Потемнение кожи происходит в результате накопления кожного пигмента меланина. Для борьбы с этим в продаже имеются различные средства для осветления кожи, большинство из которых ингибируют синтез меланина. Обесцвечивание меланина — альтернативный метод осветления кожи. В этом исследовании мы показываем, что лигнинпероксидаза (LiP), внеклеточный фермент, очищенный из Phanerochaete chrysosporium NK-1, выделенного из лесной почвы, может эффективно разрушать и обесцвечивать меланин in vitro. Условия обесцвечивания, включая pH, температуру, время инкубации, концентрацию фермента и добавление медиатора, исследовали для оптимизации условий реакции. Результаты показывают, что pH 3, 40°, 15 МЕ/мл и 10-часовая инкубация были оптимальными условиями для обесцвечивания меланина. Использование медиатора, вератрилового спирта, также оказалось эффективным для повышения эффективности деколонизации меланина с обесцвечиванием до 92 процентов. Результаты сканирующей электронной микроскопии показали пустоты на обработанных гранулах меланина по сравнению с необработанным образцом, что указывает на деградацию меланина. Изменения в области отпечатков пальцев меланина не наблюдались. Между волновыми числами 1500–500 см–1, например, наличие новых пиков в обработанном меланине при 1513, 1464 и 1139 см–1 CH2, изгиб CH3 и растяжение C–O–C свидетельствует о структурных изменениях. Новый пик при 2144 см-1 (растяжение алкинила C≡C) также был обнаружен в обесцвеченном меланине. Исследование цитотоксичности показало, что обработанные меланин и LiP обладают низкими цитотоксическими эффектами; однако медиатор вератрилового спирта может привести к высокой смертности, что говорит о том, что его использование должно быть тщательно протестировано при разработке продуктов для здоровья и ухода за кожей. Результаты исследования показывают, что LiP, продуцируемый Phanerochaete chrysosporium, может быть использован в медицинской и косметической промышленности, в частности, для разработки косметических отбеливающих средств на биологической основе.

Согласно соответствующим исследованиям, цистанхе — распространенное растение, известное как «чудодейственное растение, продлевающее жизнь». Его основным компонентом является цистанозид, который обладает различными эффектами, такими как антиоксидантное, противовоспалительное и стимулирующее иммунную функцию. Механизм между цистанхе и отбеливанием кожи заключается в антиоксидантном действии гликозидов цистанхе. Меланин в коже человека вырабатывается путем окисления тирозина, катализируемого тирозиназой, причем реакция окисления требует участия кислорода, поэтому свободные радикалы кислорода в организме становятся важным фактором, влияющим на выработку меланина. Цистанхе содержит цистанозид, который является антиоксидантом и может снижать образование свободных радикалов в организме, подавляя тем самым выработку меланина.

Нажмите на Cistanches Herba для отбеливания

Для получения дополнительной информации:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Меланин представляет собой группу сложных, неподатливых и широко распространенных полициклических биополимерных пигментов кожи, вырабатываемых специализированными клетками кожи, называемыми меланоцитами 1,2. Его основная функция заключается в защите кожи от вредного ультрафиолетового излучения солнечного света путем образования надъядерных колпачков вокруг ДНК клеток кожи 3. Кроме того, он отвечает за различные цвета кожи, поглощая различные свободные радикалы в цитоплазме. Большинство этих осветляющих кожу агентов, полученных из природных ресурсов, ингибируют выработку меланина в клетках кожи за счет ингибирования ферментов тирозиназы, подавления биосинтеза пигмента и некоторыми альтернативными путями. Различные соединения, такие как гидрохинон, монобензиловые эфиры гидрохинона, ртуть, кортикостероиды и арбутин, используются в коммерческих рецептурах косметических средств для отбеливания кожи, однако их применение связано с серьезными побочными эффектами. Например, сообщается, что ртуть вызывает повреждение почек, а свинец вызывает тревогу, депрессию и психоз 4,5. Использование кортикостероидов может вызвать синдром Кушинга, диабет, гипертензию, надпочечниковую недостаточность, иммуносупрессию, истончение кожи, акне, дерматит и гипертрихоз 6. Tain et al. (2009) сообщили, что использование арбутина в косметических средствах для отбеливания кожи было эффективным при концентрациях до 3 процентов, но дальнейшее увеличение концентрации вызывало цитотоксические эффекты. Учитывая эти ограничения, применение этих ингибиторов в косметических средствах для отбеливания кожи подверглось широкой критике со стороны органов здравоохранения и безопасности. Было высказано предположение, что к 2021 году стоимость косметических средств для отбеливания кожи может достичь 155,44 млрд долларов США с годовым темпом роста в 4,9 процента. Из-за растущего спроса на безопасные и натуральные средства для отбеливания кожи во всем мире значительный интерес вызывает ферментативная деколонизация меланина 7–9.

Микробные внеклеточные ферменты, такие как лакказа, марганцевая пероксидаза и лигнинпероксидаза (LiP), ранее тестировались на обесцвечивание меланина и рассматриваются как потенциальная экологически чистая альтернатива токсичным химическим веществам 1. Среди них LiP оказался очень эффективным для обесцвечивания меланина. меланина из-за его высокого окислительно-восстановительного потенциала для окисления вератрилового спирта (VA), чем другие родственные ферменты. Несмотря на высокий окислительный потенциал и эффективный катализ меланина, объемное производство и трудности с очисткой являются основными ограничениями коммерческого применения LiP в средствах для отбеливания кожи. Кроме того, LiP теряет свою ферментативную активность в отношении деколонизации меланина при избытке пероксида водорода, который считается критическим для окисления меланина. Помимо своей важной роли, H2O2 инактивирует LiP, тем самым снижая каталитическую активность фермента.

Полученные результаты

Обесцвечивание меланина Phanerochaete chrysosporium NK‑1.Штаммы грибов тестировали на обесцвечивание меланина. Грибы точечно инокулировали на плотную среду, содержащую меланин и ВК в качестве индуктора LiP. После семи дней инкубации Phanerochaete chrysosporium NK-1 продемонстрировала способность обесцвечивать меланин, как показано на рис. 1.

Условия оптимального обесцвечивания меланина.рН. Очищенный фермент использовали для обесцвечивания синтетического меланина in vitro. Наблюдалось влияние различных условий на обесцвечивание меланина 10. Сначала исследовали влияние рН на обесцвечивание меланина под действием LiP. Для этого проводили обесцвечивание меланина в различных условиях рН от 2,0 до 6,0 при температуре 30 градусов как в присутствии, так и в отсутствие ВК в течение 6 часов инкубации. Результаты на рис. 2 показывают, что в целом обесцвечивание меланина в присутствии ВА было выше при всех условиях рН. В частности, это более заметно в условиях более высокого pH. VA может способствовать образованию катион-радикалов 11. Эти радикалы обладают гораздо более высоким окислительно-восстановительным потенциалом для неспецифического воздействия на связи C-C в меланине и приводят к обесцвечиванию 12. В присутствии VA было достигнуто максимальное обесцвечивание меланина на 88 процентов. при рН 3, а затем 71% при рН 2, в то время как наименьшее обесцвечивание меланина 39% наблюдалось при рН 6. В отсутствие ВА максимальное обесцвечивание меланина 86% наблюдалось при рН 3, тогда как самое обесцвечивание меланина на 35% и 36% наблюдалось при рН 5 и 6 соответственно. Обесцвечивание меланина с помощью LiP в этом исследовании было высокоэффективным при более низких значениях рН, т.е. 2 и 3 (рис. 2), хотя другие исследования показали оптимальные условия рН при 4 1.

Температура. Обесцвечивание меланина LiP изучали при различных температурах от 20 до 60 градусов как в присутствии, так и в отсутствие ВК при инкубационном периоде 6 часов. В отсутствие ВК аналогичные проценты (19%) обесцвечивания меланина наблюдались при температуре 20 и 30° (рис. 3). Наибольшее и наименьшее обесцвечивание меланина в отсутствие ВК наблюдалось при 40 и 50 градусах соответственно. Однако с ВА в растворе обесцвечивание меланина увеличивалось с 20 до 40 градусов и уменьшалось до 60 градусов. В присутствии ВА максимальное обесцвечивание меланина составляет примерно 60% при 40°С. Обесцвечивание обычно ниже, поскольку эксперимент проводился в условиях более мягкого pH.

концентрация ЛиП. Обесцвечивание меланина также исследовали при изменении концентрации фермента. Пять различных концентраций, т. е. 5, 10, 15, 20 и 25 МЕ/мл LiP, исследовали на обесцвечивание меланина в присутствии и в отсутствие VA, как показано на рис. 4. Неожиданно наиболее эффективной оказалась концентрация фермента 15 МЕ/мл для обоих растворов с ВА и без него. После 6-часового инкубационного периода максимальное обесцвечивание меланина составило 92 % в присутствии ВА и 70 % в отсутствие медиатора при концентрации фермента 15 МЕ/мл, тогда как самое низкое обесцвечивание меланина 23 % наблюдалось в отсутствие ВА при использовании 5 МЕ/мл LiP. Неясно, что обесцвечивание менее эффективно при высоких концентрациях фермента, т.е. 20 и 25 МЕ/мл (рис. 4).

Инкубационный период. Эксперименты по обесцвечиванию проводили через 2, 4, 6, 8 и 10 ч инкубации. Эти реакции также проводили в присутствии и в отсутствие ВК. Результаты показали, что эффективность обесцвечивания положительно коррелирует со временем инкубации, как и ожидалось (рис. 5). Увеличение степени делокализации было более заметным в начальной инкубации. Наибольшее обесцвечивание меланина (68%) наблюдалось после 10-часового инкубационного периода в присутствии ВК и 59% в отсутствие ВК. Обесцвечивание меланина составляло всего 15 процентов после 2 часов инкубации без ВА. Поэтому на основании результатов испытаний мы пришли к выводу, что оптимальными условиями являются pH 3, 40 градусов, 15 МЕ/мл и инкубация 10 часов.

Анализы SEM (сканирующий электронный микроскоп) и FTIR (инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье).Морфологические и структурные изменения меланина были охарактеризованы с помощью SEM и FTIR соответственно. Обесцвеченный меланин анализировали с помощью СЭМ для наблюдения за любыми морфологическими изменениями поверхности. В качестве контроля использовали синтетический меланин без какой-либо обработки ферментами. Как показано на рис. 6, на обработанных гранулах меланина было пустое пространство по сравнению с необработанным образцом, что свидетельствует о том, что частицы меланина были атакованы ферментом.

Обесцвеченный меланин также анализировали с помощью FTIR с необработанным меланином в качестве контроля (рис. 7). Молекулярные отпечатки как обесцвеченного, так и необработанного меланина были получены и сопоставлены, чтобы подтвердить любые структурные изменения в обработанном меланине 13. Спектры FTIR меланина (C18H10N2O4) показали широкий спектр поглощения при 3272 см-1, который можно отнести к характерному O –H валентные или NH валентные колебания карбоновой кислоты и фенольных групп. Изменения в спектре FTIR обработанного меланина были заметны. Широкая полоса при волновых числах 3000–3500 см–1 указывает на присутствие групп -NH и -OH как в контрольных, так и в обработанных образцах. Однако интенсивность обработанного образца значительно выше, чем у контрольного образца, что позволяет предположить, что при обработке эти функциональные группы были добавлены к структуре ферментативными атаками. Пики при 2884,4 см-1 и 2822 см-1 указывали на присутствие алкильных групп в контроле, в то время как в обесцвеченном меланине пик при волновом числе 2884,4 см-1 отсутствовал. Пик при 2822 см-1 отклонился до длины волны 2835,92 см-1, что также отражает структурные изменения обработанного меланина в этой области. Пик при волновом числе 1710 см-1 в контроле был приписан присутствию карбоновой кислоты. Этот пик также отсутствовал или был в значительной степени снижен в обесцвеченном меланине, что еще раз подтверждает структурные изменения в обработанном меланине. Также произошли некоторые изменения в области отпечатков пальцев. Например, между волновыми числами 1500–500 см-1 наличие новых пиков в обработанном меланине при 1513, 1464 и 1139 см-1 свидетельствует о структурных изменениях. Новый пик при 2144 см-1 также был обнаружен в обесцвеченном меланине.

Эффекты цитотоксичности.Цитотоксичность деградированного меланина и LiP исследовали с использованием метода цитотоксичности артемии 14,15. В настоящем исследовании цитотоксические эффекты обработанного меланина и LiP были низкими, а показатели жизнеспособности личинок креветок превышали или равнялись 90 процентам (таблица 1). Увеличение концентрации LiP не влияло на жизнеспособность личинок креветок до 80 мкл/мл (~80 МЕ/мл), что свидетельствует о его низкой цитотоксической активности. В положительном контроле с ВК смертность составила 100%, что говорит о том, что следует соблюдать осторожность при применении ЛиП в присутствии ВК в качестве медиатора в медицинских и косметических целях.

Обсуждение

Что касается температуры, то самый высокий рост грибов и продукция ферментов были достигнуты при 40 градусах, что соответствует естественной среде обитания P. chrysosporium. Способность LiP разлагать меланин основана на структурном сходстве между меланином и лигнином 18. Эффективность деградации меланина LiP in vitro коррелирует с несколькими факторами, такими как pH, температура, концентрация фермента и время инкубации. как наличие В.А. liP может окислять VA до его катион-радикалов (VA∙ plus ) и служить окислительно-восстановительным медиатором, который дополнительно обесцвечивает меланин, как показано на рис. 8.

H2O2 является важным субстратом в качестве конечного акцептора электронов при обесцвечивании меланина. LiP легко инактивируется при их избыточной концентрации, что вызывает разрыв структуры гема или образование неактивного соединения III. Сообщается, что этот ингибирующий эффект может быть подавлен окислением VA до катион-радикала 1 VA. LiP окисляет VA до катион-радикалов VA, которые действуют как окислительно-восстановительный медиатор для обесцвечивания меланина. VA представляет собой натуральное соединение, полученное из грибов белой гнили, которые, как ожидается, будут иметь меньше побочных эффектов. Однако присутствие медиатора VA приводило к высокой смертности тестируемых организмов по сравнению с низкими цитотоксическими эффектами обработанных меланина и LiP. Его следует тщательно тестировать в составе продуктов для здоровья и ухода за кожей.

Материалы и методы

Выделение и идентификация штаммов грибов.Выделение грибов производилось с загрязненного участка, который долгое время использовался как свалка древесных материалов. Образец отбирали в стерильные флаконы и передавали в лабораторию для очистки. Очистку проводили на агаровой среде с морской декстрозой. Из образца выделили и очистили четыре различные колонии грибов. Отбор лучшего штамма проводили на основе обесцвечивания меланина и производства биомассы в присутствии меланина в качестве единственного источника углерода в среде с минеральными солями (МСМ). На основе скрининга выбранный организм идентифицировали путем секвенирования ДНК 5.8S рРНК и 18S рРНК с использованием универсальных праймеров ITS-1 и ITS-4 10. Их геномную ДНК экстрагировали по методу Anderson et al. 19. После очистки проводили секвенирование продуктов ПЦР. Последовательности были выровнены с использованием инструмента BLAST в NCBI, и гомологи были проанализированы на филогению с использованием молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA). На основе максимальной вероятности было построено дерево соединения соседей для идентификации выделенного штамма гриба. Последовательности были отправлены в GenBank NCBI под регистрационным номером KX064682.1. Филогенетический анализ показал, что изолят KX064682.1 был штаммом Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Пластинчатый анализ на обесцвечивание меланина.Для обесцвечивания меланина использовали грибок белой гнили Phanerochaete chrysosporium NK-1. Известно, что Phanerochaete chrysosporium продуцирует LiP. Синтетический меланин (B049-97-6) использовали в качестве модельного меланина во всех экспериментах по обесцвечиванию меланина. Модифицированную среду с VA 2 в качестве индуктора LiP использовали для проверки способности грибка к обесцвечиванию меланина. Чашки Петри использовали для культивирования Phanerochaete chrysosporium NK-1. Среду готовили растворением 10 г глюкозы, 2 г солодового экстракта, 4 г MgSO4·7H2O, 1 г KH2PO4, 0.01 г FeSO4, 0,005 г ZnSO4, 0,2 г синтетического меланина и 15 г агара на 1- л дистиллированной воды. Засеянные чашки Петри инкубировали при комнатной температуре в темноте. Наблюдали степень обесцвечивания меланина под и вокруг колонии грибка. Установлено, что гриб способен обесцвечивать меланин и в дальнейшем используется для приготовления ферментативных растворов.

Приготовление фермента для обесцвечивания меланина.Жидкая среда культуры содержала 10 г глюкозы, 0,2 г дрожжевого экстракта, 0.07 г ВК, 3.{{13 }} г винной кислоты, 1 г твина 80, 0,2 г KH2PO4, 0,146 г CaCl2·2H2O, 0,157 г K2HPO4, 0.05 г MgSO4·7H2O, 42,5 мг ZnSO4·7H2O, 7,0 мг CoCl2·6H2O, 7,0 мг CuCl2·2H2O, 0,54 мг FeCl3, 0,9 мг NaCl и 0,2 мг синтетического меланина на литр дистиллированной воды 20. рН среды доводили до 4,0 растворами NaOH и HCl. Колбы на 250 мл, содержащие аликвоты по 100 мл культуральной среды, автоклавировали и инокулировали 5 мл инокулята. Затем колбы инкубировали на ротационном шейкере при 30°С в течение 15 дней. Повторные образцы были собраны для анализа активности LiP с интервалом в 24 часа.

Ферментный анализ.Реагенты для анализа LiP включали 250 мМ буфера тартрата натрия, рН 5,5, 10 мМ ВА и 4 мМ Н2О2 (30 процентов). Ферментный анализ проводили в кювете с диоксидом кремния, а оптическую плотность измеряли при 310 нм с помощью спектрофотометра УФ-видимого диапазона (Shimadzu, Киото, Япония). Поглощение контролировали в моменты времени 0–30 с в условиях окружающей среды. Активность фермента рассчитывали по закону Бера, уравнение (1) 21.

где с — концентрация частиц ослабления; А — оптическая поглощательная способность; ε — молярный коэффициент затухания; d — длина оптического пути. Измерение активности фермента включает определение изменения концентрации во времени, уравнение. (2).

Оптимизация для усиленного производства LiP и обесцвечивания меланина in vitro.Оптимизацию усиленного производства LiP из Phanerochaete chrysosporium NK-1 с использованием меланина в качестве субстрата проводили с использованием конструкции Placket Burman. Полноразмерный Placket был основан на том факте, что он подрывает интерактивные эффекты между различными переменными, тогда как он учитывает только линейные тренды, уравнение. (3) 22.

где Y представляет ответ, а символы указывают на коэффициент регрессии, а k - количество изучаемых факторов. Всего было изучено 9 факторов для достижения максимальной концентрации LiP из Phanerochaete chrysosporium NK-1 для обесцвечивания меланина, присутствующего в среде. План Плакета-Бермана был построен из 12 полных экспериментальных циклов, как показано в Таблице 2. Эксперименты проводились в общей сложности в течение 35 дней, и измерялся ответ (активность LiP МЕ/мл). Экспериментальные данные были проанализированы с использованием статистической программы «Design Expert 9». Оптимизированную среду использовали для усиленного производства LiP и очищали осаждением аммония.

Оптимизация производства и очистки ферментов.Погружную среду использовали для определения оптимального времени инкубации с точки зрения активности LiP. Как показано на дополнительном рис. 1, культуральный раствор имеет максимальную ферментативную активность на 8-й день, составляя 140 МЕ/мл. Поэтому для получения раствора фермента использовали время инкубации 8 дней.

Всего было проведено 12 экспериментов для определения факторов (9), влияющих на активность LiP. Среди тестов значения ответа активности LiP колеблются от 171 МЕ/мл до 576 МЕ/мл, как показано на дополненном рис. 10 (547 МЕ/мл). Согласно регрессионному анализу, температура, время, концентрация глюкозы, концентрация субстрата и медиатор оказывают положительное влияние на активность LiP. Эффект дрожжевого экстракта оказался незначительным. Негативное влияние оказывают и другие факторы. Оптимальные условия для производства ЛиП: время: 35 дней, температура: 40 градусов, глюкоза (на литр): 20 г, фруктоза: 10 г, дрожжевой экстракт: 2 г, пептон: 2 г, инокулят: 10 мл, субстрат-медиатор: 0,1 мл. Затем эти условия использовали для усиленного производства LiP, который очищали методами осаждения аммония и гель-хроматографии (Sephadex G-75).

Экстракцию фермента проводили при оптимизированных значениях pH, температуры и времени инкубации. Гель-фильтрационную колонку Sephadex G75 использовали для отделения фракции белкового содержимого от клеточного лизата относительно градиента плотности в соответствии с инструкциями производителя. Обилие белков в неочищенном экстракте также указывалось по количеству полос, которые появлялись при анализе на додецилполиакриламидном геле натрия (SDS-PAGE). Молекулярная масса очищенного фермента составляла 46,0 кДа, рассчитанная на основе анализа SDS-PAGE (дополненная рис. 3). Ферментативная активность после осаждения аммонием и очистки гель-хроматографией составляет 684,0 и 957,6 МЕ/мл соответственно.

Очищенный фермент использовали для обесцвечивания меланина при различных физико-химических условиях, включая рН, температуру, время инкубации и концентрацию фермента. Синтетический меланин (B049-97-6) использовали в качестве модельного меланина во всех экспериментах по обесцвечиванию меланина в соответствии с 23.

Эксперименты по обесцвечиванию.Влияние pH на обесцвечивание меланина. Чтобы наблюдать влияние рН на обесцвечивание меланина под действием LiP, реакции обесцвечивания меланина проводили при рН от 2,0 до 6,0. Реакционная смесь содержала 10 мкл неочищенного фермента, растворенного в буфере ТЕ, и 1990 мкл 0,02% масс./об. меланина. Эти реакции проводили как в присутствии ВК, так и в его отсутствие. Реакционные смеси инкубировали при температуре 30 градусов в течение 6 часов. Параллельно проводили контрольные эксперименты с заменой активного LiP на денатурированный фермент, прокипяченный при 95°С. Реакционные смеси контролировали на обесцвечивание меланина с помощью спектрофотометра при длине волны 540 нм до и после инкубации. Эффективность обесцвечивания фермента выражали в процентах (%). Обесцвечивание меланина рассчитывали по уравнению (4) 11.

Влияние времени инкубации на обесцвечивание меланина. Для оптимизации времени инкубации реакции обесцвечивания меланина проводили при времени инкубации от 2 до 10 ч. Реакционная смесь содержала 10 мкл неочищенного фермента, растворенного в буфере, и 1990 мкл 0,02% масс./об. меланина при рН 4 в присутствии и в отсутствие ВА. Затем реакционные смеси инкубировали при температуре 30 градусов и определяли процент обесцвечивания меланина.

SEM-анализ деградированного меланина. Морфологические изменения поверхности меланина анализировали с помощью сканирующей электронной микроскопии (JEOL JSM-5910, Пибоди, Массачусетс, США) 24. В качестве контроля использовали необработанный меланин. Образцы высушивали и закрепляли на медных шпильках (10×10 мм2) двухсторонней углеродной лентой (липкой с обеих сторон). Заготовки промывали детергентом и сушили с помощью сушилки с тепловым пистолетом (KADA 85U/SMD) при 200°С в течение 2 мин перед фиксацией образцов. Для обеспечения проводимости электронного луча использовалась серебряная паста (SPI-CHEM, Западный Честер, Пенсильвания, США). Золото осаждали на образец с помощью плазмы, созданной в условиях высокого напряжения (ток 25 мА в течение 50 с) и вакуума (10–2 атм). Морфологию поверхности образцов исследовали при увеличении 3000.

FTIR-анализ обесцвеченного меланина.Реакции или образцы, показавшие наибольшее обесцвечивание меланина в эксперименте по оптимизации, дополнительно анализировали с помощью ИК-Фурье-спектроскопии (модель № 56, Merlin, Германия). Образцы были центрифугированы (10, 000 об/мин в течение 1 мин) и высушены на воздухе в качестве этапа подготовки к анализу FTIR 20. Качественный анализ образцов меланина был выполнен с использованием УФ-видимого ближнего инфракрасного (БИК) спектрометра. Лямбда 900/Перкин Элмер Инструментс. Спектры регистрировали в диапазоне от 1000 до 3500 см–1. Образцы готовили в таблетках KBr с порошковой дисперсией. Необработанный синтетический меланин использовали в качестве контроля в этом анализе.

Цитотоксичность деградированного меланина и LiP.Тесты на летальность артемии были проведены для проверки цитотоксичности деградированного меланина 14,15. Яйца артемии вылуплялись в прямоугольной посуде с искусственной морской водой. Тарелка содержала пластиковую перегородку с небольшими отверстиями, которая делила тарелку на два неравных отсека. Яйца в большом отсеке были покрыты пятнами и закрыты, чтобы избежать проникновения света, тогда как меньший отсек освещался сверху лампой. Вылупившиеся личинки привлекались светом в сторону небольшого отсека. Через 48 ч инкубации зрелые науплии собирали из освещенного отсека с помощью пастеризованной пипетки.

Статистический анализ.Экспериментальные данные были проанализированы с использованием статистической программы «Design Expert 9». Графические изображения были нарисованы с использованием трех экспериментальных испытаний с рассчитанным стандартным отклонением. Статистическую значимость экспериментального запуска рассчитывали с помощью ANOVA.

Доступность данных

Рекомендации

4. Кларксон, Т.В., Магос, Л. и Майерс, Г.Дж. Токсикология ртути – текущее воздействие и клинические проявления. Н. англ. Дж. Мед. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Местное лечение мелазмы и поствоспалительной гиперпигментации. Кожная терапия Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Хьюз Дж. и Растин М. Кортикостероиды. клин. Дерматол. 15, 715–721 (1997).

7. Плонка П. и Грабацка М. Синтез меланина в микроорганизмах: биотехнологические и медицинские аспекты. Акта Биохим. пол. 53, 423–443 (2006).

8. Лим, Ю.-Дж. и другие. Ингибирующее действие арбутина на биосинтез меланина β-меланоцитов, стимулирующих гиперпигментацию, индуцированную гормоном, в культивируемых коричневатых тканях кожи морской свинки. Арка Фармацевтическая рез. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Новый взгляд на средства для осветления кожи. Междунар. Дж. Космет. науч. 25, 169–181 (2003).

10. Рэтто, М., Чатани, М., Ричкоф, А.-К. и Виикари, Л. Скрининг микроорганизмов на предмет обесцвечивания меланинов, продуцируемых грибками синевы. заявл. микробиол. Биотехнолог. 55, 210–213 (2001).

11. Нагасаки К. и др. Очистка, характеристика и клонирование генов Ceriporiopsis sp. пероксидазы штамма MD-1, которые обесцвечивают меланин волос человека. заявл. Окружающая среда. микробиол. 74, 5106–5112 (2008).

12. Руис-Дуэньяс, Ф.Дж. и Мартинес, А. T. Микробная деградация лигнина: как объемистый неподатливый полимер эффективно перерабатывается в природе и как мы можем извлечь из этого пользу. микроб. Биотехнолог. 2, 164–177 (2009).

13. Холмс, Э.В., Томпсон, К.Д. (Google Patents, 2014).

14. Баравалиа Ю., Вагасия Ю. и Чанда С. Цитотоксичность артемии, противовоспалительные и обезболивающие свойства Woodfordia fruticosa Kurz fowers. Иран. Дж. Фарм. Рез.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Мильхем М.М., Аль-Хиясат А.С. и Дармани Х. Испытание токсичности реставрационных стоматологических материалов с использованием личинок артемии (Artemia salina). Дж. Заявл. Устные науки.

16, 297–301 (2008). 16. Фалад А.О. и соавт. Функциональные возможности лигнинпероксидазы и перспективные применения. Microbiologyopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Обесцвечивание меланина лигнинпероксидазой с помощью H2O2, генерируемого in situ, для применения в отбеливающих косметических средствах (2020).

18. Перес Дж., Муньос-Дорадо Дж., Де ла Рубиа Т. и Мартинес Дж. Биоразложение и биологическая обработка целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина: обзор. Междунар. микробиол. 5, 53–63 (2002).

19. Андерсон М.Дж., Галл К. и Деннинг Д.В. Молекулярное типирование путем случайной амплификации полиморфной ДНК и Саузерн-гибридизации M13 родственных парных изолятов Aspergillus fumigatus. Дж. Клин. микробиол. 34, 87–93 (1996).

20. Сабар, М.А. и соавт. Разложение низкосортного угля Rhizopus oryzae, выделенного из угольной шахты в Пакистане, и его усиленное выделение органических веществ. Топливо 253, 257–265 (2019).

21. Ядав, М., Сингх, С. и Ядава, С. Очистка, характеристика и активность деполимеризации лигнина пероксидазы из Lenzitus betulina MTCC-1183. заявл. Биохим. микробиол. 48, 583–589 (2012).

22. Мохан, С., Вирутагири, Т. и Арункумар, К. Применение дизайна Плакетта-Бермана для скрининга компонентов среды для производства танназы из программной шелухи с использованием погруженной ферментации. Междунар. Дж. Фарм. Рез. Ред. 2, 24–29 (2013).

23. Ву, С.Х., Чо, Дж.С., Ли, Б.С. и Ким, Э.К. Обесцвечивание меланина лигнинпероксидазой из Phanerochaete chrysosporium. Биотехнолог. Биопроцесс. англ. 9, 256 (2004).

24. Карп Дж.М. и соавт. Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека без стадии эмбриоидного тела усиливает остеогенез in vitro. Стволовые клетки 24, 835–843 (2006).

Подтверждение

Вклад автора

Конкурирующие интересы

издательствопримечаниеSpringer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501