Открытие новых ингибиторов STING на основе структуры мышиного агониста STING DMXAA
Nov 27, 2023
Абстрактный:
Белок-стимулятор гена интерферона (STING) участвует во врожденном иммунитете. Препарат DMXAA (5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота) оказался мощным агонистом мышиного STING (mSTING), но мало влиял на человеческий STING (hSTING). В этой статье мы опираемся на сравнение различных кристаллических структур и анализ взаимосвязей между белками и лигандами, чтобы выдвинуть гипотезу о том, что дизайн лекарств на основе вариантов DMXAA потенциально может превращать агонисты STING в ингибиторы. Основываясь на нашем предыдущем открытии двух аналогов DMXAA, 3 и 4 (оба могут связываться со STING), мы структурно оптимизировали их и синтезировали новые производные соответственно. В анализах связывания мы обнаружили, что соединения 11 и 27 представляют собой связывающие вещества STING, которые превосходят исходные структуры, и обсудили взаимосвязь структура-активность. Все целевые соединения были неактивны в клеточных анализах для скрининга агонистической активности STING. К счастью, мы идентифицировали 11 и 27 как ингибиторы STING с микромолярной активностью как в путях hSTING, так и в mSTING. Кроме того, 11 и 27 ингибировали индукцию интерферона и воспалительных цитокинов, активируемых 20 3 0 -cGAMP, без явной цитотоксичности. Эти результаты разрушают стереотипное представление о том, что DMXAA обеспечивает структурную основу специально для агонистов STING, и открывают больше возможностей для разработки новых агонистов или ингибиторов STING.
цистанхе трубчатой – улучшает иммунную систему
Ключевые слова:
СТИНГ; ДМХАА; видовая избирательность; агонист STING; Ингибитор STING
1. Введение
Ген-стимулятор интерферона (STING) является важной сигнальной молекулой внутреннего иммунитета, в первую очередь опосредующей естественные иммунные реакции, индуцированные цитоплазматической ДНК [1]. Когда рецептор ДНК циклическая гуанозин-аденозинфосфатсинтаза (cGAS) обнаруживает внутриклеточную двухцепочечную ДНК, cGAS катализирует синтез 2 0,30 -cGAMP (рис. 1), циклического динуклеотида (CDN), способного прямого связывания и активации STING в эндоплазматическом ретикулуме [2–4]. При активации STING образует агрегаты, которые рекрутируются ниже TANK-связывающей киназы 1 (TBK1) и связывают регуляторный фактор интерферона 3 (IRF3), который фосфорилирует IRF3, активирует димеры IRF3 в ядро, индуцирует экспрессию интерферона I типа (IFN) и инициирует интерфероновый иммунный ответ [1]. Многие исследования показали, что STING участвует в патогенезе множества заболеваний и что стимуляция STING вызывает эффективные иммунные реакции на патогенные инфекции и рак; однако неспособность модулировать хроническую воспалительную передачу сигналов приводит к аутоиммунным и воспалительным заболеваниям [5–8]. Из-за фундаментальной роли STING в регуляции врожденного иммунитета большое количество команд приступили к разработке агонистов или ингибиторов STING.
Рисунок 1. Типичные модуляторы STING
Исследования агонистов STING первого поколения были сосредоточены на структурной модификации аналогов CDN, чтобы обойти некоторые ограничения эндогенных CDN, такие как плохая проницаемость мембран и чувствительность к гидролизу фосфатазами [9,10]. Небольшая молекула агониста STING 5, 6-диметилксантенон-4-уксусная кислота (DMXAA), которая показала свою терапевтическую эффективность против солидных опухолей на моделях мышей, может нейтрализовать недостатки производных CDN [11]. Однако препарат не прошел клинических испытаний на людях [12]. Далее подтверждается, что DMXAA избирательно связывается с мышиным STING (mSTING), а не с человеческим STING (hSTING) [13,14], что препятствует терапевтическому потенциалу DMXAA у людей. 10-Карбоксиметил-9-акридинон (CMA) – еще один типичный мышиный агонист STING, используемый в качестве мощного индуктора IFN типа I для противовирусной терапии в начале 1970-х годов [15]. Таким образом, видовая селективность является жизненно важным фактором в разработке низкомолекулярных агонистов STING. Благодаря неустанным усилиям исследователей, в том числе diABZI, SR717, MSA02 и других, были обнаружены существенные новые скелетные агонисты hSTING [16–19].
Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы
Все больше данных показывает, что гиперактивация STING связана с аутовоспалительными и аутоиммунными заболеваниями. Необходимо ограничить чрезмерную активацию сигнального пути STING, что подчеркивает потенциальную ценность ингибиторов STING. Однако, в отличие от агонистов STING, разработка ингибиторов STING все еще находится в зачаточном состоянии, и ни один препарат-кандидат еще не вступил в клинические исследования. Известные ингибиторы STING включают два типа соединений: конкурентные антагонисты (SN-011 и Merck-18) и ковалентные ингибиторы (H151) [20–22]. Ранее идентифицированные ковалентные ингибиторы STING взаимодействуют с Cys88/91 или Cys91, который расположен в N-концевом трансмембранном домене STING вне CDN-связывающего кармана [22]. Недавно две команды последовательно сообщили о двух структурных типах антагонистов STING, которые занимают карман связывания 20 3 0 -cGAMP, чтобы ингибировать активацию 20 3 0 -cGAMP, что указывает на обоюдоострый эффект в кармане связывания CDN [20]. ,21].
Здесь мы предлагаем новую перспективу. Мы предполагаем, что нижний карман, где расположены DMXAA и CMA, способствует разработке ингибиторов STING на основе нашего глубокого анализа данных и сравнения информации о сокристаллической структуре идентифицированных белков STING. В нашем предыдущем исследовании сообщалось о серии аналогов CMA и DMXAA и идентифицировались соединения 3 и 4, которые связываются с hSTING, но со слабой клеточной эффективностью [23] (рис. 2).
Рисунок 2. Химические структуры соединений 3 и 4 с данными об их биологической активности. Значения EC50 соединений 1–4 измеряли с помощью репортерных клеток STING, а IC50 связывания измеряли с помощью наборов для конкурентного связывания STING.
В этой статье, что касается разработки ингибиторов STING для обнаружения более мощных связывающих агентов с большим количеством контактов в нижнем кармане, мы провели структурную оптимизацию для 3 и 4 соответственно. Впоследствии мы провели исследование SAR на основе анализов конкурентного связывания. При оценке биологической активности соединения 11 и 27 действовали как связывающие вещества широкого спектра действия и проявляли микромолярные уровни ингибирующей активности STING во многих зарегистрированных клетках. Что касается структуры стыковки, две молекулы соединения 11 удерживают hSTING в неактивной «открытой» конформации, тем самым конкурентно ингибируя эндогенное связывание 20 3 0 -cGAMP, что похоже на кристаллическую структуру Merck-18 и структуру стыковки. СН-011 [20,21].
2. Результаты
2.1. Стратегия разработки производных DMXAA в качестве ингибиторов STING
2.1.1. Идентификация сайтов проектирования ингибиторов STING путем сравнения различных кристаллических структур
Апо-белок лигандсвязывающего домена STING (LBD) кристаллизовался в виде симметричного димера в нелиганде, что, как было доказано, не обусловлено гель-фильтрацией и аналитическим ультрацентрифугированием [24–26]. Димер STING принимает конформацию, подобную бабочке, с сайтом связывания лиганда, расположенным на границе раздела между двумя мономерами. Во-первых, в этой статье рассматриваются инфраструктурные механизмы и механизмы активации белков hSTING и mSTING, сравниваются различия между ними, а также раскрываются некоторые интригующие открытия. Что касается структуры апо, естественная конформация обоих белков показывает, что mSTING более концентрирован, чем hSTING (рис. 3). Ши и др. применили моделирование молекулярной динамики (MD) для изучения различий между hSTING и mSTING, показав, что hSTING предпочитает открытую неактивную конформацию, а mSTING предпочитает закрыто-активную конформацию даже без связанного лиганда [27].
При связывании с 2030 -cGAMP конформационный переход hSTING происходит от открытого (апо-белок, латеральное расстояние ~57 Å) к закрытому (cGAMP-связанный белок, латеральное расстояние ~40 Å), тогда как противоположный справедливо для mSTING (от 29 Å до 40 Å). Структура apo-hSTING резко отличается от структуры apo-mSTING, но структуры комплекса STING с 20,30 -cGAMP перекрываются. DMXAA, CMA и cGAMP являются агонистами STING с различными структурными каркасами, но их конформации активации при связывании с белками mSTING также по существу одинаковы (рис. 3). Описанные выше сценарии свидетельствуют о том, что механизмы стимуляции hSTING и mSTING поразительно расходятся; конформации, активируемые STING, однако, относительно постоянны, не зависят от видовой селективности и типа основной цепи агониста (хотя они ограничены агонистами STING, которые вызывают конформационные изменения). Объемы карманов связывания различных кристаллических комплексов обычно конвергентны (~ 300 Å3, таблица S1), что является еще одним свидетельством стабильности конформации активации белка STING.
Рисунок 3. Сравнение кристаллических структур STING, связанных с апо- и соединениями. Белок mSTING представляет собой пшеницу (расстояние проверено красной линией), код PDB: 4KC0 (апо), 4LOJ (связанный с GAMP), 4LOL (связанный с DMXAA) и 4JC5 (связанный с CMA).
Во-вторых, основываясь на приведенных выше результатах конформационной стабильности активации, мы наложили сокристаллические структуры cGAMP, DMXAA, CMA, SR717 и MSA02, которые являются закрытыми конформационными агонистами STING, чтобы изучить положение различных структурных агонистов в Сайты связывания белка STING. Белковый карман можно разделить на две области: нижний карман и верхний карман, следуя распределению агонистов STING в белковом кармане (рис. 4а). За исключением агонистов mSTING DMXAA и CMA, находящихся полностью в нижнем кармане, другие агонисты могут активировать путь hSTING и располагаться в верхней области. Затем мы сопоставили взаимодействия пяти агонистов STING с аминокислотными остатками, связанными с белком STING (в пределах 5 Å от лиганда; рисунок S1), показав, что первичные аминокислоты включали R238, Y167, R232, S162, T263 и T267. (порядковый номер соответствующего остатка mSTING минус один). Последовательное сопоставление остатков с карманами показало, что T267, T263 и S162 лежат в нижнем кармане; верхний карман содержит R238, R232 и Y167 (рис. 4б). Как сообщалось, R238, Y167 и R232 необходимы для связывания агониста с STING, особенно с R238 (белок mSTING соответствует R237), мутация которого привела бы к полной потере стабилизации (связывания лиганда) [28–30]. Че и др. также выявило, что ключевой остаток R238 доминирует в связывании DMXAA, а точковые мутации (S162A/E260I) могут усиливать взаимодействие R238 с DMXAA с помощью MD-моделирования [31].
цистанхе трубчатой – улучшает иммунную систему
Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity
【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Чтобы занять белковый карман mSTING, DMXAA или CMA использовали уникальный режим связывания, при котором два низкомолекулярных агониста связываются с одним гомодимером mSTING. DMXAA прочно закрепляются в нижнем кармане за счет водородных связей между кетогруппой и боковой цепью T266 (hSTING соответствует 267), тогда как карбоксилатная группа взаимодействует с боковыми цепями R237 и T262 (рис. 5a). Взаимодействие DMXAA с R237 (единственной ключевой аминокислотой в верхнем кармане) имеет решающее значение для активности mSTING. Часто упускаемая из виду деталь заключается в том, что DMXAA может действовать только на R237 симметричных мономерных белков, например, DMXAA (молекула A), воздействуя на R237B (рис. 5а). Поскольку DMXAA находится внизу, расстояние между молекулой A и R237B составляет 3,06 Å, а расстояние до R237A превышает 5 Å (рис. 5b). Благодаря более компактному карману белка mSTING DMXAA легко взаимодействует с R237 симметричного мономера mSTING, но у DMXAA нет возможности связываться с каким-либо из R238 в конформационно открытом белке apo-hSTING (рис. 3). Следовательно, карманное положение DMXAA ухудшает стимуляцию пути hSTING. Недавно компания Merck, вдохновленная соотношением связывания DMXAA 2:1, обнаружила антагонисты STING, способные занимать карман связывания [21]. Кристаллический комплекс Merck 18 и белка hSTING показывает, что это соединение в основном расположено под белковым карманом и взаимодействует с S162, T263 и T267, все из которых соответствуют свойствам DMXAA (рис. 5c). На основании этого были выдвинуты гипотезы: верхний карман представляет собой прекрасную полость для создания агонистов STING; нижний карман является более подходящим гнездом для ингибиторов, а структура DMXAA или CMA оптимизирована, чтобы потенциально стать антагонистом STING.
Рисунок 4. Подразделение сайтов связывания STING и распределение ключевых аминокислот. (а) Расположение двух областей в мономере STING. Нижний карман окрашен в пурпурный цвет, а верхний — в зеленый. Коды PDB для перекрывающихся кристаллических комплексов следующие: 4LOH (cGAMP, зеленый), 6UKV (MSA-02, желтый), 6XNP (SR717, оранжевый), 4LOL (DMXAA, пурпурный) и 4JC5 (CMA, оранжевый). фиолетовый). (б) Распределение ключевых аминокислот в верхней и нижней областях. Остатки в нижнем кармане показаны пурпурным цветом, а зеленые — в верхней области.
Рис. 5. Кристаллические комплексы DMXAA и Merck 18. (а) Межмолекулярные контакты в комплексе DMXAA и mSTING. Связанный DMXAA показан серым цветом, а отдельные субъединицы STING в симметричном димере показаны зеленым и фиолетовым цветом. Верхние индексы A и B указывают на идентичность мономера белка или индивидуального лиганда. (б) Расстояния между ключевыми остатками R237A и R237B соответственно и DMXAA (молекула А). R237A по отношению к карбоксилу DMXAA составляет 6,02 Å, R237B по отношению к карбоксилу DMXAA составляет 3,06 Å. (в) Кристаллическая структура Merck 18, связанного с белком hSTING (PDB 6MXE), и детали его межмолекулярных контактов. Связанный лиганд показан серым цветом, а отдельные субъединицы STING в симметричном димере показаны зеленым и фиолетовым цветом. Верхние индексы A и B указывают на идентичность мономера белка или индивидуального лиганда.
Рисунок 6. Основа исследования и наши оптимизированные точки доступа для производных DMXAA и CMA. ( а ) Суперпозиция структуры DMXAA, связанной с mSTING (PDB: 4LOL, показана темно-синим цветом) со структурой DMXAA, связанной с hSTING S162A/G230I/Q266I (PDB: 4QXR, показана оранжевым цветом). (б) Подробности о DMXAA, связанном с мутировавшим hSTING (PDB: 4QXR). Пунктирные линии обозначают потенциальные места модификации. Аминоостатки, показанные зеленым цветом, представляют собой мутированные остатки (S162A/Q266I).
Мы обнаружили, что неспособность DMXAA активировать путь хостинга связана с расположением DMXAA в нижнем кармане (согласно разделу 2.1.1), что также дало нам идею дизайна ингибиторов STING: увеличение контактов производных DMXAA с нижней областью посредством структурных модификаций, чтобы сохранить STING в неактивированной конформации. S162 и Q266 расположены соответственно внизу сайта связывания, поэтому DMXAA могут быть удобно расположены в прямом контакте с обоими, что облегчает исследование влияния аминокислот нижнего кармана на лиганды. Анализ взаимосвязей структура-активность (SAR) показал, что 5,6-диметильный фрагмент и метокси-положение C7- имеют решающее значение для биологической активности 3 и 4. Как показано на рисунке 6b, 5 ,6-диметиловая группа создает гидрофобные взаимодействия с несколькими аминокислотами в нижнем кармане; из-за близости положения C7 DMXAA к аминокислоте Q266 соответствующая метокси-модификация позволила 3 и 4 связываться с хозяином. Поэтому наши структурные разработки предполагали блокирование 5,6-диметила и метокси C7, а разработка новых производных была сосредоточена на модификации полярной группы в положении C1/C2 (влияя на S162) и изменении группы карбоновой кислоты ( расширение структурного разнообразия). Мы разработали и синтезировали ряд производных, используя соединения 3 и 4 в качестве каркасов, тем самым подтвердив предложенную нами гипотезу об ингибиторе.
2.2. Химия
Получение всех промежуточных и целевых соединений представлено на схеме 1. 1-метокси-2,3-диметил-4-нитробензол (5) и 2-бромбензойная кислота ( 7) были коммерчески доступны. Первоначально 1-метокси-2,3-диметил-4-нитробензол превращали в 4-метокси- 2,3-диметиланилин (6) восстановлением железным порошком. Затем 6 и 7 подвергали реакции Ульмана с карбонатом калия с катализом медью и оксидом меди (I) в N,N-диметилформамиде с получением соответствующего интермедиата 8. Реакцию внутримолекулярной конденсации 8 проводили с реагентом Итона с получением интермедиата. 2-метокси-3,4-диметилакридин-9(10H)-он (9). Последующее замещение 9 осуществляли этилбромацетатом, и потеря 1 экв. HBr давала этил 2-(2-метокси-3,4-диметил-9- оксоакридин-10(9H)-ил)ацетат (10). Наконец, этилацетат в 10 гидролизовался до карбоновой кислоты гидроксидом натрия с получением 2-(2-метокси-3,4- диметил-9-оксоакридина-10 (9H)-ил)уксусная кислота (11).
Схема 1. а. EtOH, Fe, NH4Cl; б. ДМФ, Cu, Cu2O, K2CO3; в. реактив Итона; д. BrCH2COOC2H5, NaH; е. NaOH; ф. CCl3CH(OH)2, NH2OH; г. H2SO4; час EtOH, H2O2, NaOH.
Для последующего синтеза большего количества целевых соединений необходимо сначала синтезировать соединение 2-амино-5-метокси-3,4-диметилбензойная кислота (14). 6 прореагировал с хлоралгидратом и гидроксиламином с образованием ацетамида и гидроксиамино, с промежуточным соединением (E)-2-(гидроксиламин)-N-(4-метокси-2,3-диметилфенил )ацетамид (12). Последующую реакцию перегруппировки Бекмана гидроксиамино соединения 12 проводили с серной кислотой с получением производного лактама 13. Наконец, промежуточное соединение 13 гидролизовали перекисью водорода и гидроксидом натрия в этанольном растворе с получением 14. Используя 14 в качестве исходного материала для реакции, мы далее синтезировали серию 8-метокси-9,10-диметил-6Hпирроло[3,2,1-де]акридинов-1,6( Производные 2Н)-диона с заместителями при R1 и R2. Первоначально 14 и 15–19 подвергали реакции Ульмана с карбонатом калия при катализе медью и оксидом меди(I) в N,N-диметилформамиде с получением соответствующих интермедиатов 20–24. Реакции внутримолекулярной конденсации 20–24 были проведены с реагентом Итона с получением 8-метокси-9,10-диметил-6H-пирроло[3,2,{{46} Производные }де]акридин-1,6(2H)-диона (25–29). Аналогичным образом, используя 14 в качестве исходного материала для реакции, мы дополнительно синтезировали серию 7-метокси-5,6-диметил-9-оксо-9,{{ Производные 59}}дигидроакридин-4-карбоновой кислоты с заместителями при R. Первоначально 14 и 7 или 30 подвергали реакции Ульмана с карбонатом калия при катализе медью и оксидом меди(I) в N,N-диметилформамиде с получением соответствующие промежуточные соединения 31 и 32. Реакции внутримолекулярной конденсации 31 и 32 проводили с реагентом Итона с получением 7-метокси-5,6-диметил-9-оксо-9 ,10-производные дигидроакридина-4-карбоновой кислоты (33,34). Таким образом, мы спроектировали, синтезировали и протестировали 16 аналогов акридона, структура которых представлена в таблице 1.
Таблица 1. Структуры новых аналогов настоящего исследования.
2.3. Эффективность связывания новых соединений с STING и их SAR
Эффективность связывания новых соединений с STING и их SAR. Чтобы напрямую подтвердить эффективность структурной модификации, мы сначала проверили все синтезированные соединения с помощью анализов замещения cGAMP. Помимо видовой избирательности, существует пять полиморфных у человека вариантов STING: R232 (WT, 58% популяции), HAQ (20%), H232 (13%), AQ (7%) и Q ( 2%) [32]. Поэтому мы использовали коммерческие наборы для конкурентного анализа с помощью технологии гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF) для проверки биохимической эффективности новых соединений на mSTING и различных изоформах hSTING (WT, H232 и AQ) и сравнили их с контролем. Как и ожидалось, все контрольные соединения 1–4 были связаны с mSTING; по результатам скрининга hSTING соединения 3 и 4 имели значения IC50 на микромолярном уровне.
Таблица 2. Результаты соединений с различными изоформами hSTING и анализов конкурентного связывания mSTING.
Сначала на основе соединения 3 в позицию С1/С2 вводили атом галогена или метоксигруппу (табл. 1). Соединение 27, как оптимальное производное соединения 3 (положение C1 заменено на F), имеет лучшую общую активность, чем соединение 3 (однозначная микромолярная активность во всех биохимических анализах, таблица 2). Модифицированное R1-соединение 25 обладает широким спектром связывающего действия, но не так активно, как F-замещенная или незамещенная версия. По сравнению с соединением 3, соединения (26, 28 и 29) с введенной группой C2--сайта показали разную степень снижения аффинности связывания, особенно соединение 29. Во-вторых, сохранение основной цепи соединения 4 и замена атома галогена против позиции C1/C2, мы получили соединения 35–38 (табл. 1). Эти соединения были неактивны во всех четырех анализах замещения в концентрациях до 100 мкМ, демонстрируя, что замещение атомом галогена в сайте C1/C2 недопустимо. Затем мы превратили ацетатную группу соединения 4 в карбоксильную группу (33) и ввели метокси в С2-сайт (34). К сожалению, это изменение оказалось неудачным, поскольку оба соединения остались неактивными. Научившись на нашей неудаче, мы продолжили исследование SAR производных соединения 4, переместив ацетатную группу в положение N и оставив позиции C1/C2 неизмененными. Соединение 11 демонстрирует связывание с широким спектром вариантов STING, все с IC50 ниже 20 мкМ; активность превосходит соединение 4 и сравнима с соединением 27. Кроме того, соединение 9 (нет карбоксильной группы в N-участке) и соединение 10 (N-ацетатэтил) являются синтетическими предшественниками соединения 11, которые не могут связываться со STING, что косвенно свидетельствует о Значение группы карбоновой кислоты.
2.4. Клеточная биологическая оценка
2.4.1. Скрининг in vitro новых аналогов с агонистической активностью STING
Мы систематически проверяли все соединения на агонистическую активность STING, используя репортерные клеточные линии 293T hSTING-WT, 293T-mSTING и THP1-KO-STING (предоставленные Invivo Gen). Используя клетки 293T-hSTING-R232 и клетки 293T-mSTING, мы продемонстрировали активацию пути IRF как косвенную меру индукции IFN типа I путем мониторинга активности секреторной эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP), что способствовало нашему изучению видовой избирательности соединения. Клетки THP1-KO-STING были получены из клеток THP1-Dual путем стабильного нокаута гена STING, и мы использовали клетки THP1-KO-STING, чтобы подтвердить, проявляет ли соединение функцию индукции STING-зависимых цитокинов. Мы сравнили активность агонистов STING всех целевых производных с активностью эталонных агонистов мышиного (DMXAA) и человеческого (20,30 -cGAMP) STING. Удивительно, но ни одно из синтезированных соединений не могло активировать пути hSTING или mSTING (максимальная концентрация при 200 мкМ), что серьезно противоречит результатам анализов связывания. Таким образом, наши проверенные связывающие агенты STING могут иметь потенциальный характер связывания в качестве новых антагонистов STING.
2.4.2. Скрининг in vitro связующих веществ STING с активностью ингибиторов STING
Во-первых, мы провели предварительные эксперименты: используя ковалентный ингибитор H151 в концентрации 1 мкМ в качестве положительного эталона, мы исследовали уровни его ингибирования в репортерных клеточных линиях mSTING и hSTING, совместно культивированных с различными концентрациями 20 3 0 -cGAMP, чтобы определить оптимальные условия. для скрининга ингибитора (подробности протокола см. в разделе 4.2.3). Во-вторых, мы первоначально проверяли ингибирующую активность новых соединений путем обработки предэкспериментальными методами в концентрации 100 мкМ. Мы обнаружили, что STING-связывающие соединения 11 и 27 широкого спектра действия проявляют превосходное ингибирование как в мышиных, так и в человеческих репортерных клетках STING, при этом соединения 3 и 4, а другие соединения не столь эффективны. В-третьих, мы установили градиенты концентрации для соединений 11 и 27, чтобы проверить оба значения IC50 и сравнить их с H151. Соединения 11 и 27 были активны в микромолярных концентрациях, ингибируя 20 3 0 -cGAMP-индуцированную экспрессию IFN- как в путях hSTING, так и в mSTING.
цистанхе трубчатой – улучшает иммунную систему
При значениях IC50 соединение 11 (hSTING 19,93 мкМ и mSTING 15,47 мкМ) превосходило соединение 27 (hSTING 38,75 мкМ и mSTING 30,81 мкМ) (рис. 7a). Для сравнения, значения IC50 H-151 в клетках 293T-hSTING и 293T-mSTING составляли 1,04 и 0,82 мкМ (рис. 7a), что указывает на то, что ковалентный ингибитор H-151 проявляет лучший ингибирующий эффект на STING. -зависимая передача сигналов в клеточных анализах. Для дальнейшего подтверждения ингибирующих свойств соединений 11 и 27 мы использовали другую THP-1 репортерную клеточную линию человеческих моноцитов THP1-Dual-hSTING-R232, которая использует двойную репортерную систему для сообщения об активации IRF. в качестве косвенного показателя индукции IFN типа I и активации NF-κB в качестве косвенного показателя индукции провоспалительных цитокинов. После стимуляции репортерной клеточной линии THP-1 20,30 -cGAMP мы добавили ингибиторы STING в соответствующих концентрациях для ингибирования индукции I IFN и провоспалительных цитокинов. Как и ожидалось, соединения 11, 27 и H151 значительно ингибировали запускаемую STING активацию путей IRF и NF-κB (рис. 7b). Кроме того, для исключения влияния цитотоксичности соединений на ингибирующую активность мы использовали набор CellTiter-Glo для определения клеточной активности. К счастью, соединения 11 и 27 не показали доказательств цитотоксичности в отношении клеток 293T и THP-1 при анализе жизнеспособности клеток при добавлении в концентрациях (от 5 до 100 мкМ), которые ингибируют STING, в отличие от H151, который уже продемонстрировал значительную цитотоксичность при 10 мкм (рис. 7в). Эти исследования идентифицировали соединения 11 и 27 как умеренные ингибиторы STING, нарушающие видовую чувствительность и ингибирующие двойные пути IRF и NF-κB без явной цитотоксичности.
2.5. Структурную основу активности соединения 11 исследовали методом докинга.
Механизм действия конкурентных антагонистов STING заключается в захвате сайта связывания и нарушении активационной конформации белка STING [20,21]. Специфично для hSTING, антагонисты оставляют димер hSTING в «открытой» конформации. Мы использовали стыковку Glide для определения взаимодействия между человеческим STING CTD (код идентификатора PDB 6MXE) и лучшим активным соединением 11. В стыковочной структуре два соединения 11 частично параллельны друг другу и лежат в нижней части расщелины димер hSTING (рис. 8a), фиксирующий hSTING в неактивной открытой конформации (рис. S2). Соединение 11 вызывает в основном гидрофобные взаимодействия, при этом трициклическая структура лиганда обеспечивает больший контакт с границей раздела в нижнем кармане. Как и в случае с DMXAA или CMA, карбоксильная группа образует водородную связь с боковой цепью T263, а кетогруппа образует водородную связь с боковой цепью T267. Метокси в положении C2 тесно взаимодействует с S162, что приводит к сближению лигандов друг с другом. Бис-метильные заместители не только генерируют лиганд-лигандные взаимодействия, но также удобно расположены у входа в верхний карман, что предотвращает связывание природных агонистов STING с ключевыми остатками (рис. 8b).
Рисунок 7. Связывающие STING широкого спектра действия 11 и 27 являются антагонистами STING. ( а ) Химическая структура соединений 11 и 27 и ингибирующая активность ингибиторов STING как в отношении путей m-, так и h-STING. Клетки 293T (mSTING или hSTING), предварительно обработанные различными концентрациями соединений, стимулировали 20,30 -cGAMP; ингибирование активности пути IRF косвенно измеряли по значениям оптической плотности (ОП). Для расчета IC50 соединений была построена кривая дозозависимого ингибирования. (б) Соединения 11 и 27 могут ингибировать активацию двойных путей hSTING. Репортерные клеточные линии THP1-hSTING-R232 стимулировали 20,30 -cGAMP и обрабатывали соединениями, ингибирующими индукцию IFN- (оценивая активность по относительным световым единицам (RLU) люциферазы Lucia). ) и индукция провоспалительных цитокинов (мониторинг активности SEAP, измеряемой по значениям OD). (в) Новые аналоги проявляют низкую цитотоксичность по сравнению с ковалентным ингибитором. Клетки 293T (или THP-1) инкубировали с указанной концентрацией ингибиторов в течение указанных периодов времени. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью наборов CellTiter-Glo. Представленные данные представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов. NS (нет значимого) p > 0,05, *** p < 0,001. Значения p были рассчитаны с помощью двустороннего t-критерия.
Рисунок 8. Докинг-структура соединения 11, связанного с белком STING. ( а ) Способ связывания соединения 11. Связанный лиганд показан серым цветом, а отдельные субъединицы STING в симметричном димере показаны зеленым и фиолетовым цветом. В связывающих карманах мономера STING нижняя часть окрашена в пурпурный цвет, а верхняя — в зеленый. (б) Межмолекулярные контакты соединения 11 связаны со STING. Соединение 11 и связавшиеся аминокислоты STING показаны в виде палочной модели. Межмолекулярные контакты и водородные связи показаны желтой пунктирной линией. Верхние индексы A и B указывают на идентичность мономера белка или индивидуального лиганда.
3. Обсуждение
В свете обширных сообщений о механизме и кристаллической структуре STING у нас есть возможность объяснить научную проблему, заключающуюся в том, почему DMXAA не обладает агонистической активностью STING у человека. В этом исследовании путем сравнения различных кристаллических структур STING мы получили некоторые интересные результаты: 1. Активационная конформация STING стабильна; 2. Существуют разные механизмы активации hSTING и mSTING; 3. DMXAA и CMA находятся внизу сайта связывания, что отличает их от других агонистов. Учитывая разные механизмы активации mSTING и hSTING, агонисты mSTING DMXAA или CMA, расположенные в нижнем кармане, не могут активировать hSTING, поскольку апо-hSTING имеет большую полость связывания, предотвращающую связывание лиганда с R238.
Гао и др. сообщили, что одиночные мутации (G230I, S162A и Q266I) наделяют hSTING той же чувствительностью к DMXAA, что и mSTING [33]. МД-моделирование показало, что боковой цепи мутации G230I в области век достаточно для формирования стерического барьера, предотвращающего экскрецию DMXAA, тогда как DMXAA легко выходит из hSTING WT [27]. На основании структурной модификации, соответствующей точечным мутациям hSTING (S162A/Q266I) в сайте связывания, доступны существенные аналоги DMXAA и CMA, но не мощные агонисты hSTING. Причина этого может заключаться в том, что тонкое структурное несоответствие между «естественными» и «мутировавшими» hSTING может играть решающую роль в процессе распознавания. С помощью MD-моделирования Che et al. обнаружили, что неестественно мутированные hSTING нарушают скоординированные движения молекул воды и изменяют количество воды, выбрасываемой при связывании лиганда, что более способствует восстановлению DMXAA-активации hSTING [31].
Воодушевленные открытием ингибиторов STING в нижнем сайте связывания [21], мы рискнули предположить, что DMXAA, расположенный в той же области, потенциально может трансформироваться в новые ингибиторы STING. В предыдущем исследовании мы объединили структуры DMXAA и CMA с небольшими структурными модификациями и успешно обнаружили 3 и 4, которые могут связываться с hSTING, но их слабая агонистическая активность STING не соответствует их эффективности связывания. В этой статье идея дизайна заключается в дальнейшем усилении контактов аналогов DMXAA с нижним карманом, чтобы конкурентно противостоять связыванию 20,30 -cGAMP, поэтому мы разработали и синтезировали оптимизированные структуры соединений 3 и 4.
цистанхе трубчатой – улучшает иммунную систему
Первым этапом скрининга было тестирование биохимической активности с использованием наборов для связывания нескольких вариантов STING, чтобы охарактеризовать эффективность связывания новых производных. Результаты анализов связывания доказали правильность наших направлений разработки; мы определили 11 и 27 как связывающие STING широкого спектра действия (превосходящие 3 и 4) и обсудили SAR. Для аналогов соединения 3 модификации в положении C1 значительно улучшали связывание с различными вариантами STING, тогда как соединения, модифицированные C2-, не имели эффекта. Однако соединение 4 плохо переносилось структурными модификациями C1/C2. После перемещения положения карбоновой кислоты (C4 на N) мы обнаружили лучшее связующее вещество STING 11 и определили, что группа карбоновой кислоты важна для активности. Затем мы проверили все соединения на активность на клеточном уровне, используя три линии репортерных клеток, и ни одно из целевых соединений не оказалось активным. Затем мы разработали метод скрининга ингибиторов STING и повторно проверили все новые аналоги. Связывающие агенты STING 11 и 27 проявляли микромолярную ингибирующую активность, причем данные были сопоставимы с данными анализа конкурентного связывания. Ковалентный ингибитор H151 показал несколько лучшую ингибирующую активность STING, чем 11 и 27 in vitro. Кроме того, мы дополнительно подтвердили, что 11 и 27 могут эффективно ингибировать 20,30 -cGAMP-индуцированную активацию двойных путей STING. Самое впечатляющее то, что 11 и 27 сохраняют высокий уровень жизнеспособности клеток при высоких концентрациях, что невозможно с H151. Цитотоксичность является распространенной проблемой ковалентных ингибиторов и ограничивает применение H151.
Путем докинг-анализа мы получили представление о структурной основе активности лучшего активного соединения 11. Соединение 11 полностью занимает нижний карман, удерживая hSTING в неактивной открытой конформации и, таким образом, конкурентно ингибируя связывание 20,30 -cGAMP. Структура трициклического кольца акридина является ключом к возникновению гидрофобных взаимодействий, при этом группа карбоновой кислоты и кетоновый фрагмент закрепляют соединение на дне кармана. Мы предполагаем, что метокси вызывает тесную связь с S162, слегка смыкая конформацию белка, но недостаточно, чтобы превратить ее в агонистическую конформацию. Бис-метиловая структура создает пространственную блокировку сайтов, которая усиливает взаимодействие лиганд-лиганд и препятствует проникновению агониста в верхний карман. В настоящее время нет сообщений о сокристаллических структурах mSTING и антагонистов STING, поэтому мы не можем объяснить механизм действия соединения 11 с mSTING, используя подход докинга. Однако мы предполагаем, что есть две возможности: первая заключается в том, что принцип действия идентичен принципу hSTING; во-вторых, соединение 11 удерживает mSTING в более агрегированной апо-конформации, а 20,30 -cGAMP не может проникнуть в карман, чтобы оказать агонистический эффект. Таким образом, наша тонкая структурная оптимизация более слабых агонистов STING успешно изменила биологическую функцию и открыла ингибиторы STING. Эти результаты иллюстрируют сложность карманов связывания STING и дают новую исследовательскую информацию для разработки лекарств агонистов или ингибиторов STING.
4. Материалы и методы.
4.1. Химия
Растворители и реагенты, использованные в синтезе, были получены от компании Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Структуру продуктов идентифицировали методами ЯМР 1Н и 13С (JNM-ECA-400, Япония). Молекулярные массы продуктов измеряли методом масс-спектрометрии высокого разрешения (МСВР) с ионизацией электрораспылением (ESI) в качестве режима ионизации (Agilent 1260-G6230A, Германия). ЯМР и масс-спектры соединений представлены в дополнительных материалах. Соединения 35–38 синтезированы и идентифицированы нами; Подробности см. в ранее опубликованной статье [23].
Этиловый {{0}}(2-метокси-3,4-диметил-9-оксоакридин-10 (9H)-ил)ацетат (1{ {25}}): К раствору 4-метокси{{10}},3-диметиланилина (6) (0,97 г, 6,4 ммоль) и 2-бромбензойная кислота (7) (1,29 г, 6,4 ммоль) в ДМФА (6 мл) при комнатной температуре, затем мы добавили порошкообразную медь (0.05 г), Cu2O ({{60}}.05 г) и K2CO3 ({{186}}.71 г, 5,1 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 110 ◦С в течение 12 часов. После удаления растворителей в вакууме остаток растворяли в 1 N растворе NaOH (25 мл). Сырой продукт получали осаждением при подкислении фильтрата конц. HCl. После сушки сырой продукт добавляли к реагенту Итона (5 мл) при комнатной температуре, затем смесь нагревали до 90 ◦C в течение 1 часа. Охлажденную реакционную смесь по каплям добавляли в насыщенный водный раствор NaHCO3. Осадок фильтровали для сбора грубого продукта. Очистка остатка хроматографией на колонке с силикагелем дает 9, бледно-желтое твердое вещество (0,61 г, выход 37,7%). Раствор NaH (1,43 ммоль) и 9 (0,33 г, 1,3 ммоль) в ДМФА (5 мл) при комнатной температуре перемешивали в течение 1 ч, а затем охлаждали до 5–7 ◦С. К полученной смеси добавляли этилбромацетат (0,43 г, 2,6 ммоль) и непрерывно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. После завершения реакции (ТСХ) реакционную смесь выливали в ледяную воду (15 мл). Полученные осадки отфильтровывали, сушили и затем экстрагировали хлороформом. Выпаривание растворителя давало сырой эфир, который очищали перекристаллизацией с получением желтого твердого вещества 10 (0,33 г, выход 76%). ЯМР 1H (400 МГц, ДМСО-D6) δ 8.30 (д, J=8.4 Гц, 1H), 8.08 (д, J=8.6 Гц, 1H), 7.75–7.67 (м , 1H), 7,57–7,50 (м, 1H), 7,48 (с, 1H), 5,02 (с, 2H), 4,22 (к, J=7.1 Гц, 2H), 3,96 (с, 3H) , 2,77 (с, 3H), 2,34 (с, 3H), 1,21 (т, J=7,1 Гц, 3H). ЯМР 13С (101 МГц, ДМСО-D6) δ (м.д.): 169.25, 157.87, 155.96, 147.46, 146.72, 135.46, 132.15, 130.17, 129.51, 125.88, 122.48, 119.80, 11 9.46, 95.26, 72.06, 61.28, 56.06, 14.59 , 14.34, 13.77. HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C20H21NO4: 339,3910, найдено: 340,1546. 2-(2-метокси-3,4-диметил-9-оксоакридин-10(9H)-ил)уксусная кислота (11): раствор 10 (0,37 г, 1,1 ммоль) и NaOH (0,05 г, 1,3 ммоль) в этаноле (20 мл) и воде (2 мл) нагревали до 60 ◦C в течение 1 часа. После удаления растворителей полученный остаток растворяли в воде и фильтровали. После нейтрализации фильтрата конц. HCl, смесь фильтровали, получая сырое твердое вещество, затем перекристаллизовывали из метанола, получая 11, бледно-желтый порошок (0,29 г, выход 85,7%). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 10,51 (с, 1H), 8,33 (д, J=6,9 Гц, 1H), 8,04 (д, J=8,5 Гц, 1H) ), 7,69 (с, 1H), 7,67–7,62 (м, 1H), 7,45 (т, J=6,8 Гц, 1H), 4,52 (с, 2H), 3,90 (с, 3H), 2,75 (с, 3H), 2,31 (с, 3H). ЯМР 13С (101 МГц, ДМСО-D6) δ (м.д.): 159.04, 155.63, 147.47, 146.64, 134.86, 131.52, 129.56, 128.98, 125.15, 122.85, 120.53, 119.69, 10 1,77, 96,02, 74,81, 55,69, 14,42, 13,33 . HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H17NO4: 311,3370, найдено: 312,1229.
{{0}}хлор-8-метокси-9,10-диметил-6Н-пирроло [3,2,1-де]акридин{ {9}},6(2H)-дион (25): К раствору 6-карбокси-4-метокси-2,3-диметилбензоламиния (14) (1,3 г, 6,4 ммоль) и 2-(2-бром-4-хлорфенил)уксусная кислота (15) (1,6 г, 6,4 ммоль) в ДМФ (6 мл) при комнатной температуре, затем добавляли порошкообразную Cu (0.05 г), Cu2O (0.05 г) и K2CO3 (0,71 г, 5,1 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 110 ◦С в течение 12 часов. После удаления растворителей в вакууме остаток растворяли в 1 N растворе NaOH (25 мл). Сырой продукт получали осаждением при подкислении фильтрата конц. HCl. После сушки сырой продукт добавляли к реагенту Итона (5 мл) при комнатной температуре, затем смесь нагревали до 90 ◦C в течение 1 часа. Охлажденную реакционную смесь по каплям добавляли в насыщенный водный раствор NaHCO3. Осадок фильтровали для сбора грубого продукта. Очистка остатка хроматографией на колонке с силикагелем давала 25, желтое твердое вещество (0,80 г, выход 38,6%). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 8,17 (д, J =8.1, 1,5 Гц, 1H), 7.86 (д, J=6.9 Гц, 1H), 7,51 (с, 1H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 2H), 2,49 (с, 3H), 2,27 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H14ClNO3: 327,7640, найдено: 328,0734. 4-хлор-8-метокси-9,10-диметил-6H-пирроло[3,2,1-де]акридин-1 ,6(2H)-дион (26): Синтез этого соединения аналогичен 25. 15 заменили на 2-(2-бром-5-хлорфенил)уксусную кислоту (16). Получено 0,82 г 26 в виде бледно-желтого твердого вещества с выходом 38,7%. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 7,73 (с, 1H), 7,52 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 3,71 (с, 3H), 3,64 (с, 2H), 2,36 (с, 3H), 2,13 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H14ClNO3: 327,7640, найдено: 328,0734.
{{0}}фтор-8-метокси-9,10-диметил-6H-пирроло[3,2,1-де]акридин{ {9}},6(2H)-дион (27): Синтез этого соединения аналогичен соединению 25. 15 заменен на 2-(2-бром-4-фторфенил)уксусную кислоту. (17). Мы получили темно-желтое твердое вещество 27 с 0,84 г (выход 42,1%). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 8,21 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,68 (с, 1H), 7,23 (д, J {{39}) },5 Гц, 1H), 3,88 (с, 3H), 3,81 (с, 2H), 2,53 (с, 3H), 2,30 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H14FNO3: 311,3124, найдено: 312,1030. 4-фтор-8-метокси-9,10-диметил-6H-пирроло[3,2,1-де]акридин-1 ,6(2H)-дион (28): Синтез этого соединения аналогичен синтезу 25. 15 заменили на 2-(2-бром-5-фторфенил)уксусную кислоту (18). Получали 0,81 г твердого вещества темно-желтого цвета (выход 40,5%). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСОД6) δ 7.86 (с, 1H), 7,64 (с, 1H), 7,51 (с, 1H), 3,83 (с, 3H), 3,77 (с, 2H), 2,49 (с, 3H), 2,26 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H14FNO3: 311,3124, найдено: 312,1030.
4,8-диметокси-9,10-диметил-6H-пирроло[3,2,1-де]акридин-1,6(2H )-дион (29): Синтез этого соединения аналогичен 25. 15 заменили на 2-(2-бром-5-метоксифенил)уксусную кислоту (19). {{20}}.73 г желтого твердого вещества получали с выходом 35,2%. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО D6) δ 7,93 (с, 1H), 7,61 (с, 1H), 7,47 (с, 1H), 3,84 (с, 3H), 3,81 ( с, 3H), 3,67 (с, 2H), 2,44 (с, 3H), 2,28 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C19H17NO4: 323,3480, найдено: 324,1230. 7-метокси-5,6-диметил-9-оксо-9,10-дигидроакридин-4-карбоновая кислота (33): в раствор 6-карбокси-4-метокси-2,3-диметилбензоламиния (14) (1,30 г, 6,4 ммоль) и 2-бромбензойной кислоты (7) (1,29 г, 6,4 ммоль) в ДМФА (6 мл) при комнатной температуре, затем добавляли порошкообразные Cu (0,05 г), Cu2O (0,05 г) и K2CO3 (0,71 г, 5,1 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 110 ◦С в течение 12 часов. После удаления растворителей в вакууме остаток растворяли в 1 N растворе NaOH (25 мл). Сырой продукт получали осаждением при подкислении фильтрата конц. HCl. После сушки сырой продукт добавляли к реагенту Итона (5 мл) при комнатной температуре, затем смесь нагревали до 90 ◦C в течение 1 часа. Охлажденную реакционную смесь по каплям добавляли в насыщенный водный раствор NaHCO3. Осадок фильтровали для сбора грубого продукта. Очистка остатка хроматографией на колонке с силикагелем дает 33, бледно-желтое твердое вещество (1,00 г, выход 52,7%). 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 13,00 (с, 1H), 10,28 (с, 1H), 8,01 (д, J=9,7 Гц, 1H), 7,69 (д , J=8,5 Гц, 1H), 7,48 (т, J=9,0 Гц, 1H), 7,34 (с, 1H), 3,67 (с, 3H), 2,32 (с, 3H) ), 2,10 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C17H15NO4: 297,3100, найдено: 298,1073. 2,7-диметокси-5,6-диметил-9-оксо-9,10-дигидроакридин-4-карбоновая кислота (34): Синтез этого соединения аналогичен 33. 7 заменен на 2-бром-5- метоксибензойную кислоту (30). Желтое твердое вещество дало 1,05 г с выходом 50,2%. 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-D6) δ 12,96 (с, 1H), 10,45 (с, 1H), 7,84 (с, 1H), 7,54 (с, 1H), 7,50 (с, 1H), 3,84 (с, 3H), 3,81 (с, 3H), 2,48 (с, 3H), 2,27 (с, 3H); HRMS (ESI) m/z [M+H]+ рассчитано для C18H17NO5: 327,3360, найдено: 328,1179.
4.2. Биологический анализ
Наборы для связывания мышиного STING, наборы для связывания STING WT человека, наборы для связывания AQ STING человека и наборы для связывания STING человека H232 были приобретены у Cisbio. Клетки 293T mSTING (ISG/KI-IFNb), клетки 293T hSTING-R232 (ISG/KI-IFNb), клетки THP1-KI-hSTING-R232, клетки THP1-KO-STING были приобретены у Инвивоген. Клетки 293T mSTING и клетки 293T hSTING-R232 культивировали с использованием DMEM (Gibco, Уолтем, Массачусетс, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 4,5 г/л глюкозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Aldrich), 10% FBS (Gibco), Pen-Strep (100 ед/мл-100 мкМ) (Gibco), 100 мкМ нормоцина (Invivogen, Сан-Диего, Калифорния, США) и дополненных селективными антибиотиками (Invivogen ) бластицидин (10 мкМ), гигромицин (100 мкМ) и зеоцин (100 мкМ). Клетки THP1-KO-STING и клетки THP1-KI-hSTING-R232 культивировали с использованием RPMI-1640 (Gibco), 2 мМ L-глутамина (Sigma-Aldrich), 25 мМ HEPES. (Sigma-Aldrich), 10% инактивированный нагреванием FBS (Gibco), PenStrep (100 ед/мл-100 мкМ) (Gibco), 100 мкМ нормоцина (Invivogen) и дополненный селективными антибиотиками (Invivogen) бластицидином ( 10 мкМ) и зеоцин (100 мкМ). Раствор QUANTI-Blue, QUANTI-Luc, 20, 30 -cGAMP были приобретены у Invivogen. H151 был получен от компании Beijing Innochem Science and Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай). Набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo был получен от Promega.
4.2.1. Конкурентный анализ связывания HTRF STING
В соответствии с инструкциями наборов для связывания STING в каждую лунку 384-луночного планшета последовательно добавляли следующие растворы: 5 мкл детектирующих соединений или 2 0,30 -cGAMP (положительный контроль ) с разными концентрациями или разбавителем (отрицательный контроль); 5 мкл человеческого белка, меченного STING 6His (лунку отрицательного контроля добавляли в буфер для детекции); 10 мкл лиганда STING d2 и предварительно смешанного рабочего раствора Anti 6His-Tb3+. После закрытия планшета и инкубации при комнатной температуре в течение 3 часов считывали значения флуоресценции при 665 нм и 620 нм. Соотношение двух интенсивностей флуоресценции (665 нм/620 нм) использовали для оценки связывающей способности соединений. Значения IC50 (50% ингибирующая концентрация) рассчитывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.
4.2.2. Клеточный анализ для скрининга соединений на агонистическую активность
По 180 мкл клеток 293T mSTING, клеток 293T hSTING-R232 и суспензии клеток THP1-KOSTING распределяли в 96-луночные плоскодонные планшеты с плотностью ~50000 клеток. /лунку (293T) или ~100,000 клеток/лунку (THP1). Добавляли 20 мкл физиологического раствора или физиологического раствора тестируемого соединения или 20,30 -cGAMP в качестве положительного эталона и клетки инкубировали при 37 ◦C с 5% CO2 в течение 48 часов. Затем в 96-луночный планшет с плоским дном добавляли 20 мкл супернатанта, а затем в каждую лунку добавляли по 180 мкл раствора QUANTI-Blue. Планшет инкубировали при 37 ◦C в течение 3 часов и определяли уровни SEAP (активность пути IRF) с помощью спектрофотометра при 620–655 нм.
4.2.3. Клеточный анализ для скрининга соединений на ингибирующую активность
Предварительный эксперимент: 180 мкл клеток 293T mSTING, клетки 293T hSTING-R232 (~50,000 клеток/лунку) стимулировали в течение 48 часов при 37 ◦C в Инкубатор с 5% CO2 и 10 мкл 20,30 -cGAMP (3,125 мкМ, 6,25 мкМ) и 10 мкл H151 (1.0 мкМ ). Затем в 96-луночный планшет с плоским дном добавляли 20 мкл супернатанта, а затем в каждую лунку добавляли по 180 мкл раствора QUANTI-Blue. Планшет инкубировали при 37 ◦C в течение 3 часов и определяли уровни SEAP (активность пути IRF) с помощью спектрофотометра при 620–655 нм. 180 мкл клеток 293T mSTING, суспензию клеток 293T hSTING-R232 распределяли в 96-луночные планшеты с плоским дном с плотностью ~50,000 клеток/лунку. Количество 10 мкл 2 0,30 -cGAMP (3,125 мкМ) и соединения 11 или соединения 27 (0,78 мкМ, 1,56 мкМ, 3,13 мкМ, 6,25 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) или H151 (0,08 мкМ, 0,16 мкМ, 0,31 мкМ, 0,63 мкМ, 1,25 мкМ, 2,5 мкМ, 5 мкМ) и инкубировали клетки при 37 ◦C с 5% CO2 в течение 48 часов. Затем в планшет с плоским дном 96-луночек добавляли 20 мкл супернатанта, а затем в каждую лунку добавляли по 180 мкл раствора QUANTI-Blue. Планшет инкубировали при 37 ◦C в течение 3 часов и определяли уровни SEAP (активность пути IRF) с помощью спектрофотометра при 620–655 нм. Значения IC50 рассчитывали с помощью программного обеспечения GraphPad.
4.2.4. Клеточный анализ ингибирования двойного пути развития STING
180 мкл суспензии клеток THP1-KI-hSTING-R232 распределяли по 96-луночным планшетам с плоским дном с плотностью ~100,000 клеток/лунку. Добавляли 10 мкл 20,30 -cGAMP и 10 мкл соединения 11 (20 мкМ) или соединения 27 (33 мкМ) или H151 (2 мкМ) и клетки инкубировали при 37 ◦C с 5% CO2 в течение 24 часов. Затем в 96-лунку белого (непрозрачного) планшета добавляли некоторое количество надосадочной жидкости, затем в каждую лунку добавляли раствор QUANTI-Luc или QUANTI-Blue и определяли уровни люминесценции или уровни SEAP в соответствии с инструкциями производителя. Это позволяет одновременно изучать путь регуляторного фактора IFN (IRF) путем оценки активности люциферазы Lucia и пути NF-κB путем мониторинга активности SEAP.
4.2.5. Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo
Жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки инкубировали с тремя различными концентрациями (5 мкМ, 10 мкМ, 100 мкМ) соединения 11, соединения 27 или H-151 в течение 48 часов. 100 мкл реагента CellTiter-Glo добавляли в 96-луночный аналитический планшет на 10 минут, затем регистрировали люминесценцию.
4.3. Молекулярный докинг соединения 11
Кристаллическая структура комплекса STING (идентификатор PDB: 6MXE) была взята из записи в банке данных белков и использована в качестве отправной точки. Белок был приготовлен с использованием препарата Maestro Protein и разделен на цепь A и цепь B. Мы создали сайт связывания в LBD мономера STING на основе исходного лиганда (Merck-18) с использованием Receptor Grid Generation. Мы использовали точность SP Glide-стыковки для части молекулярной стыковки, что позволило соединению 11 генерировать не более 20 поз. В конечном итоге мы получили 16 связанных конформаций (все в нижнем кармане) и протестировали свободную энергию связывания комплексов с использованием модуля Prime MM-GBSA в программном обеспечении Шредингера. Кроме того, на основе оценки стыковки, оценки модели скольжения и оценки MMGBSA dG Bind мы выбрали оптимальную конформацию, которая получила первое место в двух случаях и третье место в одном (см. Таблицу S2). Наконец, мы объединили лучшие конформации цепей A и B, чтобы получить полную структуру стыковки.
Рекомендации
1. Абэ, Т.; Харашима, А.; Ся, Т.; Конно, Х.; Конно, К.; Моралес, А.; Ан, Дж.; Гутман, Д.; Барбер, Дж. Н. СТИНГ. Распознавание цитоплазматической ДНК запускает клеточную защиту. Мол. Ячейка 2013, 50, 5–15. [Перекрестная ссылка]
2. Ву Дж.; Сан, Л.; Чен, X.; Ду, Ф.; Ши, Х.; Чен, К.; Чен, З.Дж. Циклический GMP-AMP является эндогенным вторым посредником в передаче сигналов врожденного иммунитета с помощью цитозольной ДНК. Наука 2013, 339, 826–830. [Перекрестная ссылка]
3. Абэ, Т.; Барбер, GN. Цитозольно-ДНК-опосредованная, STING-зависимая индукция провоспалительных генов требует канонической активации NF-κB через TBK1. Дж. Вирол. 2014, 88, 5328–5341. [Перекрестная ссылка]
4. Цай, Х.; Чиу, Ю.-Х.; Чен, З.Дж. Путь cGAS-cGAMP-STING для восприятия и передачи сигналов цитозольной ДНК. Мол. Cell 2014, 54, 289–296. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
5. Гао, Д.; Ли, Т.; Ли, Х.-Д.; Чен, X.; Ли, К.-З.; Уайт-Картер, М.; Чен, З.Дж. Активация циклической GMP-AMP-синтазы собственной ДНК вызывает аутоиммунные заболевания. Учеб. Натл. акад. наук. США 2015, 112, E5699–E5705. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
6. Ли, Ти Джей; Ченг, Х.; Юань, Х.; Сюй, КМ; Шу, К.; Чжан, Ю.Ф.; Сюй, П.; Тан, Дж.; Руи, Ю.; Ли, PJSR Противоопухолевая активность цГАМФ посредством стимуляции врожденного иммунного ответа, опосредованного cGAS-cGAMP-STING-IRF3. наук. Отчет 2016, 6, 19049. [CrossRef] [PubMed]
7. Мотвани, М.; Песиридис, С.; Фицджеральд, К.А. Определение ДНК по пути cGAS-STING в норме и при заболеваниях. Нат. Преподобный Жене. 2019, 20, 657–674. [Перекрестная ссылка]
8. Чжан Х.; Вы, КД; Сюй, XL Нацеленный стимулятор генов интерферона (STING): перспектива медицинской химии. Дж. Мед. хим. 2020, 63, 3785–3816. [Перекрестная ссылка]
9. Гао Дж.; Тао, Дж.; Лян, В.; Чжао, М.; Ду, Х.; Кюи, С.; Дуань, Х.; Кан, Б.; Су, Х.; Цзян, З. Идентификация и характеристика фосфодиэстераз, которые специфически разрушают 30 3 0 -циклический GMP-AMP. Сотовые Рез. 2015, 25, 539–550. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
10. Корралес, Л.; МакВиртер, С.М.; Дубенский, Т.В.; Гаевский, Т.Ф. Путь STING хозяина на стыке рака и иммунитета. Дж. Клин. Расследование. 2016, 126, 2404–2411. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
11. Багули, Британская Колумбия; Чинг, Л. М. DMXAA: противососудистое средство, вызывающее множественные реакции организма-хозяина. Межд. Дж. Радиат. Онкол. Биол. Физ. 2002, 54, 1503–1511. [Перекрестная ссылка]
12. Лара, ПН; Дуйяр, Ж.-Ю.; Накагава, К.; фон Павел, Дж.; Маккидж, MJ; Альберт, И.; Лошончи, Г.; Рек, М.; Хео, Д.-С.; Фан, Х.; и другие. Рандомизированное плацебо-контролируемое исследование III фазы карбоплатина и паклитаксела с агентом, разрушающим сосуды, вадимезаном или без него (ASA404) при распространенном немелкоклеточном раке легких. Дж. Клин. Онкол. 2011, 29, 2965–2971. [Перекрестная ссылка]
13. Конлон, Дж.; Бердетт, Д.Л.; Шарма, С.; Бхат, Н.; Томпсон, М.; Цзян, З.; Ратинам, ВАК; Монкс, Б.; Джин, Т.; Сяо, ТС; и другие. Мышь, но не человеческое УЖАЛО, связывается и подает сигналы в ответ на агент, разрушающий сосуды 5, 6-диметилксантенон-4-уксусную кислоту. Дж. Иммунол. 2013, 190, 5216–5225. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
14. Ким, С.; Ли, Л.; Малига, З.; Инь, К.; Ву, Х.; Митчисон, Т.Дж. Противораковые флавоноиды являются селективными для мышей агонистами жала. АКС хим. Биол. 2013, 8, 1396–1401. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
15. Кавлар Т.; Даймлинг, Т.; Аблассер, А.; Хопфнер, К.-П.; Хорнунг, В. Видоспецифическое обнаружение противовирусного низкомолекулярного соединения CMA с помощью STING. ЭМБО Дж. 2013, 32, 1440–1450. [Перекрестная ссылка]
16. Раманджулу, Дж. М.; Песиридис, Г.С.; Ян, Дж.; Конча, Н.; Сингхаус, Р.; Чжан, С.-Ю.; Тран, Ж.-Л.; Мур, П.; Леманн, С.; Эберл, ХК; и другие. Разработка агонистов амидобензимидазольных рецепторов STING с системной активностью. Природа 2018, 564, 439–443. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
17. Чин, Э.Н.; Ю, Ц.; Вартабедян В.Ф.; Цзя, Ю.; Кумар, М.; Гамо, AM; Вернье, В.; Али, С.Х.; Киссаи, М.; Лазар, округ Колумбия; и другие. Противоопухолевая активность системного ненуклеотидного миметика цГАМП, активирующего STING. Наука 2020, 369, 993–999.
18. Пан, Б.С.; Перера, ЮАР; Пьево, Ж.А.; Пресленд, Япония; Шредер, ГК; Камминг, Дж. Н.; Троттер, BW; Альтман, доктор медицины; Буевич А.В.; Кэш, Б.; и другие. Доступный для перорального применения ненуклеотидный агонист STING с противоопухолевой активностью. Наука 2020, 369, eaba6098. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
19. Сали, ТМ; Прайк, КМ; Джину, А.; Эндрю, Л.; Ирис, А.; Ребекка, Б.; Ставероски, Дж. А.; Смит, Дж. Л.; Ахмед, А.С.; Лиси, AJPP. Характеристика нового специфичного для человека агониста STING, который проявляет противовирусную активность против новых альфавирусов. ПлоС Патог. 2015, 11, е1005324. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
20. Хонг, З.; Мэй, Дж.; Ли, К.; Бай, Г.; Маймаити, М.; Хм.; Ю, В.; Сан, Л.; Чжан, Л.; Ченг, Д.; и другие. Ингибиторы STING нацелены на карман связывания циклических динуклеотидов. Учеб. Натл. акад. наук. США 2021, 118, e2105465118. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
21. Сиу, Т.; Альтман, доктор медицины; Балтус, Джорджия; Чайлдерс, М.; Эллис, Дж. М.; Гюнайдин, Х.; Хэтч, Х.; Горячий.; Джуэлл, Дж.; Лейси, Б.М.; и другие. Открытие нового конкурентного лиганда cGAMP неактивной формы STING. АКС Мед. хим. Летт. 2019, 10, 92–97. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
22. Хааг, С.М.; Гюлен, МФ; Реймонд, Л.; Гибелен, А.; Абрами, Л.; Декут, А.; Хейманн, М.; ван дер Гут, ФГ; Туркатти, Дж.; Берендт, Р.; и другие. Нацеливание на STING с помощью ковалентных низкомолекулярных ингибиторов. Природа 2018, 559, 269–273. [Перекрестная ссылка]
23. Хоу, С.; Лан, X.-J.; Ли, В.; Ян, Х.-Л.; Чанг, Ж.-Ж.; Ян, Х.-Х.; Сан, В.; Сяо, Ж.-Х.; Ли, С. Разработка, синтез и биологическая оценка аналогов акридона как новых агонистов рецепторов STING. Биоорг. хим. 2020, 95, 103556. [CrossRef] [PubMed]
24. Оуян, С.; Песня, X.; Ван, Ю.; Ру, Х.; Шоу, Н.; Цзян, Ю.; Ню, Ф.; Чжу, Ю.; Цю, В.; Парватияр, К.; и другие. Структурный анализ адаптерного белка STING выявил гидрофобный димерный интерфейс и способ циклического связывания ди-ГМФ. Иммунитет 2012, 36, 1073–1086. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
25. Шу, К.; Йи, Г.; Уоттс, Т.; Као, CC; Ли, П. Структура STING, связанного с циклическим ди-ГМФ, раскрывает механизм распознавания циклических динуклеотидов иммунной системой. Нат. Структура. Мол. Биол. 2012, 19, 722–724. [Перекрестная ссылка]
26. Хуан, Ю.-Х.; Лю, X.-Y.; Ду, Х.-Х.; Цзян, З.-Ф.; Су, Х.-Д. Структурная основа обнаружения и связывания циклического ди-ГМФ с помощью STING. Нат. Структура. Мол. Биол. 2012, 19, 728–730. [Перекрестная ссылка]
27. Ши, А.Ю.; Дамм-Ганамет, КЛ; Мирзадеган, Т. Динамические структурные различия между человеческим и мышиным укусом приводят к разной чувствительности к DMXAA. Биофиз. Дж. 2018, 114, 32–39. [Перекрестная ссылка]
28. Гао, П.; Аскано, М.; Зиллингер, Т.; Ван, В.; Дай, П.; Серганов А.А.; Гаффни, БЛ; Шуман, С.; Джонс, РА; Дэн, Л.; и другие. Структурно-функциональный анализ активации STING с помощью c[G(20,50)pA(30,50)p] и нацеливания противовирусным DMXAA. Cell 2013, 154, 748–762. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
29. Чжан, К.; Шан, Г.; Гуй, X.; Чжан, X.; Бай, X.; Чен, ZJN Структурная основа связывания STING и фосфорилирования с помощью TBK1. Природа 2019, 567, 394–398. [Перекрестная ссылка]
30. Ваврина З.; Гуттен, О.; Смола, М.; Заврель, М.; Алиакбар Тегерани, З.; Чарват, В.; Кожишек, М.; Бура, Э.; Биркуш, Г.; Рулишек, Л. Белково-лигандные взаимодействия в сайте связывания STING, исследованные с помощью рационально спроектированных одноточечных мутаций: эксперимент и теория. Биохимия 2021, 60, 607–620. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
31. Че, Х.; Ду, Х.-Х.; Цай, X.; Чжан, Дж.; Се, WJ; Длинный, ЗР; Йе, З.-Я.; Чжан, Х.; Ян, Л.; Су, Х.-Д.; и другие. Одиночные мутации изменяют структуру структурной корреляционной сети комплекса DMXAA-человеческий STING. Дж. Физ. хим. Б 2017, 121, 2073–2082. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
32. Дайнер, Э.Дж.; Бердетт, Д.Л.; Уилсон, Южная Каролина; Монро, КМ; Келленбергер, Калифорния; Хёдо, М.; Хаякава, Ю.; Хаммонд, MC; Вэнс, Р.Э. Датчик ДНК врожденного иммунитета cGAS производит неканонический циклический динуклеотид, который активирует жало человека. Cell Rep. 2013, 3, 1355–1361. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
33. Гао, П.; Зиллингер, Т.; Ван, В.; Аскано, М.; Дай, П.; Хартманн, Г.; Тушль, Т.; Дэн, Л.; Барше, В.; Патель, DJ Замены связывающего кармана и области век делают человеческое жало чувствительным к видоспецифичному препарату DMXAA. Cell Rep. 2014, 8, 1668–1676. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
34. Хван Дж.; Канг, Т.; Ли, Дж.; Цой, Б.-С.; Хан, С. Разработка, синтез и биологическая оценка C7-функционализированных производных DMXAA в качестве потенциальных агонистов STING человека. Орг. Биомол. хим. 2019, 17, 1869–1874. [Перекрестная ссылка] [PubMed]
