Фоточувствительные нанокомплексы пролекарств, обладающие химиотерапевтической функцией покоя, потенцируют иммунотерапию рака

Абстрактный

Иммунотерапия в сочетании с эффективными терапевтическими средствами, такими как химиотерапия и фотодинамическая терапия, является успешной стратегией активации противоопухолевого иммунного ответа для улучшения противоракового лечения. Однако разработка многофункциональных биоразлагаемых, биосовместимых, малотоксичных, но высокоэффективных и клинически доступных трансформированных наноиммуностимуляторов остается сложной задачей и пользуется большим спросом. В настоящей работе мы сообщаем и разрабатываем новый фотохимиотерапевтический нанопрепарат без носителя COS-BA/Ce6 NPs путем объединения трех многофункциональных компонентов: самособирающейся природной малой молекулы бетулиновой кислоты (BA), водорастворимого олигосахарида хитозана (COS), и низкотоксичный фотосенсибилизатор хлорин е6 (Ce6) для повышения противоопухолевой эффективности иммуноадъювантной иммунотерапии рака, опосредованной анти-PD-L1-. Мы показываем, что разработанные нанопрепараты обладают умной и отличительной характеристикой «спокойствия» в химиотерапевтическом эффекте с желаемой более низкой цитотоксичностью и множеством благоприятных терапевтических свойств, включая улучшенную генерацию 1 O2, индуцированную уменьшением энергетического разрыва Ce6, рН-чувствительность, хорошую биоразлагаемость и биосовместимость, обеспечивающая высокоэффективную синергетическую фотохимиотерапию. Более того, в сочетании с терапией против PD-L1 как химиотерапия на основе нано-сборок, так и химиотерапия/фотодинамическая терапия (ФДТ) могут эффективно активировать противоопухолевый иммунитет при лечении первичных или отдаленных опухолей, открывая потенциально привлекательные возможности для клинической иммунотерапии.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Иммунотерапия рака; Наноиммуностимуляторы; Химиотерапевтический покой; Про-лекарство; Самостоятельная сборка; Природная малая молекула; бетулиновая кислота; Фотодинамическая терапия

1. Введение

Иммунотерапия рака, такая как стратегия блокады иммунных контрольных точек с использованием PD-L1 или CTLA-4 для борьбы с раком путем активации иммунной системы хозяина, несомненно, произвела революцию в лечении рака1,2. К сожалению, слабый иммунный ответ и неэффективные терапевтические эффекты сильно ограничивают его клинические перспективы3,4. Недавно текущие исследования показали, что комбинация иммунотерапии с другими методами, такими как химиотерапия5, фотодинамическая терапия (ФДТ)6, фототермическая терапия (ПТТ)7 и лучевая терапия8, может эффективно запускать противоопухолевую иммуногенность, вызывая раковые клетки подвергаться иммуногенной гибели клеток ( МКБ)9, что предполагает потенциал иммунной модуляции для активации противоопухолевых иммунных ответов. Многочисленные инновационные разработки наноматериалов, основанные на этих синергических комбинациях стратегий иммунотерапии, позволили значительно улучшить противораковую активность, включая неорганические10, полимерные11 и биомиметические12 наночастицы (НЧ). Однако разработка многофункциональных биоразлагаемых, биосовместимых, малотоксичных, но высокоэффективных и клинически доступных трансформированных наноиммуностимуляторов остается серьезной проблемой и огромным спросом. Природные биологические материалы, такие как нуклеиновые кислоты13, белки12, пептиды14,15 и низкомолекулярные природные продукты16,17, благодаря присущим им преимуществам (например, биосовместимость, нетоксичность) вызвали значительный исследовательский интерес для медицинских применений. Особенно в последние годы последовательно обнаруживаются противораковые биоактивные терпеноидные природные малые молекулы (НСМ), обладающие функцией самосборки18,19. Например, бетулиновая кислота (БА), эргостерин (ЭТ) и абиетиновая кислота (АК) могут самособираться в микронные или наноструктурированные частицы. Эти NSM являются привлекательными строительными блоками для разработки противоопухолевых средств для синергической химиотерапии и ФДТ. Доказано, что они демонстрируют значительные преимущества, заключающиеся в простоте нанопроизводства, лучшей биосовместимости и биоразлагаемости, более низкой токсичности с меньшим повреждением печени и высоком синергизме в противоопухолевой терапии20e23. Это открывает многообещающие альтернативы для разработки клинически доступных переводимых наноиммуностимуляторов для синергетической иммунотерапии. Однако в целом более сильная липофильность этих NSM привела к неэффективному клеточному эндоцитозу, что ослабило их противораковую активность и ограничило их клиническую ценность для лечения рака24. Подобно обычно сообщаемым нанокомпозитам, соответствующие наносоставы NSM способствовали клеточному поглощению, усиливая химиотерапевтические эффекты, но также непреднамеренно увеличивали риск неспецифической цитотоксичности для нормальных клеток22. Поэтому вопрос о том, как максимизировать противораковую эффективность терпеноидных наноагентов NSM при минимизации их токсичности для нормальных тканей, заслуживает глубокого размышления как важнейшего вопроса в процессе синергической иммунотерапии.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Стратегии пролекарств широко применяются для улучшения поглощения клетками липофильных малых молекул за счет повышения гидрофильности25. Как правило, амфифильные препараты обладают более высокой эффективностью клеточного поглощения, чем гидрофильные или липофильные препараты26. Чем выше клеточный фагоцитоз, тем выше терапевтическая эффективность24. Таким образом, разработка молекул-пролекарств амфифильных терпеноидов NSM может стать потенциальным методом максимизации их терапевтического эффекта. Кроме того, нанопрепараты, реагирующие на стимулы к специфическому микроокружению опухоли (например, кислотная, окислительно-восстановительная чувствительность), имеют большие перспективы для контроля высвобождения лекарств, что полезно для подавления цитотоксичности химиотерапевтических препаратов27,28. Между тем, супрамолекулярная совместная сборка (например, подход переосаждения) была эффективной стратегией для получения хорошо растворимых в воде нанопрепаратов без носителя22,29, которые, как можно было ожидать, немного снижали эффективность фагоцитоза амфифильных NSM до некоторой степени, тем самым ослабляя их пре-преципитацию. спроектированная цитотоксичность. Мы предполагаем, что в дальнейшем были созданы чувствительные к стимулам и полностью гидрофильные нанопрепараты на основе пролекарства амфифильных НСМ, которые могут эффективно подавлять его неспецифическую цитотоксичность по отношению к нормальным клеткам, одновременно стимулируя высвобождение высокотоксичных амфифильных НСМ в опухолевые клетки, способствуя их покою в нормальных тканях и активация в месте опухоли. Важно выбрать подходящий водорастворимый и реагирующий на стимулы предшественник для модификации терпеноидных NSM с целью получения амфифильных молекул пролекарств. В течение многих лет хитозановые олигосахариды (COS), как продукты деградации хитозана, не только обладают хорошей растворимостью в воде и обильными группами eOH или NH2, что приводит к хорошей реакции pH, но также обладают полезной противоопухолевой активностью, усиливая иммунную функцию хозяина путем регулирования активности. иммунных клеток, таких как моноциты, макрофаги и лимфоциты30,31. Это гарантирует огромные возможности создания целевых наноиммуностимуляторов, реагирующих на стимулы, для синергетической иммунотерапии.

Здесь, исходя из вышеизложенных соображений, в нашем экспериментальном дизайне пентациклический тритерпеновый НСМ бетулиновой кислоты (БА) используется в качестве мощного противоракового агента32, COS был введен для синтеза амфифильной молекулы COS-BA для улучшения химиотерапевтического эффекта. Хлорин e6 (Ce6), широко используемый фотосенсибилизатор с очень низкой темновой токсичностью или ее отсутствием33, был использован для создания полностью водорастворимого фоточувствительного пролекарства COS-BA/Ce6 NP, не содержащего носителя, с использованием стратегии прямой совместной сборки. НЧ COS-BA/Ce6 сочетают в себе два терапевтических метода: химиотерапию и фотодинамическую терапию (ФДТ), которые могут эффективно усиливать презентацию опухолевых антигенов Т-клеткам, генерируя надежные иммунологические ответы с помощью иммунного адъюванта анти-PD-L1. вызвать высокоэффективную и синергичную противоопухолевую химиотерапию/ФДТ/иммунотерапию (Схема 1). Сконструированные наночастицы COS-BA/Ce6 продемонстрировали интеллектуальную функцию покоя с коварными химиотерапевтическими эффектами, т.е. необлученные совместно собранные наночастицы продемонстрировали заметное ингибирование цитотоксичности in vitro по сравнению с амфифильным COS-BA как против раковых, так и против нормальных клеток. Благодаря характерному pH-зависимому поведению он обладает низкой токсичностью и биобезопасностью для нормальных тканей in vivo, но высокотоксичен для опухолевой ткани из-за стимулирования высвобождения гиперактивного COS-BA в слабокислой опухолевой микросреде34. Насколько нам известно, в настоящее время о разработанных нанопрепаратах, обладающих этой химиотерапевтической функцией покоя, по-прежнему редко сообщается. Между тем, нанопрепарат обладает множеством благоприятных терапевтических свойств, таких как улучшение генерации 1 O2 за счет уменьшения энергетического разрыва (DEST) Ce6, быстрый биологический метаболизм и усиление накопления опухоли, что привело к эффективной и безопасной противоопухолевой комбинации химиотерапии и лечения ФДТ. Что еще более важно, как химиотерапия на основе NP, так и системы химиотерапии/ФДТ могут эффективно активировать противоопухолевый иммунитет, способствуя пролиферации TNF-a и IFN-g-продуцирующих CD8+ Т-клеток в первичных или отдаленных опухолях. Предлагаемый нами биоразлагаемый, биосовместимый, уникально спящий, биобезопасный и высокоэффективный фотохимиотерапевтический нанопрепарат достигает значительных системных иммунных терапевтических ответов, открывая привлекательные возможности для клинического применения при лечении отдаленного или метастатического рака.

Схема 1. ФДТ и химиотерапия совместно собранными наночастицами COS-BA/Ce6 усиливали анти-PD-L1, индуцируя системную противоопухолевую иммунотерапию. Введение водорастворимого COS позволяет эффективно усилить химиотерапевтическую активность БА (изображенного в виде полумеча), в результате чего образуется гиперактивное амфифильное пролекарство COS-BA (длинный меч). При совместной сборке с фотосенсибилизатором Ce6 (ножны) рН-чувствительные наносборки с оболочкой имели интеллектуальную и характерную функцию «спячки» с ингибированием химиотерапевтической токсичности для нормальных тканей. Но как только оно прибудет и будет стимулировано кислым (Hþ) микроокружением опухоли, будет высвобождено высокоактивное амфифильное пролекарство COS-BA, что приведет к значительной химиотерапии. Кроме того, сконструированные коасборки продемонстрировали превосходную ФДТ-активность с усиленной генерацией синглетного кислорода ( 1 O2), вызванной уменьшением энергетической щели между синглетным и триплетным возбужденными состояниями (DEST) Ce6. В сочетании с блокадой контрольных точек анти-PD-L1 высвобождение опухолеассоциированных антигенов после лечения химиотерапией/ФДТ может эффективно активировать системный противоопухолевый иммунный ответ для дистанционной иммунотерапии рака.

2. Материалы и методы

2.1. Синтез COS-BA

Бетулиновая кислота (40 мг, 0,1 ммоль), EDC (38 мг, 0,2 ммоль) и NHS (17 мг, 0,15 ммоль). ) растворяли в 3 мл N,N-диметилформамида (ДМФ). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут к смеси осторожно по каплям добавляли 96 мг водного раствора COS (1 мл) и перемешивали в течение 24 часов. Затем реакционную смесь разбавляли CH2Cl2 и повторно экстрагировали. Слой CH2Cl2 упаривали и очищали на колонке с силикагелем. Непрореагировавшую БА сначала удаляли с использованием петролейного эфира: ацетона (5:1, по объему) в качестве элюента, а затем меняли на 3:1 с получением белого COS-BA (выход: 42%), где COS был идентифицирован как димер ( п З 2). 1 H ЯМР (40{{70}} МГц, CDCl3) d: 8,98 (1H, с, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, с, H -29а), 4,60 (1H, с, H-29b), 3,18 (1H, дд, JZ 4,8, 10,8 Гц, H-3), 2,95e3,93 (8H, м, COS), 2,64 (3H, с, CH3eCOS), 0,76 (3H, с, H-24), 0,83 (3H, с, H-25), 0,90 (3H, с, H{ {69}}), 0,97 (3H, с, H-26), 0,98 (3H, с, H-27), 1,70 (3H, с, H-30). ЯМР 13С (100 МГц, CDCl3) д: 179.18 (CO, COS), 156.43 (C- 28), 150.97 (C-20), 109.03 (C-29), 78.74, 77.04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32, 44,11, 41,85, 40,59, 38,68, 38,55, 37,32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIEMS m/z: 814,5871 [M–6H] (C44H72N2O12).

2.2. Приготовление НЧ COS-BA/Ce6

Совместно собранные НЧ COS-BA/Ce6 были приготовлены методом одностадийного переосаждения. Обычно сначала смешивали 5 мл растворов Ce6 (33 ммоль/л) и 40 мл COS-BA (33 ммоль/л) в ДМСО. Затем смесь быстро вводили в 1 мл воды, содержащей 10 мл NaOH (50 ммоль/л), под воздействием ультразвука (KQ-250E, ShuMei, Куньшань, Китай). После обработки ультразвуком в течение 10 минут НЧ COS-BA/Ce6 получали центрифугированием при 13,000 об/мин (TGL-16G, Сянъи, Чанша, Китай) в течение 25 минут. Другие составы с разными соотношениями COS-BA и Ce6 были приготовлены по той же методике с постоянным молярным соотношением NaOH и Ce6 3:1.

2.3. Сотовые линии

Клеточные линии MCF-7 человека, HepG2, LO2 и мышиные 4T1, L929 предоставлены Институтом биохимии и клеточной биологии, SIBS, CAS (Китай). MCF-7, HepG2 и LO2 культивировали в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Gibco) и 1% пенициллин-стрептомициновым антибиотиком (Life Technology, США) при 37°C. 4T1 и L929 культивировали в среде Средний RMPI-1640 с тем же соотношением, что указано выше.

2.4. Исследования клеточного поглощения и эндоцитарных путей

Для исследования клеточного поглощения клетки 4T1 или LO2 инкубировали со свободными наночастицами Ce6 или COS-BA/Ce6 (эквивалентная концентрация Ce6: 1,7 мг/мл, COS-BA: 19,5 мг/мл, BA: 10) 0,8 мг/мл) в разное время. После промывания, фиксации и окрашивания DIPA (#D9542, Sigma) клетки визуализировали под флуоресцентным инвертированным микроскопом (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Чанчунь, Китай). Интенсивность флуоресценции определяли методом проточной цитометрии с использованием мини-системы Guava EasyCyte (Merck Millipore, Германия). Для количественной оценки эффективности поглощения клеточное накопление БА и COS-BA измеряли с помощью ВЭЖХ (Agilent 1200, США). Обычно клетки 4T1 обрабатывали свободным COS-BA или BA (эквивалент BA: 25 мг/мл) в течение 0,5 и 3 часов. После промывки PBS осадки клеток собирали и подвергали ультразвуковой гомогенизации (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Нинбо, Китай) для лизиса клеток. Затем COS-BA или BA экстрагировали хлороформом для анализа ВЭЖХ после лиофилизации образцов. Подвижной фазой служила вода (0,2% фосфорная кислота) и ацетонитрил со скоростью потока 1,0 мл/мин, соответствующие объемные соотношения составляли 60:40 и 15:85 (по объему) для анализа COS-BA и BA соответственно. . Длина волны обнаружения составляла 213 нм. Для исследования эндоцитарных путей наночастиц COS-BA/Ce6 клетки 4T1 высевали в планшеты с лунками 6- и инкубировали в течение 24 часов, а затем предварительно обрабатывали различными ингибиторами эндоцитоза в течение 30 минут, включая ингибитор микропиноцитоза [50 ммоль/л]. , этилизопропиламилорид (EIPA) (#N132356, Aladdin)], клатрин-опосредованный ингибитор эндоцитоза [20 ммоль/л, хлорпромазин (#C7010, Solarbio)], ингибитор кавеол-опосредованного эндоцитоза [25 ммоль/л, нистатин ( #IN0260, Solarbio)] и ингибитор закисления лизосом [50 ммоль/л, хлорохинфосфат (#C9720, Solarbio)]35. Затем клетки дополнительно культивировали с 2 мл наночастиц COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,7 мг/мл, COS-BA: 19,5 мг/мл) в течение 2 часов и визуализировали с помощью FIM (UP Optotech). Клетки, инкубированные без ингибитора эндоцитов при 37°С, использовали в качестве контроля, а при низкотемпературной инкубации (4°С) - для оценки энергозависимого эндоцитоза. При этом среднюю интенсивность флуоресценции клеток определяли также методом проточной цитометрии.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Анализ цитотоксичности

Клетки 4T1 высевали в 96-луночный планшет. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями НЧ COS-BA в течение 24 часов. После этого в лунку добавляли 10 мл красителя МТТ (#M158055, Aladdin) (5 мг/мл) и инкубировали еще 4 часа, а затем добавляли 150 мл ДМСО для растворения кристаллов формазана. . Поглощение каждой лунки при 492 нм регистрировали с помощью микропланшет-ридера. В группе облучения клетки обрабатывали препаратами в течение 4 часов, затем облучали в течение 10 минут светом 675  10 нм и инкубировали еще 20 часов. Цитотоксичность НЧ COS-BA/Ce6 (1 мг/мл Ce6 соответствует 11,5 мг/мл COS-BA и 6,4 мг/мл BA) в отношении других клеток (MCF-7, HepG2, LO2 и L929) также определялись с помощью того же МТТ-анализа, только на другой среде. Между тем, комбинированный индекс был рассчитан с помощью программного обеспечения CompuSyn 2.0 с использованием расчета по теореме Чоу Талалая36.

2.6. Модели животных

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Харбинского медицинского университета. Клетки 4T1 суспендировали в среде RMPI-1640 и подкожно вводили в правую часть спины каждой самке мыши BALB/c (18–22 г, возраст 6–7 недель).

2.7. Флуоресцентная визуализация in/ex vivo

200 мл 5% раствора глюкозы COS-BA/Ce6 NPs (эквивалент Ce6: 0,35 мг/мл, COS-BA: 4,02 мг/мл) вводили через хвостовую вену мышам с опухолями. После этого осуществляли флуоресцентную визуализацию участков опухоли в заданное время с использованием многомодельной системы визуализации животных in vivo AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Китай) с возбуждением при длине волны 630 нм. Через 24 часа после инъекции основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) и опухоль собирали для флуоресцентной визуализации ex vivo. Кроме того, были также оценены изображения флуоресценции ex vivo опухолей и крупных органов в разное время после внутривенного введения наночастиц Ce6 или COS-BA/Ce6.

2.8. Химиотерапия in vivo/ФДТ

Мышей с 4Т1-(75e100 мм3) случайным образом делят на шесть групп (n Z 5): 1) 5% раствор глюкозы; 2) Се6; 3) Се6 с облучением; 4) COS-BA (40,2 мг/кг, где BA: 22,3 мг/кг); 5) НЧ COS-BA/Ce6; 6) НЧ COS-BA/Ce6 при облучении. В каждой группе мышам вводят 200 мл наночастиц COS-BA/Ce6 (эквивалент Ce6: 3,5 мг/кг тела) через хвостовую вену в дни 0, 2 и 4. Для групп облучения - через 4 часа. после инъекции после каждого введения всех мышей анестезировали изофлураном и участки опухоли облучали светом 675  10 нм (150 мВт/см2) в течение 15 мин. Объемы опухолей и массу тела мышей регистрируют также через день. Объемы опухолей рассчитывают по формуле: ширина ВЗ2 длина/2. После 14 дней лечения опухоли вырезали и взвешивали для расчета коэффициента ингибирования опухоли (TIR) ​​по обычно используемому уравнению: TIRZ (1 образец/контроль) 100%. Где образец и контроль представляли собой среднюю массу опухоли каждой группы, получавшей лечение, и группы, получавшей 5% водный раствор глюкозы, соответственно.

2.9. Химиотерапия in vivo/ФДТ/иммунотерапия

Чтобы продемонстрировать потенциал наночастиц COS-BA/Ce6 в сочетании с иммунотерапией, была разработана двусторонняя модель опухоли путем подкожной инъекции клеток 4T1 в левый и правый фланги. Когда размеры опухолей приближались к 75e100 мм3, мышей разделили на пять групп. (1) Контроль; (2) НЧ COS-BA/Ce6 (COS-BA Z 40,2 мг/кг, где BA Z 22,3 мг/кг); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ свет; (4) НЧ COS-BA/Ce6 + анти-PDL1; (5) НЧ COS-BA/Ce6 + анти-PD-L1 + свет. В день 0 мышам внутривенно вводили 200 мл 5% раствора глюкозы (группа 1) или наночастиц COS-BA/Ce6 (Ce6 Z 3,5 мг/кг) (группы 2, 3, 4, 5). Через 4 ч после инъекции правые опухоли групп 3 и 4 облучали в течение 15 мин. Мышей анестезировали изофлураном и переворачивали на бок, чтобы не обнажить левые опухоли. Затем антитело против PD-L1 (BioXcell, номер продукта: BE0101, номер клона: 10F.9G2) вводили внутривенно мышам групп 4 и 5 в дни 2, 4 и 6 (15 мг на мышь на инъекцию). Длину и ширину каждой опухоли контролировали через день. Через 14 дней лечения собирали сыворотку крови мышей для оценки гамма-интерферона (IFN-g) (#KMC4021) и фактора некроза опухоли (TNF-a) (#BMS607-3) с помощью анализа ELISA (eBioscience ). Опухоли собирали, диссоциировали, обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов и промывали PBS путем центрифугирования. Затем клеточную суспензию окрашивали анти-CD3-FITC (#MA1-10187, клон 145-2C11, eBioscience) и анти-CD8a-PE (#12-0081-85, клон 53-6.7, электронная биология). После этого инфильтрацию цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) в правой и левой опухолях после различных обработок оценивали с помощью проточной цитометрии.

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Синтез, изготовление и характеристика НЧ COS-BA/Ce6.

В этом исследовании мы разрабатываем новое пролекарство небольшой молекулы COS-BA на основе водорастворимого олигосахарида хитозана (COS), которое может повысить химиотерапевтическую активность пентациклической тритерпеновой бетулиновой кислоты (BA) за счет улучшения поглощения клетками за счет увеличения гидрофильности. Использованный здесь COS (степень полимеризации, DP: 2e6) был получен ранее описанным нами методом30. Затем COS-BA синтезировали реакцией дегидратации-конденсации. В сочетании с анализом основных компонентов COS химическая структура COS-BA считалась модифицированной дисахаридом (DP:2) BA (вспомогательная информация, рис. S1), что было подтверждено данными 1 H-ЯМР, 13C-ЯМР и ESIeMS. (Подтверждающая информация, рис. S2eS4). Анализ репрезентативного 1 H ЯМР показал отчетливый сигнал протонов COS около 2,64–3,93 м.д. и пики C]CH2 (4,60, 4,73 м.д.) BA, демонстрируя успешный синтез COS-BA (рис. 1А). Для приготовления синергетического противоопухолевого реагента COS-BA/Ce6 NPs был использован универсальный подход переосаждения в сочетании с высокоэффективным фотосенсибилизатором Ce6. Изменяя исходные молярные соотношения, обе композиции совместной сборки COS-BA/Ce6 могут образовывать сферические наноструктуры с модулированными размерами (рис. 1B и вспомогательная информация, рис. S5). При различных соотношениях ввода COS-BA/Ce6 гидрофильные диаметры НЧ COS-BA/Ce6 составляли около 200–300 нм с отрицательным z-потенциалом. Учитывая, что НЧ, приготовленные в рецептуре 8:1, имели более низкий индекс полидисперсности (PDI, 0,143) при относительно меньшем размере (249 нм), для комбинаторного лечения также требовалось достаточное количество химиотерапевтического агента COS-BA. Поэтому для следующего исследования мы выбрали составы COS-BA/Ce6 (8:1). При этой оптимизации НЧ COS-BA/Ce6 демонстрировали узкое распределение по размерам (рис. 1C) и хорошую растворимость в воде, что указывает на их коллоидную природу (рис. 1D). Чтобы изучить причины этой успешной совместной сборки, поведение первичной самосборки свободного COS-BA было исследовано с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) (рис. 1E), что позволило предположить, что COS-BA может образовывать высокооднородную нано- сфера w168 нм, что означает, что химическая модификация COS не изменяет способность к самосборке самого BA (вспомогательная информация, рис. S6). Именно это свойство в конечном итоге способствует успешному построению сборок. Примечательно, что помимо твердой наноструктуры, подтвержденной с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), НЧ COS-BA/Ce6 показали отчетливую оболочечную структуру свободных НЧ COS-BA, а средняя толщина оболочки составляла примерно 2,35 нм. Другие физико-химические характеристики суммированы на рис. 1F. Кроме того, НЧ COS-BA/Ce6 показали отрицательный z-потенциал 5,38 мВ и гидродинамический размер w249 нм, что выше, чем полученный с помощью СЭМ (w182 нм). При этом эффективность загрузки и капсулирования Ce6 составила 8,1 и 96% соответственно, что было определено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, данные FT-IR (рис. 1G) дополнительно подтвердили эту совместную сборку, поскольку наночастицы COS-BA/Ce6 демонстрировали характерные пики C]N, CeN и C]CH Ce6, появляющиеся при 1633, 1078 и 633 см-1. , соответственно.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

3.2. Сборный механизм и формирование оболочечной конструкции

Впоследствии, чтобы лучше понять механизм совместной сборки, мы сначала исследовали процесс первичного образования НЧ. Мы обнаружили, что совместная сборка COS-BA с Ce6 может быть спонтанной, поскольку эти два вида также могут образовывать сферическую наноструктуру, даже если без обработки ультразвуком (вспомогательная информация, рис. S7), что может быть связано с отрицательным изменением свободной энергии Гиббса (DG ) в совместных сборках37. Эта спонтанная сборка также предполагает более сильное межмолекулярное взаимодействие между COS-BA и Ce6. Как правило, межмолекулярные взаимодействия в супрамолекулярных самостоятельных (или со-)сборках представляют собой нековалентную p-p-стэкинг, водородную связь и силы Ван-дер-Ваальса 38,39. Затем для этого анализа мы исследовали УФ-поглощение наночастиц COS-BA/Ce6 (рис. 1H и F), что позволило предположить наличие смещенных в красную сторону полос Соре (410 нм) и Qy (667 нм) по сравнению с свободный Ce6 (405 и 665 нм соответственно). Между тем, также можно обнаружить значительное смещенное в красную сторону характерное поглощение COS-BA, что указывает на возможную межмолекулярную укладку pp между COS-BA и Ce640. Более того, после инкубации с поверхностно-активным веществом додецилсульфатом натрия (SDS, 0,2% мас./об.) (дополнительная информация, рис. S8), наночастицы COS-BA/Ce6 показали новую сдвинутую в синий цвет полосу Qy при 641 нм и резко восстановили флуоресценцию, демонстрируя что гидрофобные взаимодействия также способствуют совместной сборке28. Поскольку эти ассоциативные нековалентные взаимодействия привели к заметному тушению флуоресценции (98,2%) в коасборках в воде (рис. 1I). В совокупности разумно полагать, что p–p-стэкинг и гидрофобные взаимодействия могут быть основными движущими силами построения коасборок. После этого, чтобы более интуитивно визуализировать процесс сборки и выявить основные причины, по которым могут образовываться НЧ с оболочечной структурой, мы выполнили упрощенную модель молекулярной динамики (МД), содержащую 16 оптимизированных молекул COS-BA и еще две молекулы Ce6 в водяном контейнере. . Первоначально мы оценили возможное взаимодействие/связывание самосборок COS-BA в течение 5 нс времени моделирования (рис. 2A и вспомогательная информация, рис. S9). Мы обнаружили, что, кроме многочисленных внутримолекулярных водородных связей во фракции COS, также можно наблюдать несколько пар межмолекулярных Н-связей между COS-BA (рис. 2B и вспомогательная информация, рис. S10), что указывает на то, что водородные связи могут быть одной из них. основных движущих сил формирования НП КОС-БА. Особенно интересно то, что при самосборке COS-BA все молекулы COS-BA образуют явно симметричную структуру (рис. 2C). Это удивительное явление побудило нас изучить возможную связь между этим свойством и образованием НЧ COSBA со структурой оболочки. Затем мы попытались расширить блоки коробки. Удивительно, но соединенные коробки, состоящие из молекул COS-BA, были расположены регулярным образом, что привело к образованию «ортогональных» полых сетчатых структур (вспомогательная информация, рис. S11). Что еще более важно, мы случайным образом рассчитали толщину молекул оболочки и обнаружили, что она соответствует ПЭМ (w2,35 нм) (рис. 2D). Эта тенденция к образованию полых сетчатых структур может быть ответственна за образование НЧ со структурой оболочки. Чтобы проверить эту идею, была смоделирована структура МД сосборок COS-BA/Ce6 (рис. 2E и вспомогательная информация, рис. S12). Подобно самосборке COS-BA, в совместных сборках также было обнаружено большое количество внутримолекулярных и межмолекулярных Н-связей (рис. 2F и вспомогательная информация, рис. S13). Кроме того, в коасборках наблюдалась возможная pp-стэкинг между C]C COS-BA и ароматическим кольцом Ce6 (рис. 2G), что согласуется с данными предыдущих УФ-исследований. После увеличения количества блоков все еще можно найти аналогичные полые сетевые структуры, только с уменьшенной регулярностью и ортогональностью (вспомогательная информация, рис. S14). Это может быть возможной причиной неоднородной морфологии НЧ COS-BA/Ce6 по сравнению с НЧ COSBA. Более того, расстояние между молекулярной оболочкой также близко к толщине оболочки (w2,35 нм) НЧ, как видно с помощью ПЭМ (рис. 2H). В совокупности мы предположили, что образование наночастиц COS-BA/Ce6 со структурой оболочки или наночастиц COS-BA в значительной степени может быть связано с этой тенденцией молекул собираться в сетчатые структуры с полой оболочкой.

Рисунок 1. Изготовление и характеристика хитозановых олигосахаридов, модифицированных бетулиновой кислотой (COS-BA), опосредованных пролекарствами, наносборками COS-BA/Ce6 NP. (А) Амплифицированные ключевые положения 1 Н ЯМР COS-BA. (B) Получение совместных наночастиц COS-BA/Ce6 с различными соотношениями COS-BA/Ce6. (C) Распределение размеров наночастиц COS-BA/Ce6 с использованием COS-BA и Ce6 (молярное соотношение 8:1) в качестве строительных блоков. (D) Растворимость в воде и эффект Тиндаля совокупностей указывают на коллоидную природу. (E) СЭМ и ПЭМ изображения свободных самосборок COS-BA и совместно собранных наночастиц COS-BA/Ce6. (F) Краткое описание физико-химических свойств НЧ COS-BA/Ce6. (G) ИК-Фурье-спектры, (H) УФ-ВИД-спектры и (I) спектры флуоресценции свободного Ce6, COS-BA и совместно собранных наночастиц COS-BA/Ce6 в воде.

Рисунок 2. Структуры (A) самосборки COS-BA и (E) совместной сборки наночастиц COS-BA/Ce6 после молекулярно-динамического (MD) моделирования в течение 5 нс с молярным соотношением структурных единиц 8: 1 (COS-BA). /Ce6, рассчитано на основе эффективности загрузки Ce6). Линейная модель использовалась для H2O, а модели-палочки представляют молекулы COS-BA или Ce6, где атомы C Ce6 отмечены фиолетовым цветом. Информация о водородных связях между молекулами COS-BA в (B) его самосборках и (F) совместных сборках COS-BA/Ce6 NP. (C) Очевидно симметричная структура молекулярного расположения COS-BA после моделирования МД. (G) Возможные молекулярные взаимодействия между COS-BA и Ce6 демонстрируют потенциальное штабелирование pp. Указанная толщина оболочечных молекул в «ортогональной» полой сетчатой ​​структуре после расширения соответствующих MD-боксов (D) свободных самосборок COSBA и (H) совместных сборок COS-BA/Ce6 NP.

3.3. Энергетический механизм усиленной генерации 1 O2

Затем мы дополнительно исследовали генерацию синглетного кислорода (1 O2), одной из критических активных форм кислорода (АФК) при ФДТ, используя DPBF (1,3-дифенилизобензофуран) в качестве зонда. После длительного облучения смесевых растворов НЧ COS-BA/Ce6 с DPBF интенсивность УФ-поглощения DPBF снизилась, что указывает на генерацию 1 O2 (рис. 3А). После сравнения с эталонным метиленовым синим (МБ) F ( 1 O2) НЧ COS-BA/Ce6 была рассчитана как 0.26, что немного выше, чем у свободного Ce6 (FZ0.19). (рис. 3Б). Как правило, энергия, поглощаемая фотосенсибилизаторами, подвергается трем путям релаксации, включая флуоресценцию, эффект нагрева посредством колебательной релаксации и генерацию АФК посредством межсистемного пересечения (ISC)41. В соответствии со значительным подавлением флуоресцентного излучения, НЧ COS-BA/Ce6 также не вызывали какого-либо нагревательного эффекта в воде (подтверждающая информация, рис. S15), что подразумевало усиленный процесс ISC после совместной сборки Ce6 с COS-BA, что привело к до улучшенного поколения 1 O2. Для дальнейшего выяснения молекулярного механизма такого эффекта мы попытались оптимизировать и рассчитать возможную одномолекулярную модель COS-BA/Ce6, состоящую из потенциальной упаковки pp, полученную в результате МД-моделирования с помощью теории функционала плотности (DFT) (рис. 3C). . Удивительно, но COS-BA/Ce6 продемонстрировал заметное смещенное в красную сторону УФ-поглощение 581,24 нм, чем у свободного Ce6 (579,30 нм), что указывает на возникновение укладки PP (рис. 3D). Хотя геометрия COS-BA/Ce6 с минимизацией энергии показала небольшие структурные различия с введенной конфигурацией MD, отличительная p-стэкировка между связями C]C или C]O COS-BA с порфиновым кольцом Ce6 все еще наблюдалась, что еще раз подтверждает, что возможно штабелирование выше p‒p. Между тем, недавно было продемонстрировано, что повышенная эффективность донорства электронов за счет p-p-укладки может облегчить процесс ISC42, в то время как скорость ISC (KISC) пропорциональна (1/DEST) 2,43. То есть более низкая энергетическая щель (DEST) фотосенсибилизатора улучшит процесс ISC, способствуя эффективной генерации АФК. Впоследствии мы рассчитываем самое низкое возбужденное синглетное состояние (S1) и триплетное состояние (T1) Ce6 и COS-BA/Ce6 (рис. 3E) соответственно. Результаты показали, что COS-BA/Ce6 показал снижение DEST на 1,1892 эВ по сравнению со свободным Ce6 (1,2001 эВ), что подтверждает усиление процесса ISC. Снижение DEST полезно для производства 1 O2, что также было подтверждено на других нанофотосенсибилизаторах44. В совокупности p-стэкинг, по-видимому, снижает DEST Ce6 после совместной сборки с COS-BA, что приводит к улучшению генерации 1 O2.

Рисунок 3. Энергетический механизм улучшенной генерации 1 O2, индуцированной НЧ COS-BA/Ce6. (А) УФ-Вид спектры фоторазложения 1,3-дифенилизобензофурана (ДФБФ) после длительного облучения НЧ COS-BA/Ce6. (B) На графиках первого порядка изменения УФ-поглощения DPBF (DOD) выход 1 O2 оценивали с использованием метиленового синего (MB) (FZ 0.52) в ДМСО в качестве эталонного соединения. (C) Структуры с минимизацией энергии возможной одномолекулярной модели COS-BA/Ce6, вид сбоку и спереди, которая была получена в соответствии с исходной молекулярной конфигурацией между Ce6 и COS-BA после моделирования MD и последующих расчетов DFT. (D) Прогнозируемые переходы спектров поглощения УФ-ВИД (вертикальные столбцы) свободного Ce6 и оптимизированная модель COS-BA/Ce6. (E) Рассчитанные энергетические уровни их нижнего возбужденного синглетного состояния (S1) и нижнего триплетного состояния (T1) соответственно, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Где DEST рассчитывался как ES1 ET1.

3.4. Характеристики покоя химиотерапии

Впоследствии, чтобы подтвердить концепцию дизайна в настоящем исследовании, согласно которой разработка амфифильной молекулы COS-BA может эффективно увеличить терапевтический эффект BA за счет улучшения поглощения клетками за счет увеличения гидрофильности и, в то же время, дальнейшего создания стимул-чувствительных и полностью гидрофильных COS-BA/Ce6. НЧ способствовали его покою в нормальных тканях и активации в опухолевых участках. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала исследовали поведение НЧ COS-BA/Ce6 при высвобождении лекарственного средства в различных буферных растворах (рис. 4А). Результаты показали, что НЧ COS-BA/Ce6 проявляют pH-зависимое поведение с кумулятивным высвобождением Ce6 88% при pH 5,6 и 57% при pH 7,4 через 24 часа соответственно. Эта особенность, вероятно, возникла в результате разрушения многочисленных водородных связей, существовавших в НЧ COS-BA/Ce6 после введения кислого Hþ45, что приводило к увеличению высвобождения Ce6 (рис. 4Б). Это было дополнительно подтверждено разборкой НЧ COS-BA/Ce6 после инкубации непосредственно в кислой среде (рис. 4C). Эта особенность, чувствительная к pH, может быть полезной для эффективной противоопухолевой терапии из-за слабокислой микросреды опухоли34. Между тем, наночастицы COS-BA/Ce6 имели лучшую стабильность, поскольку не наблюдалось значительных изменений размера или PDI после инкубации в PBS и среде для культивирования клеток 1640-RMPI в течение 10 дней (вспомогательная информация, рис. S16), что было бы важно. для их потенциального использования для дальнейших биомедицинских применений. Впоследствии были проведены дальнейшие исследования путем оценки цитотоксичности свободной липофильной БА (краевой угол q: 133,3) и амфифильной COS-BA (q: 52) (рис. 4D) с помощью стандартного анализа метилтиазолил-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Как и предполагалось, как для раковых клеток 4T1, так и для нормальных гепатоцитов LO2, отдельные COS практически не обладают противораковой активностью при относительно низких дозах. Это может быть связано с антипролиферационным действием COS, активируемым через индуцирование сигнального пути NF-kB только в высоких концентрациях (примерно на уровне миллиграммов)30. Принимая во внимание, что COS-BA демонстрирует значительно повышенную цитотоксичность с чрезвычайно низкими значениями IC50 (6,03 мг/мл для 4T1 и 9,92 мг/мл для LO2) по сравнению с показателями BA (17,63 мг/мл для 4T1 и 20,53 мг/мл для LO2), даже при тех же массовых концентрациях (рис. 4E и J). Полученные результаты показали, что модификация водорастворимого COS значительно повышает эффективность клеточного поглощения липофильной БА, что приводит к сильной противораковой активности COS-BA. Для количественной оценки эффективности поглощения непосредственно определяли накопление BA или COS-BA в клетках 4T1 с помощью ВЭЖХ (вспомогательная информация, рис. S17). Результаты ясно подтверждают, что амфифильный COS-BA демонстрирует значительно более высокое поглощение, чем свободный BA (примерно в 3,6- раза после 3 часов инкубации), демонстрируя повышенную химиотерапевтическую активность COS-BA. Вышеприведенный вывод был дополнительно подтвержден значительно улучшенной цитотоксичностью амфифильной COSBA против раковых клеток HepG2 и MCF-7 (вспомогательная информация, рис. S18), что хорошо согласуется с концепцией дизайна. После совместной сборки с Ce6 мы обнаружили, что наночастицы COS-BA/Ce6 без облучения проявляют заметное ингибирование цитотоксичности в отношении раковых клеток 4T1 по сравнению с эквивалентным COS-BA, особенно при 11,5 мг/мл, но основная активность ФДТ не затрагивается ( Рис. 4F). Чтобы более полно подтвердить это явление, мы дополнительно исследовали цитотоксичность in vitro наночастиц COS-BA/Ce6 против других раковых клеток, включая MCF-7 и HepG2. Интересно, что амфифильный COS-BA проявлял очень сильную цитотоксичность в отношении клеток MCF-7 (рис. 4G), но химиотерапевтическая активность значительно снижалась после совместной сборки с Ce6, т.е. необлученными наночастицами COS-BA/Ce6. Аналогичные результаты наблюдались и в клетках HepG2, только с небольшим снижением (рис. 4З). Для дальнейшего подтверждения приведенных выше выводов мы также оценили химиотерапевтические эффекты наносборок и COS-BA против нормальных фибробластов мышиных клеток L929 и гепатоцитов LO2 человека (рис. 4I). Результаты показали, что собранные наночастицы COS-BA/Ce6 значительно снижают уровень исходного высокотоксичного амфифильного препарата COS-BA, демонстрируя превосходную биосовместимость. Анализ цитотоксичности показал, что значения IC50 амфифильного COS-BA были значительно ниже, чем у совместно собранных наночастиц COS-BA/Ce6 независимо от раковых или нормальных клеток (рис. 4J). То есть создание полностью гидрофильных и чувствительных к стимулам нанособорок может заранее эффективно подавить высокую цитотоксичность амфифильного препарата COS-BA. Учитывая отличительную особенность pH-зависимости, кажется, что наночастицы COS-BA/Ce6 будут находиться в состоянии покоя в нормальных тканях с желаемой низкой токсичностью химиотерапии, но активны в опухолевых тканях благодаря стимулированию высвобождения высокотоксичного COS-BA в слабокислой опухоли. микросреда. В совокупности, в отличие от широко известной неофункционализации химиотерапевтических реагентов, которые обладают повышенной противораковой активностью22,23, амфифильные наноагрегаты, опосредованные COS-BA, не только демонстрируют интеллектуальную характеристику «спячки» с коварными химиотерапевтическими эффектами, но также сохраняют специализированную ФДТ-активность, демонстрируя огромный потенциал. для умной противоопухолевой терапии.

Рисунок 4 (A) Профили высвобождения Ce6 in vitro из наночастиц COS-BA/Ce6 в PBS (pH 7,4, 6,5 или 5,6), содержащем Tween 80 (0,5%, по объему) при 37 C. (B) Возможный pH-чувствительный механизм, который Hþ запускает разборку НЧ. (C) Разборка НЧ COS-BA/Ce6 после прямой инкубации в воде с pH примерно 4.0. (D) Угол контакта свободных НЧ BA, Ce6, COS-BA и COS-BA/Ce6 соответственно. (E) Клеточная цитотоксичность свободного BA, COS и амфифильного COS-BA против репрезентативных раковых клеток 4T1 и нормальных клеток LO2. Жизнеспособность раковых клеток (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 после инкубации со свободными наночастицами COS-BA, COS-BA/Ce6 с облучением или без него при указанной эквивалентной концентрации COS-BA. на 24 часа. (I) Клеточная цитотоксичность свободных COS-BA, необлученных наночастиц COS-BA/Ce6 против нормальных клеток LO2 и L929. (J) IC50-анализ COS-BA против раковых и нормальных клеток. Данные выражены как средние SD (n Z 6). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 и ***P ˂ 0,001 показывают существенные различия.

Чтобы изучить возможные причины этой характеристики покоя химиотерапии, зависимое от времени поведение клеточного поглощения наночастиц COS-BA/Ce6 было последовательно оценено путем инкубации с раковыми клетками 4T1. Результаты показали, что, хотя НЧ COS-BA/Ce6 продемонстрировали заметное тушение флуоресценции, они все же продемонстрировали повышенную фагоцитарную эффективность по сравнению со свободным Ce6 благодаря более сильной цитоплазматической красной флуоресценции, что было определено количественным анализом проточной цитометрии (рис. 5А). Эта улучшенная клеточная интернализация НЧ может быть связана с эндоцитозом21. В совокупности мы предположили, что, хотя хорошо растворимые в воде коасборки НЧ COS-BA/Ce6 (угол смачивания q: 36,7 ) демонстрируют улучшенный клеточный эндоцитоз, чем липофильный Ce6 (q: 132,6, близко к BA), снижается эффективность фагоцитоза НЧ могут появляться по сравнению с амфифильной молекулой COS-BA, что приводит к подавлению химиотерапевтической цитотоксичности НЧ COS-BA/Ce6. То есть эффективность поглощения клетками от высокой до низкой в ​​такой последовательности: амфифильный COS-BA, гидрофильный COS-BA/Ce6 NP, липофильный BA или Ce6. Что еще более важно, неадекватная разборка клеточных НЧ может быть еще одной важной причиной ослабления химиотерапевтического эффекта, все из которых могут быть связаны с «умным» химиотерапевтическим покоем НЧ COS-BA/Ce6. Кроме того, поскольку разборка НЧ специально проводилась в кислой среде опухолевых клеток, чтобы продемонстрировать способность реагировать на pH, мы дополнительно попытались сравнить эффекты поглощения НЧ COS-BA/Ce6 в нормальных клетках LO2 (рис. 5B). . Однако НЧ COS-BA/Ce6 не оказывали значительного ингибирования красной флуоресценции Ce6 в клетках LO2. Напротив, поведение поглощения LO2 было аналогично поведению раковых клеток 4T1, что позволяет предположить, что наночастицы COS-BA/Ce6 также могут разбираться даже в нормальных клетках, что может быть результатом слабокислого рН внутриклеточных компартментов (эндосом/лизосом), существующих внутри клеток. как раковые, так и нормальные клетки46. Поскольку клеточное поглощение НЧ зависит от процесса эндоцитоза, прямая инкубация препарата может не выявить рН-чувствительность НЧ COS-BA/Ce6 на клеточном уровне. Тем не менее, микроокружение опухоли (ТМО) очень кислое по сравнению с нормальными тканями47. Независимо от внутриклеточного рака или ТМЭ, наночастицы COS-BA/Ce6 могут быть чувствительными к pH и разбираться, вызывая высвобождение высокотоксичного COS-BA. В то время как в нормальных тканях НЧ COS-BA/Ce6 можно было разобрать только после попадания в нормальную клеточную среду, что снижает вероятность высвобождения COSBA. Таким образом, мы приходим к заключению, что характеристика покоя химиотерапии наночастиц COS-BA/Ce6 по отношению к микроокружению опухоли действительна и надежна, а идея дизайна в настоящем исследовании осуществима.

3.5. Противораковая эффективность химиотерапии in vitro/ФДТ наночастиц COS-BA/Ce6

Кроме того, перед детальным изучением противораковой эффективности химиотерапии/ФДТ in vitro наночастиц COS-BA/Ce6 и для дальнейшего выяснения механизма эндоцитоза мы изучаем четыре основных пути эндоцитоза, добавляя соответствующие ингибиторы эндоцитоза, включая хлорпромазин (клатрин-опосредованный), хлорохинфосфат ( ингибитор лизосомального закисления), нистатин (опосредованный кавеолами) и ингибитор макропиноцитоза EIPA (этилизопропиламилорид) (рис. 5C и D). Мы наблюдаем, что введение нистатина и хлорпромазина могло более эффективно ингибировать фагоцитарную эффективность, чем EIPA и хлорохинфосфат, демонстрируя значительное снижение клеточной флуоресценции по сравнению с нормальным 37 C. Эти результаты показали, что наночастицы COS-BA/Ce6 интернализовались несколькими механизмами, главным образом через пути эндоцитоза, опосредованные клатрином и кавеолами. Поскольку повышенная генерация 1 O2 за счет межмолекулярных взаимодействий, наночастицы COS-BA/Ce6 демонстрируют значительно больший выход межклеточных АФК, чем у Ce6, на что указывает более сильная зеленая флуоресценция зонда DCFH (рис. 5E), что подразумевает более высокую фотодинамическую эффективность. МТТ-анализы показывают, что наночастицы COS-BA/Ce6 под облучением оказывают заметно усиленное ингибирующее действие на клетки 4T1, чем эквивалентное Ce6, при этом с относительно умеренной цитотоксичностью без облучения (рис. 5F). Примечательно, что IC50 Ce6 ​​(0,53 мг/мл) в наночастицах COS-BA/Ce6 была намного ниже, чем у свободного Ce6 (1,39 мг/мл) (рис. 5G), что указывает на значительно улучшенную эффективность ФДТ, которая дополнительно продемонстрирована цитотоксичностью наночастиц COSBA/Ce6 против раковых клеток MCF-7 человека и HepG2 (вспомогательная информация, рис. S19). Аналогичным образом, по сравнению со свободным Ce6, в совместных сборках также наблюдались относительно более низкие значения IC25, IC50 и IC75 (рис. 5G). Между тем, по сравнению с одной ФДТ Ce6 и однократной химиотерапией наночастиц в темноте, наночастицы COS-BA/Ce6 под облучением достигли более эффективной комбинированной химиотерапии/ФДТ против трех вышеупомянутых раковых клеток, демонстрируя синергизм (индекс комбинации: CI ˂ 1) ( Рис. 5И). Кроме того, двойное флуоресцентное окрашивание живых/мертвых клеток с использованием кальцеин-ацетоксиметилового эфира (кальцеин-AM) и йодида пропидия (PI) дополнительно подтвердило, что наночастицы COS-BA/Ce6 могут эффективно индуцировать апоптоз и некроз клеток, поскольку обработанные клетки были практически окрашены. с красным сигналом флуоресценции PI при культивировании в течение дополнительных 10 часов после облучения (рис. 5H). Между тем, необлученные НЧ COS-BA/Ce6 (более высокая доза Ce6: 3,2 мг/мл) также обладали определенной химиотерапевтической активностью, что видно по сигналам AM и PI одновременно. Это значительно улучшенное ФДТ-активность наночастиц COS-BA/Ce6 было дополнительно подтверждено окрашиванием AM/PI после обработки в течение дополнительных 20 часов (вспомогательная информация, рис. S20). Более того, при добавлении азида натрия (SA) и D-маннита (DM), отдельно специального тушителя 1 O2 и $OH48, к клеткам 4T1, обработанным COS-BA/Ce6 NPs-PDT, очевидное увеличение жизнеспособности клеток подразумевало, что Фотореакции типа I ($OH) и типа II (1 O2) происходили одновременно в процессе ФДТ, опосредованном наночастицами COSBA/Ce6 (рис. 5J). Кроме того, наночастицы COS-BA/Ce6 особенно обладают лучшей совместимостью с кровью, о чем свидетельствует незначительный гемолиз эритроцитов (рис. 5K), что указывает на потенциал биомедицинского применения посредством внутривенного введения.

3.6. Биораспределение наночастиц COS-BA/Ce6 in vivo

Впоследствии, перед исследованием распределения in vivo, мы затем оценили фармакокинетику наночастиц COS-BA/Ce6 путем мониторинга концентрации Ce6 в крови после внутривенной инъекции эквивалентных наночастиц Ce6 или COS-BA/Ce6. Профили зависимости концентрации Ce6 от времени в крови (рис. 6A) и сравнительные фармакокинетические параметры (таблица вспомогательной информации S1) ясно подтверждают, что наночастицы COS-BA/Ce6 имеют длительную циркуляцию в кровотоке, что может способствовать большему накоплению в опухоли. места. В частности, НЧ COS-BA/Ce6 продемонстрировали быстрое выведение из крови в течение 2 часов, что указывает на благоприятную биоразлагаемость. Соответственно, затем мы исследовали in vivo биораспределение и способность к накоплению в опухоли наночастиц COS-BA/Ce6 (рис. 6B и C). Подобно общеизвестным нанокомпозитам Ce633, НЧ COS-BA/Ce6 могут быстро распределяться по всему телу. Особенно в течение первых 4 часов сборки демонстрировали явно более сильную флуоресцентную эмиссию в местах опухоли, чем свободный Ce6, что позволяет предположить улучшенное удержание и способность к накоплению, направленному на опухоль, наночастиц COS-BA/Ce6, что, вероятно, связано с эффектом пассивного сохранения повышенной проницаемости (EPR). обеспечиваемые наночастицами14. Через 6 часов после инъекции интенсивность флуоресценции в местах опухоли постепенно быстро снижалась. Примечательно, что в отличие от обычно сообщаемых нанокомпозитов со значительно повышенным накоплением опухоли по сравнению со свободным положительным препаратом29, НЧ COS-BA/Ce6 не показали очень выраженного накопления в местах опухоли через 24 часа после инъекции, чем свободный Ce6 (рис. 6C), который был дополнительно подтверждается визуализацией удаленной опухоли (рис. 6D и E). Превосходная биоразлагаемость НЧ может быть причиной появления в них небольших природных органических молекул. Это также наблюдалось с другими терпеноидами, опосредованными наносборками малых молекул49. Кроме того, НЧ COS-BA/Ce6 также показали такое же распределение в тканях, как и свободный Ce6 (рис. 6E), а средняя интенсивность флуоресценции ex vivo в целом была ниже, чем представленная in vivo, что дополнительно указывает на хорошую биоразлагаемость. Кроме того, учитывая близкую разницу в уровне флуоресценции между 2 и 4 часами после введения НЧ и Ce6, а также экспериментальную работоспособность, позволяющую обеспечить достаточные интервалы для облучения, 4 часа после введения были выбраны в качестве световой точки для последующей ФДТ-терапии.

Учитывая не очень выраженное накопление опухоли через 24 часа по сравнению со свободным Ce6, для дальнейшего подтверждения повышенного эффекта ЭПР, которым обладают наночастицы COS-BA/Ce6, мы немедленно отслеживали флуоресцентные изображения опухолей ex vivo в разное время после внутривенной инъекции нанопрепаратов ( Рис. 6F и G). Примечательно, что либо через 20 минут, либо через 12 часов после инъекции наночастицы COS-BA/Ce6 действительно демонстрировали более сильную флуоресцентную эмиссию в местах опухоли, чем свободный Ce6, демонстрируя превосходную и повышенную способность к накоплению опухоли. При этом с течением времени интенсивность флуоресценции, сохраняющаяся в опухолевой ткани, постепенно ослабевала (рис. 6Ж), что полностью согласуется с результатами флуоресцентной визуализации животных in vivo. Очевидно, что такой быстрый биологический метаболизм и усиленное накопление опухоли позволяют избежать потенциальной токсичности долгосрочного накопления, гарантируя высокоэффективную противоопухолевую терапию с большей биобезопасностью.

Рисунок 5. Противораковая эффективность in vitro наночастиц COS-BA/Ce6. Клеточная интернализация (A) раковых клеток 4T1 и (B) нормальных клеток LO2, инкубированных в свободных наночастицах Ce6 или COS-BA/Ce6 в течение 0.5 и 3 часов, и соответствующий анализ интенсивности флуоресценции проточной цитометрией. (C) Исследования ингибирования поглощения специфических эндоцитарных путей и (D) соответствующая интенсивность флуоресценции клеток, измеренная с помощью проточной цитометрии после инкубации с наночастицами COSBA/Ce6 с ингибиторами эндоцитов или без них, включая хлорпромазин, хлорохин, нистатин и этилизопропиламилорид (EIPA). Масштабные линейки Z 20 мм. (E) Генерация клеточных АФК, индуцированная свободными наночастицами Ce6 или COS-BA/Ce6 (эквивалент Ce6: 1,6 мг/мл). Масштабные линейки Z 20 мм. (F) Жизнеспособность клеток 4T1 после различных обработок в течение 24 часов. (G) Анализ IC25, IC50, IC75 свободных наночастиц Ce6 и COS-BA/Ce6 против клеток 4T1, MCF-7 и HepG2 соответственно. (H) Кальцеин-AM/йодид пропидия (PI) окрашивание живых/мертвых клеток 4T1, обработанных COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,6 мг/мл), после инкубации в течение дополнительных 10 часов, а также необлученных COS- НЧ BA/Ce6 (Ce6: 3,2 мг/мл). Масштабные линейки Z 50 мм. (I) Индекс комбинации (CI) НЧ COS-BA/Ce6 на клетках 4T1, MCF-7 и HepG2, определенный расчетом по теореме Чоу Талалая. (J) Механизмы ФДТ (тип I и тип II), индуцированные облучением наночастиц COS-BA/Ce6 и оцениваемые с помощью специфических 1 O2 и $OH тушителей азида натрия (SA) и D-маннита (DM) соответственно. (K) Процент гемолиза эритроцитов после инкубации с наночастицами COS-BA/Ce6 в течение 4 часов. Данные выражены как средние SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 и ***P ˂ 0,001 демонстрируют существенные различия.

Рисунок 6. Кровообращение и биораспределение in vivo наночастиц COS-BA/Ce6. (A) Профили концентрации и времени Ce6 в крови после внутривенных инъекций эквивалентного Ce6 или совместных наночастиц COS-BA/Ce6 (n Z 3). (B) Флуоресцентные изображения всего тела мышей с опухолями 4T1 после внутривенных инъекций указанных препаратов в различные моменты времени. (C) Средняя интенсивность флуоресценции, полученная из участков опухоли в (B). (D) Изображения флуоресценции ex vivo опухолей и основных органов, удаленных от вышеуказанных мышей через 24 часа, и соответствующий (E) количественный результат интенсивности флуоресценции (n Z 3). (F) изображения флуоресценции опухолей и основных органов ex vivo в разное время после внутривенных инъекций наночастиц Ce6 или COS-BA/Ce6 и (G) соответствующий анализ интенсивности флуоресценции опухолей. Данные выражены как средние SD (n Z 3).

3.7. Комбинаторное противоопухолевое лечение in vivo химиотерапия/ФДТ 

Учитывая уникальные характеристики покоя, хорошую биоразлагаемость и активность ФДТ, была исследована комбинированная противоопухолевая терапия in vivo химиотерапия/ФДТ. Мышей с опухолью 4Т1 случайным образом разделили на 6 групп и внутривенно вводили эквивалент Ce6 (3,5 мг/кг тела) каждые 2 дня, всего три дозы. Через 4 ч после инъекции опухолевые участки мышей в светлых группах облучали в течение 15 мин (рис. 7А). Между тем, соответствующие объемы опухолей или массы тела регистрировали через день. Через 14 дней лечения (рис. 7Б) свободный Ce6 при облучении и свободный COS-BA оказались неэффективными в подавлении опухоли, вероятно, из-за ограниченного накопления препарата в опухолевой ткани. Напротив, после облучения наночастиц COS-BA/Ce6 наблюдалось наиболее значительное ингибирование опухоли, что подтверждает превосходную эффективность комбинации химиотерапии и ФДТ. Средний вес опухоли (рис. 7D) и соответствующие фотографии рассеченных опухолей (рис. 7E) продемонстрировали лучшую противоопухолевую эффективность наночастиц COS-BA/Ce6 при облучении, поскольку у обработанных мышей наблюдались наименьшие размеры опухолей, чем у других групп. Средний коэффициент ингибирования опухоли обработанными ФДТ наночастицами COS-BA/Ce6 достиг 80,3%, что выше, чем у свободных Ce6 ФДТ (42,4%) и свободных COS-BA (38,5%). Примечательно, что хотя предыдущие исследования in vitro показали, что наночастицы COS-BA/Ce6 без света проявляют скрытую функцию химиотерапевтической активности, они по-прежнему обладают повышенной противоопухолевой эффективностью (49,5%) по сравнению со свободным COS-BA (рис. 7D). Мы предположили, что этому результату способствуют две возможные причины: одна из них - более высокое накопление в опухоли наночастиц COS-BA/Ce6 из-за широко известного эффекта ЭПР. Другим фактором является слабокислое микроокружение опухоли, стимулирующее выброс высокотоксичного COS-BA. Из-за более высокой критической концентрации мицелл (ККМ, 187 мг/мл) COS-BA (вспомогательная информация, рис. S21), он может существовать в состоянии мономера в среде опухоли, что способствует улучшенной химиотерапии необлученных COS-BA. BA/Ce6 НЧ. Кроме того, для дальнейшей проверки превосходной противораковой эффективности наночастиц COS-BA/Ce6 было проведено окрашивание опухолей гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 7G).

Рисунок 7. Исследование эффективности с использованием модели подкожного ксенотрансплантата 4T1. (A) Схематическая иллюстрация лечения ФДТ in vivo. (B) Профили роста опухоли, (C) изменения массы тела и (D) массы удаленной опухоли, содержащие коэффициенты ингибирования опухоли у мышей, несущих 4T1-, после различных обработок в указанных группах (n Z 5 для каждой группы). (E) Изображения вырезанных опухолей у репрезентативных мышей после лечения. (F) Биохимический анализ сыворотки после лечения наночастицами COS-BA/Ce6 в течение 14 дней. (G) Репрезентативное окрашивание H&E вырезанных срезов опухоли после различных обработок. Масштабные линейки Z 50 мм. (H) Окрашивание TUNEL свободных срезов опухоли Ce6 и COS-BA/Ce6 NP, обработанных ФДТ. Масштабные линейки Z 20 мм **P <0,01 указывают на существенные различия.

Результаты показали, что в срезах опухоли, обработанных COS-BA/Ce6 NPs-PDT, наблюдалось серьезное ухудшение состояния тканей и дефицит ядер, в то время как в других группах наблюдался умеренный некроз тканей. В то же время, по сравнению со свободным светом Ce6, наночастицы COS-BA/Ce6 при облучении заметно увеличивали количество TUNEL-положительных клеток, демонстрирующих более сильное коричневое окрашивание ядер (рис. 7H), что еще раз подтверждает превосходную комбинированную терапию химиотерапии и ФДТ. Более того, во всех группах не наблюдалось явных изменений массы тела (рис. 7В). Даже если группы COSBA/Ce6 NP или легкие группы Ce6 имели умеренную потерю массы тела во время введения, масса тела возвращалась к норме через несколько дней. Никаких явных повреждений или воспалительных поражений не было обнаружено в основных органах, собранных в конце лечения (вспомогательная информация, рис. S22), что указывает на низкую/отсутствие системной токсичности и хорошую биобезопасность наночастиц COS-BA/Ce6. Более того, хотя НЧ COS-BA/Ce6 в основном накапливаются в ткани печени, соответствующие маркеры функции печени (АЛТ, АСТ и ЩФ) не показали значительных изменений по сравнению с нормальными здоровыми мышами (рис. 7F), что указывает на лучшую биосовместимость. Кроме того, маркеры функции почек (АМК, CRE и UA) и биохимические параметры (ALB и TBIL) также оказались схожими с таковыми у нормальных мышей, что дополнительно подразумевает лучшую биобезопасность. Очевидно, что это пролекарство, органические небольшие молекулы, опосредованные COS-BA, COS-BA/Ce6 NP, обладают множеством благоприятных терапевтических свойств, которые открывают привлекательные возможности для применения в клинической медицине.

3.8. Противоопухолевый иммунитет при комбинированной химиотерапии/ФДТ и блокаде анти-PD-L1

Недавно многочисленные инновационные исследования показали, что сочетание иммунотерапии рака с другими методами лечения может эффективно стимулировать опухолеспецифические иммунные реакции для устранения первичных или отдаленных опухолей1. Воодушевленные уникальной функцией покоя химиотерапии и превосходной противоопухолевой эффективностью химиотерапии/ФДТ наночастиц COS-BA/Ce6, мы задаемся вопросом, может ли он также вызвать иммунологические ответы с помощью иммунного адъюванта анти-PD-L1, чтобы вызвать высокоэффективную противоопухолевую терапию. . Может ли он лечить отдаленные опухоли, которые нельзя лечить напрямую с помощью ФДТ, обеспечивая тем самым альтернативную стратегию клинического противоракового применения? Чтобы проверить эту гипотезу, в этом исследовании была создана модель «двух опухолей», а подробные процедуры эксперимента показаны на рис. 8А. Обычно две опухоли 4Т1 инокулировали как в левый, так и в правый бок каждой мыши. Учитывая, что само по себе анти-PD-L1 не оказывает заметного иммунотерапевтического эффекта50, эксперименты были разделены на 5 групп, включая необработанную группу, наночастицы COS-BA/Ce6, наночастицы COS-BA/Ce6 с анти-PD-L1, COS-BA/Ce6 NP. НЧ BA/Ce6 со светом, НЧ COS-BA/Ce6 со светом и анти-PD-L1. После однократной внутривенной инъекции НЧ (Ce6: 3,5 мг/кг) правые опухоли (первичная опухоль) в легких группах подвергались облучению в течение 15 мин для оценки иммунологических эффектов ФДТ/химиотерапии, тогда как левые опухоли (отдаленные опухоли) подвергались облучению в течение 15 мин. во всех группах без какого-либо лечения были отобраны для индивидуальной химиотерапии. Впоследствии, в дни 2, 4 и 6, мышам в иммунных группах внутривенно вводили антитело против PD-L1 (15 мг на мышь на инъекцию) всего три дозы. Примечательно, что независимо от лечения ФДТ наночастицы COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 могут эффективно ингибировать прогрессирование первичной опухоли (рис. 8B). И соответствующие средние коэффициенты ингибирования опухоли по отдельности достигали 86,7% (облучение) и 76,5% (без облучения), что намного выше, чем индивидуальная химиотерапия (5,7%) или лечение химиотерапией/ФДТ (27,4%) (рис. 8C). . Фотографии рассеченных опухолей (рис. 8D) и мышей, несущих 4T1- (подтверждающая информация, рис. S23), после 14 дней лечения также визуально подтвердили вышеупомянутый вывод. Эти результаты позволяют предположить, что как химиотерапия на основе НЧ, так и химиотерапия/ФДТ могут эффективно активировать противоопухолевый иммунитет. Между тем, что наиболее поразительно, блокада анти-PD-L1 в сочетании с наночастицами также оказывала замечательный эффект ингибирования опухоли на необлученные отдаленные (левые) опухоли (рис. 8E и F), как правило, более сильный, чем одни только наночастицы COS-BA/Ce6, что было наиболее поразительно. также подтверждено соответствующими рассеченными опухолями и изображениями мышей после лечения (рис. 8D и рис. S23), что дополнительно демонстрирует эффективный противоопухолевый иммунный ответ, индуцированный наночастицами COS-BA/Ce6.

Чтобы полностью изучить этот эффективный противоопухолевый иммунный ответ, CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), критически важные иммуноциты для иммунотерапии рака4, были дополнительно оценены путем анализа иммунных клеток в правой или левой опухолях после 14 дней лечения. Было обнаружено, что наночастицы COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 с обработкой ФДТ или без нее индуцируют стойкую инфильтрацию CD8+ CTL в первичных опухолях (рис. 8H и J). Инфильтрация CD8+ CTL составляла до 11,3% после химиотерапии на основе COS-BA/Ce6 NPs/ФДТ плюс лечение анти-PD-L1, что немного выше, чем COS-BA/Ce6 NP плюс анти-PD-L1 (9,63%), и намного выше, чем в других группах без анти-PD-L1, включая лечение химиотерапией на основе COS-BA/Ce6 NP (5,12%) или только химиотерапией/ФДТ (4,07%). Аналогично, по сравнению с неиммунными группами, значительно повышенная инфильтрация ЦТЛ также наблюдалась в левых (отдаленных) опухолях у мышей после применения наночастиц COS-BA/Ce6 плюс антиPD-L1 с обработкой ФДТ или без нее (рис. 8I и K), далее подразумевая высокоэффективные иммунные ответы, вызванные химиотерапией или комбинированной терапией химиотерапии/ФДТ. Между тем, после введения анти-PD-L1 химиотерапия на основе COS-BA/Ce6- и химиотерапия/ФДТ привели к устойчивой выработке множества цитокинов, которые играют ключевую роль в регуляции цитотоксических функций CTL8, включая опухолевые. фактор некроза-альфа (TNF-a) (рис. 8L) и интерферон-гамма (IFN-g) (рис. 8M) в образцах сыворотки мышей после 14 дней лечения, что еще раз подтверждает наличие эффективных противоопухолевых иммунных ответов. Кроме того, в различных группах лечения не наблюдалось явных изменений массы тела (рис. 8N), что указывает на благоприятную биобезопасность этой комбинированной химиотерапии/ФДТ/иммунотерапии. В совокупности мы обнаружили, что, хотя НЧ анти-PD-L1 плюс COSBA/Ce6 при освещении показали немного более высокий коэффициент ингибирования опухоли (86,7%), чем необлученная группа (76,5%), в отношении правых опухолей. Благодаря влиянию ФДТ (рис. 8Б–Г) достоверных различий в терапевтическом эффекте на левые опухоли не наблюдалось при наличии (77,8%) и отсутствии (78,4%) ФДТ (рис. 8Д–Ж). Мы предполагаем, что к этому явлению приводят следующие возможные причины. Во-первых, что касается механизма химиотерапии или ФДТ, усиливающего иммунологические эффекты блокады контрольных точек анти-PD-L1, накопленные исследования показали, что эти методы лечения могут вызывать острое воспаление в области опухоли, тем самым увеличивая презентацию опухолеассоциированных антигенов Т. клетки, тем самым побуждая раковые клетки подвергаться МКБ8,9. Опухолевые клетки, подвергающиеся ИКД, будут усиливать сигналы «съешь меня», подвергая кальретикулин (CRT) поверхности иммуногенно умирающих опухолевых клеток, и сигналы «опасности», высвобождая высокомобильный групповой блок 1 (HMGB1), способствуя активации дендритных клеток. активировать CTL, активность которых может быть усилена анти-PD-L1, что приводит к значительному улучшению противораковой иммунотерапии51.

Рисунок 8. Противоопухолевый эффект химиотерапии/ФДТ на основе COS-BA/Ce6 NP плюс иммунотерапия против PD-L1 с блокадой контрольных точек. (A) Схематическая иллюстрация химиотерапии/ФДТ на основе CNP с терапией против PD-L1. (BeD) (B) Профили роста опухоли, (C) средний вес опухоли и (D) изображения вырезанных опухолей у репрезентативных мышей для первичных (справа) опухолей после различных обработок в течение 14 дней, как указано. (EeG) (E) Кривые роста опухоли, (F) средний вес опухоли и (G) изображения удаленных опухолей для необлученных отдаленных (слева) опухолей после различных видов лечения, как указано. (H) Популяции CD8+ Т-клеток в правых опухолях и (J) процент инфильтрации CTL количественно определяли с помощью проточной цитометрии после 14 дней лечения. (I, K) Популяции CD8+ Т-клеток в левых опухолях на 14 день количественно определяли с помощью проточной цитометрии (n Z 3). Секреция цитокинов в сыворотке после 14 дней лечения, включая (L) IFN-g и (M) TNF-a, измеренная методом ELISA (n Z 3). (N) Изменения массы тела мышей во время различных обработок. *P < 0.05, **P < 0.01 и ***P < 0,001 показывают существенные различия.

Во-вторых, в этой работе наночастицы COS-BA/Ce6 могут быть распределены в левой и правой опухолях одновременно, причем как левая химиотерапия, так и правая химиотерапия/ФДТ имеют огромный потенциал для индукции опухолевых клеток, подвергающихся ИКД. Между тем, наночастицы COS-BA/Ce6 вводятся только в одной дозе, иммунотерапия в основном зависит от трех доз анти-PD-L1, будь то химиотерапия или химиотерапия/ФДТ, они являются лишь праймерами. Терапевтические различия в индукции ИКД опухолевых клеток между индивидуальной химиотерапией и комбинированной химиотерапией/ФДТ могут быть не очень заметными. Процент CD8+ CTL в левой (рис. 8I и K) и правой опухолях (рис. 8H и J) также подтверждает вышеизложенное предположение, никакой существенной разницы в CD8+ CTL не наблюдалось в присутствии или отсутствии ФДТ. Таким образом, наночастицы COS-BA/Ce6 плюс анти-PD-L1 с облучением или без него достигли одинаковой противораковой эффективности против левых опухолей. Более того, поскольку клетки 4T1 экспрессируют низкие уровни PD-L152, широко доказано, что само по себе анти-PD-L1 оказывает заметный иммунотерапевтический эффект на рак молочной железы 4T153,54. Несмотря на то, что эффекты ICD, опосредованные наночастицами COS-BA/Ce6, требуют дальнейшего изучения, представленные результаты показали, что наночастицы COS-BA/Ce6 достигают значительно усиленного иммунного ответа с помощью анти-PD-L1. В совокупности кажется, что наночастицы COS-BA/Ce6 действительно усиливают иммунотерапию рака анти-PD-L1, а не просто комбинированную терапию. Хотя анти-PD-L1 плюс наночастицы COS-BA/Ce6 с лечением ФДТ или без него не показали существенных различий в терапевтических эффектах, оба они продемонстрировали явно повышенную противоопухолевую эффективность по сравнению с одной дозой наночастиц COS-BA/Ce6. То есть, даже если без световой обработки, после введения иммунного адъюванта антиPD-L1 иммуногенность опухолевых остатков после химиотерапии наночастиц COS-BA/Ce6 может быть повышена, что приводит к заметным системным противоопухолевым иммунным ответам, что приводит к эффективному подавлению первичных или отдаленных опухолей. Таким образом, должна быть возможна элиминация первичных и метастатических опухолей в ходе клинической противораковой иммунотерапии при повторных обработках НЧ. Очевидно, что эти результаты в совокупности свидетельствуют о высокоэффективных и синергичных противоопухолевых иммунных ответах, индуцированных наночастицами COS-BA/Ce6 в сочетании с блокадой анти-PD-L1, либо только с химиотерапией, либо в сочетании с химиотерапией/ФДТ.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

4. Выводы

Таким образом, мы целенаправленно спроектировали, синтезировали и разработали биосовместимый, биоразлагаемый, малотоксичный, но высокоэффективный и клинически доступный трансформированный фотохимиотерапевтический нанопрепарат COS-BA/Ce6 NP путем объединения трех многофункциональных компонентов - самособирающейся природной малой молекулы бетулиновой кислоты. (BA), водорастворимый COS и низкотоксичный фотосенсибилизатор Ce6 для комбинированной химиотерапии/ФДТ. Впоследствии он запускает высокоэффективные и синергичные противоопухолевые иммунные реакции в сочетании с блокадой анти-PD-L1, либо при монотерапии химиотерапией, либо в сочетании с химиотерапией/ФДТ. В частности, мы показываем, что расположение молекул с полой сеткой может способствовать образованию наночастиц со структурой оболочки. Модификации водорастворимого COS могут значительно усилить противораковую активность липофильных природных малых молекул путем создания амфифильного пролекарства. Мы также показываем, что полученные нанопрепараты обладают множеством благоприятных терапевтических свойств, особенно умной функцией «сна» с коварными химиотерапевтическими эффектами. В сочетании с особой чувствительностью к pH эти соединения обладают низкой токсичностью и биобезопасностью по отношению к нормальным тканям, но высокотоксичны для опухолевых тканей. Вместе с улучшенной генерацией 1 O2, хорошей биоразлагаемостью и биосовместимостью все это способствовало высокоэффективной, синергической и безопасной противораковой химиотерапии/ФДТ/иммунотерапии. В частности, индивидуальная химиотерапия без лечения ФДТ может активировать системные противоопухолевые иммунные реакции, открывая привлекательные возможности для клинически синергической противораковой химиотерапевтической иммунотерапии. В целом, эта работа дает многообещающие идеи для разработки природных многофункциональных, высокобиоактивных и малотоксичных наноиммуностимуляторов для клинической иммунотерапии.

Рекомендации

1. Сан В, Чжан Цзы, Дай Юл, Чэнь Си. Последние достижения в области синергетической комбинированной иммунотерапии рака на основе наноматериалов. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Ли XY, Го XM, Лин Дж.Б., Тан З., Хуан Г.Н., Хэ Л.З. и др. Иммунотерапия рака на основе наномедицины, разработанная путем перепрограммирования опухолеассоциированных макрофагов. Наномасштаб 2021;13:4705e27.

3. Чао Ю, Сюй Л.Г., Лян С., Фэн Л.З., Сюй Дж., Донг З.Л. и др. Комбинированная местная иммуностимулирующая радиоизотопная терапия и системная блокада иммунных контрольных точек дают мощный противоопухолевый ответ. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Вэнь Ю., Чэнь X, Чжу С.Ф., Гун Ю.К., Юань Г.Л., Цинь XY и др. Интегрированные наночастицы фототермической химиотерапии с реакцией микроокружения опухоли усиливали индукцию гибели иммуногенных клеток для эффективного лечения колоректального рака. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Пэн Дж.Р., Сяо Ю., Ян Ц., Лю Ц.Ю., Чэнь Ю., Ши К. и др. Внутриклеточная агрегация перепрограммированных пептидами наносборок малых молекул усиливает химиотерапию рака и комбинаторную иммунотерапию. Акта Фарм Син Б 2021;11:1069e82.

6. Сун В., Куанг Дж., Ли С.Х., Чжан М.К., Чжэн Д.В., Цзэн Икс и др. Усиленная иммунотерапия, основанная на фотодинамической терапии, для эрадикации первичных опухолей и метастазов в легкие. АСУ Нано 2018;12:1978e89.

7. Ван С., Сюй Л.Г., Лян С., Сян Дж., Пэн Р., Лю З. Иммунологические реакции, вызванные фототермической терапией с использованием углеродных нанотрубок в сочетании с терапией против CTLA-4 для подавления метастазирования рака. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. Хэ С.Б., Дуань Х.Р., Го Н.Н., Чан С., Пун С., Вейхсельбаум Р.Р. и др. Наноразмерные координационные полимеры ядро-оболочка сочетают химиотерапию и фотодинамическую терапию для усиления иммунотерапии рака, блокирующей контрольные точки. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Галлуцци Л., Буке А., Кепп О., Зитвогель Л., Кремер Г. Иммуногенная гибель клеток при раке и инфекционных заболеваниях. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.

10. Чан К.С., Линь Ю.Дж., Ли Р., Лай Ю.Х., Ченг Х.В., Се К.Х. и др. Комбинация магнитных наночастиц на основе фукоидана и иммуномодуляторов усиливает локализованную в опухоли иммунотерапию. Нэт Нанотехнологии 2018;13:746e54.

11. Чжэн С.Л., Гэ Дж.К., Ву Дж.С., Лю В.М., Го Л., Цзя Ци и др. Биоразлагаемая нановезикула, производная гипокретина, в качестве тераностика, управляемого ближним инфракрасным светом, для двойной фотоактивной визуализации и терапии рака. Биоматериалы 2018;185:133e41.

12. Спайсер К.Д., Жюмо С., Гупта Б., Стивенс М.М. Конъюгаты пептидов и белковых наночастиц — универсальные платформы для биомедицинских применений. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Мэй Ю.Л., Ван Р.Б., Цзян В., Бо Ю., Чжан Т.Ф., Юй Дж.Л. и др. Недавний прогресс в области наноматериалов для доставки нуклеиновых кислот в иммунотерапии рака. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Чжэн Ю.Л., Йе Дж.С., Ли З.И., Чен Х.Дж., Гао Ю. Недавний прогресс в фотодинамической терапии рака соно: от разработки новых сенсибилизаторов к стратегиям повышения эффективности на основе нанотехнологий. Акта Фарм Син Б 2021;11:2197e219.

15. Ли СК, Цзоу QL, Ли YX, Юань CQ, Син РР, Ян XH. «Умные» супрамолекулярные фотодинамические металлонанопрепараты на основе пептидов, созданные методом многокомпонентной координационной самосборки. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Чжи К.К., Ван Дж.К., Чжао Х.Т., Ян С. Самособранный гель из натуральных низкомолекулярных продуктов для доставки лекарств: прорыв в новом применении натуральных низкомолекулярных продуктов. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Ян X, Ма С, Чен ЗМ, Лю Дж, Лю ФЮ, Се РБ и др. Одиночные наночастицы, собранные в небольшие молекулы, обеспечивают эффективную пероральную доставку лекарств. Нано Рез 2019;12:2468e76.

18. Чжи К.К., Чжао Х.Т., Ян X, Чжан Х., Ван Дж.К., Ван Дж. и др. Гелеобразователи натуральных продуктов и общий способ их получения из организмов. Наномасштаб 2018;10:3639e43.

19. Ченг Дж. Дж., Фу С. Ю., Цинь З., Хан Й., Ян X. Самособирающиеся природные низкомолекулярные дитерпеновые кислоты с благоприятной противораковой активностью и биобезопасностью для синергически усиленной противоопухолевой химиотерапии. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Исследование естественного активного процесса загрузки низкомолекулярных лекарств и высокоэффективной синергетической противоопухолевой эффективности. Интерфейсы ACS Appl Mater 2020;12:6827e39.

21. Ченг Дж.Дж., Чжао Х.Т., Яо Л., Ли Ю., Ци Б.К., Ван Дж. и др. Простые и многофункциональные природные самособирающиеся стерины с супрамолекулярными фотосенсибилизаторами, опосредованными противораковой активностью, для усиленной противоопухолевой фотодинамической терапии. Интерфейсы ACS Appl Mater 2019;11: 29498e511.

22. Ченг Дж.Дж., Чжао Х.Т., Ван Дж.К., Хан Й., Ян X. Биоактивная природная совокупность фоточувствительных препаратов с малыми молекулами, настроенная для высокоэффективной синергетической и усиленной фотохимиотерапии типа I. Интерфейсы ACS Appl Mater 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Наномедицина-носитель путем совместной сборки натуральных небольших продуктов для синергетического усиленного противоопухолевого действия с защитным действием на ткани. Интерфейсы ACS Appl Mater 2020;12:42537e50.

24. Си Цз.К., Лю Х.П. Последние достижения в разработке амфифильных лекарств и вакцин для самостоятельной доставки. Реклама Ther 2019;3:1900107.

25. Чжан Р.С., Цинь С.Ф., Конг Ф.Д., Чен П.В., Пан Г.Дж. Улучшение клеточного усвоения терапевтических веществ за счет взаимодействия с компонентами клеточной мембраны. Нарко Делив 2019;26:328e42.

26. Пухалс С., Гиральт Э. Богатые пролином амфипатические пептиды, проникающие в клетки. Adv Drug Deliv Ред. 2008;60:473e84.

27. Карими М., Гасеми А., Саханди Зангабад П., Рахиги Р., Мусави Басри С.М., Миршекари Х. и др. Умные микро/наночастицы в системах доставки лекарств/генов, реагирующих на стимулы. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Тритерпеновые пролекарства без носителя с глутатионовым ответом и биобезопасностью для синергически усиленной фотохимиотерапии. Интерфейсы ACS Appl Mater 2021;13:245e56.

29. Ли XS, Ли С.Ю., Юн Дж. Супрамолекулярные фотосенсибилизаторы омолаживают фотодинамическую терапию. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Цзоу П., Юань С.Дж., Ян Х., Го Ю.З., Ли Л.Н., Сюй К.В. и др. Структурная характеристика и противоопухолевые эффекты олигосахаридов хитозана против ортотопической опухоли печени через сигнальный путь NF-kB. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Чжай XC, Юань SJ, Ян X, Цзоу П, Ли НЛ, Ли ГЮ и др. Хитозановые олигосахариды индуцируют апоптоз при карциноме почки человека посредством стресса эндоплазматического ретикулума, зависимого от активных форм кислорода. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Дэн Г., Ма С., Чжао Х.Т., Чжан С.К., Лю Дж., Лю Ф.Ю. и др. Комбинированная противоотечная и антиоксидантная терапия ишемического инсульта с использованием наночастиц бетулиновой кислоты, нагруженных глибуридом. Тераностика 2019;9:6991e7002.

33. Лю К., Син Р.Р., Цзоу К.Л., Ма Г.Х., Мохвальд Х., Ян XH. Простая самосборка фотосенсибилизаторов с пептидной настройкой для противораковой фотодинамической терапии. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Ли Ю, Линь Цзюй, Ван Пи, Луо Ц, Линь ХР, Чжан Ю и др. Вирус, реагирующий на микроокружение опухоли и изменяющий форму, вдохновил на создание нанопрепаратов для фототермической химиотерапии в ближнем инфракрасном диапазоне II под визуальным контролем. АСУ Нано 2019;13:12912e28.

35. Савада С.И., Сато Ю.Т., Кавасаки Р., Ясуока Дж.И., Мизута Р., Сасаки Ю. и др. Гибридная сборка наногеля для внутриклеточной доставки экзосом: влияние на эндоцитоз и слияние с помощью инженерии поверхностного полимера экзосом. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Чжоу Т.Ц. Теоретическая основа, экспериментальный дизайн и компьютерное моделирование синергизма и антагонизма в исследованиях комбинаций лекарственных средств. Pharmacol Ред. 2006;58:621e81.

37. Чжао Ю.П., Чжао Ю.Н., Ма QS, Сунь Б, Ван Ц.П., Дин Z и др. Безносители, двойные функциональные наностержни, полученные путем самосборки чистых молекул лекарств для синергетической хемо-фотодинамической терапии. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ма Х, Чжао Юл. Биомедицинские применения супрамолекулярных систем, основанных на взаимодействии хозяин-гость. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Цинь С.Х., Чжан М.З., Ху С., Ду Ц, Чжао З.П., Цзян Ю. и др. Наноинженерия нового производного хлорина е6 для усиленной фотодинамической терапии посредством регуляции метаболизма лактата. Наномасштаб 2021;13:11953e62.

40. Ду Ц, Цинь С.Х., Чжан М.З., Чжао З.П., Ли Ц., Рен С.М. и др. Нанопрепарат без носителя, регулирующий митохондриальный метаболизм, для усиления чувствительности фототермической терапии. Chem Commun (Камб) 2021;57:8993e6.

41. Ли XS, Ю С, Ли Д, Ким Дж, Ли Б, Чо Ю и др. Простой супрамолекулярный подход к активируемым нанотераностикам, управляемым нуклеиновыми кислотами, который преодолевает недостатки фотодинамической терапии. АСУ Нано 2018; 12:681e8.

2. Гилсон Р.К., Блэк К.С., Лейн Д.Д., Ачилефу С. Гибридный TiO2-рутениевый нанофотосенсибилизатор синергически производит активные формы кислорода как в гипоксических, так и в нормоксических условиях. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Сюй С.Д., Юань Ю.И., Цай XL, Чжан С.Дж., Ху Ф., Лян Дж. и др. Настройка синглет-триплетной энергетической щели: уникальный подход к созданию эффективных фотосенсибилизаторов с характеристиками индуцированной агрегацией эмиссии (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Ву ВБ, Мао Д., Сюй С.Д., Кенри, Ху Ф., Ли XQ и др. Полимеризация усиливает фотосенсибилизацию. Химия 2018;4:1937e51.

45. Кунду П.К., Саманта Д., Лейзровице Р., Маргулис Б., Чжао Х., Бёрнер М. и др. Управляемая светом самосборка нефоточувствительных наночастиц. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Миядзаки М., Юба Э., Хаяси Х., Харада А., Коно К. pH-чувствительные полимер-модифицированные липосомы на основе гиалуроновой кислоты для клеточно-специфичных систем внутриклеточной доставки лекарств. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Чжан Ю., Лю З.Н., Лянь П., Цянь Дж., Ли С.В., Ван Л. и др. Селективная визуализация и гибель раковых клеток посредством переключаемой pH флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона и фототермических эффектов. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Ченг Дж.Дж., Тан Г.Х., Ли В.Т., Чжан HY, Ву XD, Ван ZQ и др. Простой синтез с помощью хитозана многофункциональных магнитных Fe3O4@SiO2@CS@пирофеофорбида - флуоресцентных наночастиц для фотодинамической терапии. Новый журнал J Chem 2016;40:8522e34.

49. Ченг Дж. Дж., Ван С., Чжао Х. Т., Лю Ю., Ян X. Исследование механизма самосборки и эффективной синергетической противоопухолевой химиофототерапии биоразлагаемого и чувствительного к глутатиону пролекарства урсоловой кислоты, опосредованного фоточувствительным нанопрепаратом. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Ян Ю, Сюй Дж, Сунь Ю, Мо ЛТ, Лю Б, Пан XS и др. Реакция логических вычислений на основе аптамеров на живые клетки для обеспечения терапии блокады иммунных контрольных точек без антител. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.

51. Куай Р., Юань В.М., Сон С.Дж., Нам Дж., Сюй Ю., Фань Ю.К. и др. Устранение уже сформировавшихся опухолей с помощью комбинированной химиоиммунотерапии на основе нанодисков. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Лесняк В.Г., Чаттерджи С., Габриэльсон М., Лисок А., Варрам Б., Помпер М.Г. и др. Обнаружение PD-L1 в опухолях с использованием [(64)Cu]атезолизумаба с помощью ПЭТ. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Сагив-Барфи И., Корт Х.К., Червински Д.К., Нг П.П., Чанг Б.И., Леви Р. Терапевтический противоопухолевый иммунитет за счет блокады контрольных точек усиливается ибрутинибом, ингибитором как БТК, так и ИТК. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Лян С., Чао Ю, И Икс, Сюй Дж, Фэн ЛЗ, Чжао Ц и др. Внутренняя радиоизотопная терапия, опосредованная наночастицами, для локального увеличения проницаемости сосудистой сети опухоли для синергетического улучшения лечения рака. Биоматериалы 2019;197:368e79.