плазмы

Для электрохимического выявления АА брали кровь у молодых (n {{0}}), ложных (n=8) и обработанных плазмой групп (n=5 в течение 1 мес. и n=5 на 3 месяца). Образцы плазмы мыши (0,5 мкл) разводили в 50 мкл 1-процентного раствора BSA в PBS (×100-кратное разведение) и смешивали с раствором иммуномагнитных шариков (50 мкл) и раствором АК, конъюгированным с HRP. (50 мкл). Количество AA-HRP было достаточно большим, чтобы насытить сайты связывания в магнитных шариках. Мы использовали около 8,4×107 шариков на тест, что сделало доступным 2,0×1012 сайтов связывания AA. Количество AA-HRP составляло ~1,7×1013; соотношение между AA-HRP и сайтами связывания составляло ~8:1. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с медленным вращением при наклоне. Контрольный шарик готовили путем смешивания 1% BSA в PBS (50 мкл) с раствором иммуномагнитных шариков (50 мкл) и раствором АК, конъюгированным с HRP (50 мкл). Все прореагировавшие гранулы отделяли постоянным магнитом и дважды промывали 80 мкл PBS (1% BSA). Наконец, шарики ресуспендировали в 7 мкл PBS. Приготовленный раствор шариков и 20 мкл раствора ТМБ (Biomatik) загружали поверх электрода. Через 6 мин начинали измерение хроноамперометрии. Мы использовали миниатюрный электрохимический датчик (прототип системы, разработанный AcurreHealth Inc.). Текущие уровни в диапазоне 40-45 с были усреднены. Мы использовали коэффициент пересчета (×100), чтобы сообщить предполагаемые исходные концентрации АК в плазме.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Эксперименты ELISA проводили с использованием набора ELISA для мышиной арахидоновой кислоты (АК) (Biomatik) в соответствии с инструкциями производителя. В каждую лунку добавляли серийно разбавленную АК и инкубировали с АК, конъюгированной с ПХ, при 37°С в течение 40 мин. После четырехкратной промывки промывочным буфером добавляли раствор ТМБ и инкубировали в течение 20 мин. Развитие окраски останавливали добавлением стоп-раствора. Поглощение считывали при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов (Tecan).

Ротарод тест

Мы модифицировали тест Ротарода Kong et al. [30] для оценки двигательной координации. Ротарод со стержнем диаметром 3-см начинался с 4 об/мин и ускорялся на 4 об/мин за 30 секунд в течение 5 мин. Мышей помещали на стержень и измеряли время, за которое мыши падали со стержня. Каждой мыши давали 3 испытания в день, и время работы каждого дня рассчитывали как среднее время обучения. Первый тест с вращающимся стержнем был проведен через 1-месяцев после лечения плазмой: группа молодых людей (n=29), группа имитации (n=17), группа, получавшая плазму (n {{ 11}}). Повторное обучение было начато через 4-месяцев после лечения плазмой. Во избежание перетренированности в течение 2 дней проводилась переподготовка. Остальные процедуры были такими же, как и на первом сеансе.

Визуализация ткани головного мозга

Через 1 месяц (n=4) и 4 месяца (n=3) после инъекции плазмы пуповинной крови человека или инъекции физиологического раствора животных подвергали эвтаназии, а затем перфузировали 4-процентным параформальдегидом (PFA) и PBS через левый желудочек. Молодые (n=5) и ложные группы (n=4) использовались в качестве контроля. Их мозги были

экстрагированы и криозащищены. Каждый мозг был срезан на криотоме толщиной 30 мкм. К

выполнить иммуногистохимию, неспецифическое связывание блокировали 5-процентной нормальной козьей сывороткой в ​​0,3-процентном тритоне X-100 в течение 40 мин. Первичное антитело против даблкортина (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) наносили на ночь при 4°С, а затем для промывки использовали PBS [31]. Для обнаружения DCX использовали вторичное антитело Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008). Изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse 80i) и проанализированы с помощью Image J [32].

статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием базовых функций R и lme4, пакета R для линейного

Модели смешанных эффектов или обобщенная линейная модель

(GLM) с последующим апостериорным тестом LSD [33]. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка, а значение ap < 0,05="" считалось="">

Дополнительный материал

Дополнительные фигуры.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Благодарности

Мы благодарим AccureHealth Inc. за предоставление миниатюрного электрохимического датчика. Это исследование было частично поддержано грантом Института развития информационных и коммуникационных технологий (IITP), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Конкурирующие интересы

Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.