Эффекты отбеливания кожи и разглаживания морщин биоактивными соединениями, выделенными из скорлупы арахиса с помощью ультразвуковой экстракции

Контактное лицо:ali.ma@wecistanche.com

Да Хе Гам 1, Джи У Хон 1, Джун Хи Ким 1 и Джин У Ким 1,2,3*

Абстрактный:Методология поверхности отклика использовалась для оптимизации условий экстракции с помощью ультразвука (ЭАЭ) для одновременной оптимизации зависимых переменных, включая активность DPPH по удалению радикалов (RSA), ингибирование активности тирозиназы (TAI) и ингибирование активности коллагеназы (CAI) экстрактов скорлупы арахиса. Влияние основных переменных, включая время экстракции (5,0~55,0 мин, X1), температуру экстракции (26,0~94,0 ◦C , X2) и концентрацию этанола (0.0 процентов ~99,5 процентов, X3) оптимизировали. На основе экспериментальных значений для каждого условия были получены модели квадратичной регрессии для прогнозирования оптимальных условий. Коэффициент детерминации (R2) независимой переменной находился в диапазоне 0,89~0,96, что свидетельствует о том, что регрессионная модель подходит для прогнозирования. При прогнозировании оптимальных условий ЭМА на основе метода наложения были определены время экстракции 31,2 мин, температура экстракции 36,6 ◦C и концентрация этанола 93,2%. В этих условиях были предсказаны RSA 74,9 процента, TAI 50,6 процента и CAI 86,8 процента, что свидетельствует о хорошем согласии с экспериментальными значениями. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией показала, что экстракт скорлупы арахиса снижает уровень мРНКтирозиназагены -родственного белка-1 и матриксной металлопротеиназы-3 в клетках B16-F0. Таким образом, мы определилиотбеливание кожии действие экстрактов скорлупы арахиса против морщин на уровне белка, а также экспрессии генов, и результаты показывают, что скорлупа арахиса является эффективным косметическим материалом дляотбеливание кожии эффекты против морщин. Основываясь на этом исследовании, скорлупа арахиса, которая считалась побочным продуктом, может быть использована для разработки здоровой пищи, лекарств и косметики.

Ключевые слова:скорлупа арахиса; оптимизация;отбеливание кожи; против морщин; антиоксидант;тирозиназа; коллагеназа; белок, родственный тирозиназе человека-1 (TRP-1); матричная металлопротеиназа (ММП)

Нажмите, чтобы органическиЦистанхе отбеливающие средства по уходу за кожей.

1. Введение

Меланин представляет собой полимерный пигмент коричневого или черного цвета, который синтезируется из меланосом меланоцитов в эпидермисе. Его основная функция заключается в блокировании ультрафиолетовых (УФ) лучей для защиты кожи. В качестве альтернативы, его чрезмерное производство может вызвать потемнение пигмента, такое как меланодермия, родинки и пигментные пятна [1-3]. Тирозиназа является основным ферментом, который катализирует реакции автоокисления и полимеризации, посредством которых тирозин превращается в допахинон через дигидроксифенилаланин и продуцирует меланин посредством дофахрома во время биосинтеза меланина [4]. Таким образом, он широко используется для уменьшения или ослабления выработки меланина путем ингибированиятирозиназаактивность с целью усиления отбеливающего эффекта косметических средств [5]. Быстрая индустриализация и более широкое использование хлорфторуглеродов серьезно повредили защитный озоновый слой земли, что привело к тому, что большее количество ультрафиолетового излучения достигло земли и обнажило кожу. Это увеличение УФ-излучения, следовательно, вызывает активное образование активных форм кислорода (АФК) в организме человека, таких как супероксид-анионы, перекиси водорода и гидроксильные радикалы. Такие виды способствуют непрерывному окислению тирозина, что приводит к увеличению производства меланина. В связи с этим активно ведутся исследования по ингибированиютирозиназаактивности, а также удаление АФК с целью развитияотбеливание кожиагенты [6]. Коллаген является основным внеклеточным матриксом, который составляет 90 процентов дермы. Коллаген защищает и придает эластичность коже, участвует в механической жесткости кожи, резистентности, связывании соединительной ткани, пролиферации и дифференцировке клеток [7]. Белки, составляющие внеклеточный матрикс, такие как коллаген, расщепляются коллагеназой, такой как матриксная металлопротеиназа (ММП), вызывая появление морщин, снижение эластичности и дряблость кожи [8]. Различные типы ММР, которые экспрессируются АФК, гидролизуют цепь коллагена, соединительную ткань кожи и генерируют ее аномальное сшивание, увеличивая распад коллагена и ускоряя образование морщин [9]. По этой причине ингибирование выработки меланина и разложения коллагена за счет снижения образования АФК было основным направлением отбеливания кожи и предотвращения морщин [10]. - косметика против морщин, широко используемая в последние годы. Однако применение этих материалов ограничено, учитывая их неустойчивость в присутствии света и тепла, а также побочные реакции, включая раздражение кожи и контактный дерматит [11]. В связи с растущим интересом к природным антиоксидантам для преодоления недостатков обычных отбеливающих и борющихся с морщинами ингредиентов растительные экстракты стали активно использоваться для разработки биоактивных соединений, благоприятных для кожи и безопасных.отбеливаниеи косметика против морщин [12,13].

Существуют различные методы экстракции, которые в настоящее время используются для извлечения биологически активных соединений из растений. Однако экстракция биоактивных соединений из природных источников, особенно растений, в основном проводилась с помощью методов экстракции растворителем, горячей водой и методом Сокслета, которые показали различные недостатки, включая низкую эффективность экстракции, разложение ингредиентов, низкую стабильность и высокую стоимость операции. [14]. Таким образом, недавно были испытаны методы экстракции, включая ультразвуковую, микроволновую и сверхкритическую экстракцию [15]. В частности, ультразвук представляет собой звуковую волну с частотой примерно 20 кГц и более, что приводит к сжатию, кавитации и разрежению жидкости, тем самым максимизируя молекулярное движение за короткое время для получения высокой эффективности экстракции [16]. Кроме того, преимущество ультразвука заключается в том, что его короткое время экстракции сводит к минимуму разложение биологически активных соединений, и он оценивается как эффективный метод экстракции натуральных ингредиентов с антиоксидантами.отбеливание, и антиморщинистые свойства многих растений и трав [17]. Оптимизация условий экстракции необходима для повышения эффективности экстракции с помощью ультразвука (ЭАЭ), и процесс оптимизации может выполняться либо экспериментальными, либо статистическими методами. Традиционный пошаговый метод, когда все переменные остаются постоянными и изменяются только один фактор за раз, имеет ограничения в определении интерактивных эффектов, если это многовариантный эксперимент. С другой стороны, RSM предоставляет статистическую информацию о корреляции между переменными в многомерных экспериментах, наряду с эффективными экспериментами с использованием минимального количества выборок, а также важные математические и статистические методы для оценки эффективности и пригодности регрессионной модели. широко использовались различные схемы RSM, такие как полный факторный план, план Бокса-Бенкена и центральный композитный дизайн (CCD). Среди них ПЗС очень эффективна и, таким образом, предоставляет много информации о переменных эффектах эксперимента и общей экспериментальной ошибке при минимальном количестве необходимых запусков [18]. Поэтому во многих существующих исследованиях ПЗС широко используется для разработки, улучшения и оптимизации процесса. условия извлечения различных антиоксидантов и других метаболитов из натуральных продуктов.

Арахис (Arachis hypogaea) — однолетнее растение, относящееся к семейству бобовых. Его выращивают более чем в 50 странах мира, включая Южную Корею, Индию, Китай и США [19]. Арахис является богатым источником белка (25 процентов), липидов (47 процентов) и углеводов (16 процентов), а также минералов, витаминов, ниацина, ненасыщенных жирных кислот и андолеиновых кислот [20]. Они потребляются как необработанные или переработанные продукты, включая орехи, сливочное масло и растительное масло. Подсчитано, что ежегодное производство арахиса в мире составляет 4,1 миллиона тонн, а скорлупа арахиса составляет 35-40% от общего веса арахиса [21]. Подсчитано, что ежегодно в качестве побочных продуктов выбрасывается более 1,5 млн тонн скорлупы арахиса. Однако, учитывая, что только часть скорлупы арахиса используется в качестве корма для животных и что большая часть из них сжигается или вывозится на свалки, что приводит к затратам на утилизацию и экологическим проблемам, необходимо производить материалы с высокой добавленной стоимостью, используя скорлупу арахиса, чтобы решить проблему побочных продуктов [22]. ]. Предыдущие исследования антиоксидантов показали, что сообщалось о противовоспалительной активности и борьбе с ожирением экстрактов кожуры арахиса [23,24]. Однако до настоящего времени отсутствуют исследования по производству функциональных косметических материалов для оздоровления.отбеливаниеи разглаживание морщин с помощью биоактивных соединений из скорлупы арахиса. Таким образом, в этом исследовании биологически активные соединения были извлечены из скорлупы арахиса с использованием ультразвуковой экстракции (ЭАЭ), чтобы подтвердить их антиоксидантное, отбеливающее и разглаживающее действие, а также было представлено оптимальное состояние ЭАЭ с использованием метода поверхности отклика (RSM) и повышения функциональности экстрактов. с целью подтверждения возможности его использования в качестве пищевых, косметических и медицинских ингредиентов.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Подгонка моделей RSM

В этой работе температура экстракции, время экстракции и концентрация этанола были выбраны в качестве основных переменных ПЗС с использованием предварительного пошагового эксперимента для определения значимых переменных, влияющих на ЭАЭ (таблица 1).

Затем было построено 17 экспериментальных прогонов, в том числе 3 повтора в центральной точке с использованием 3-переменных и 5-уровневой ПЗС. Экспериментальные ошибки были сведены к минимуму за счет рандомизации экспериментального порядка, чтобы свести к минимуму влияние необъяснимой изменчивости. Экспериментальные и прогнозируемые результаты для активности удаления радикалов DPPH (RSA),тирозиназаингибирование активности (TAI) и ингибирование активности коллагеназы (CAI) показаны в таблице 2.

Для определения корреляции между 17 экспериментальными прогонами экспериментальных условий ПЗС и экспериментальными результатами были предложены модели множественной регрессии для прогнозирования оптимальных уровней этих трех переменных. Путем применения множественного регрессионного анализа к экспериментальным данным зависимые переменные (Y) и тестируемые переменные были связаны следующими уравнениями квадратичной регрессии (таблица 3).

Дисперсионный анализ (ANOVA) — это статистический тест для анализа экспериментальных данных. Он подразделяет общую вариацию в наборе данных на составные части, которые связаны с конкретными источниками вариации, чтобы проверить гипотезу о переменных модели или оценить компоненты дисперсии [25]. Анализ поверхности отклика и ANOVA использовались для определения коэффициентов, оценки статистической значимости условий модели и подбора математических моделей экспериментальных данных, направленных на оптимизацию общей области для переменных отклика [26]. Как установлено моделью, коэффициенты корреляции (R2), используемые для определения взаимосвязи между экспериментальными и прогнозируемыми ответами с помощью регрессионных моделей, находились в диапазоне 0,8862~0,9622. Это говорит о том, что проанализированные переменные процесса объясняют более 88,6% независимых переменных. Программное обеспечение Design-Expert использовалось для расчета коэффициентов уравнений квадратичной регрессии, и пригодность модели была проверена с помощью ANOVA. В соответствии со значением мономиального коэффициента уравнения квадратной регрессии приведены в таблице 4, а порядок приоритета среди основных эффектов независимых переменных следующий: концентрация этанола (Х3) > температура экстракции (Х2) > время экстракции (Х1).

2.2. Влияние условий извлечения на RSA

В таблице 2 показаны экспериментальные данные RSA в соответствии с различными условиями ОАЭ. RSA экстракта скорлупы арахиса был определен в диапазоне от 7,6% до 89,9%. Наибольшее значение RSA было выявлено при следующих условиях экстракции: время экстракции 55,0 мин, температура экстракции 60.{{10}} ◦C, концентрация этанола 5 0.0 процентов (прогон №10). В качестве экспериментального значения было определено самое низкое значение RSA, равное 7,6 процента, при времени экстракции 3 0.0 мин, температуре экстракции 60,0 ◦C и концентрации этанола 0,0 процента (прогон № 13). . Применяя множественный регрессионный анализ, экспериментальные данные и ответы были связаны уравнениями квадратичной регрессии (таблица 3). Статистический анализ показал, что R2 регрессионной модели составляет 0,9308 (p=0,0027), что указывает на то, что это уравнение может объяснить 93,0 процента результатов экспериментальных условий, подразумевая, что модель является высокозначимой и может использоваться для точного прогнозирования. функция отклика.

Влияние отдельной переменной ОАЭ при фиксированных уровнях других переменных на RSA прогнозируется и показано на рисунке 1а. RSA имеет тенденцию увеличиваться, а затем уменьшаться по мере увеличения всех переменных UAE. Концентрация этанола оказала наибольшее влияние на RSA среди трех переменных UAE, тогда как время экстракции и температура экстракции оказали наименьшее влияние на RSA. Этот результат согласуется с результатами ANOVA, в которых концентрация этанола продемонстрировала более значительное влияние (p=0.0002) на RSA, как показано в таблице 4. Влияние взаимодействия между независимыми переменными на RSA было визуализировано с использованием 3D. кривые поверхности отклика. Температура экстракции и время экстракции изменялись одновременно при фиксированном уровне концентрации этанола (рис. 2А). По мере увеличения двух переменных (температуры и времени экстракции) RSA увеличивалась до максимального уровня, а затем снова уменьшалась. Наивысшая RSA была получена при температуре экстракции 56,1 ◦C, что позволяет предположить, что экстракция биоактивных соединений с антиоксидантным потенциалом, таких как полифенолы, увеличивается при разрушении компонентов растительной стенки, таких как лигнин, при температуре до 56,1 ◦C; однако при более высоких температурах RSA снижалась из-за разложения или полимеризации антиоксидантных ингредиентов. На рис. 2B, C показано, что на RSA не оказывало существенного влияния время или температура экстракции, тогда как на RSA значительно влияла концентрация этанола, которая была самой высокой при концентрации этанола 61,0 процента и также снова снижалась. Этот результат согласуется с результатами эксперимента по экстракции Lespedeza cuneata горячей водой, проведенного Kim et al. в котором на RSA больше влияла концентрация этанола, чем температура экстракции, и RSA был максимальным в диапазоне концентраций этанола от 60% до 70% [27]. Эти результаты показывают, что эффективность экстракции бинарным растворителем (вода и этанол) более эффективна для экстракции одним растворителем в ЭМА скорлупы арахиса.

2.3. Влияние условий экстракции на TAI

Тирозиназаэто фермент, который способствует выработке меланина путем окисления тирозина в базальном слое эпидермиса, и ингибирование этого фермента необходимо для усиленияотбеливание кожи [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >температура экстракции (p < {{0}}.0598) > время экстракции (p < 0,4329), что подтвердило, что влияние концентрации этанола было наиболее значительным в TAI.

Чтобы сравнить влияние условий UAE на TAI, график возмущений использовался для оценки влияния отдельных переменных на TAI путем фиксации двух переменных в центральной точке. Как показано на рисунке 1b, TAI показал другую картину по сравнению с предыдущим экспериментом RSA; она увеличивалась с увеличением концентрации этанола, в то время как время экстракции не оказывало существенного влияния на TAI. Значительное пропорциональное увеличение TAI с концентрацией этанола можно объяснить результатами ANOVA. На TAI значительно влиял первичный член концентрации этанола (X3), и (p < 0.05)="" квадратичный="" член="" не="" является="" статистически="" значимым,="" таким="" образом,="" демонстрируя="" сильную="" пропорциональную="" зависимость="" между="" tai="" и="" концентрацией="" этанола.="" трехмерная="" кривая="" поверхности="" отклика="" представляет="" собой="" графическое="" представление="" уравнения="" квадратичной="" регрессии="" и="" результатов="" tai="" в="" зависимости="" от="" температуры="" экстракции="" (x1),="" времени="" экстракции="" (x2)="" и="" концентрации="" этанола="" (x3).="" рисунок="" 3a="" визуализирует="" влияние="" времени="" экстракции="" и="" концентрации="" этанола="" на="" tai.="" результат="" подтвердил,="" что="" время="" экстракции="" не="" оказывало="" существенного="" влияния="" на="" tai,="" тогда="" как="" концентрация="" этанола="" имела="" сильную="" пропорциональную="" зависимость="" от="" tai.="" точно="" так="" же,="" как="" показано="" на="" рисунке="" 3b,="" tai="" больше="" зависел="" от="" концентрации="" этанола,="" чем="" от="" температуры="" экстракции,="" и="" самый="" высокий="" tai="" достигался="" при="" увеличении="" концентрации="" этанола="" до="" 99,5%.="" при="" изучении="" условий="" оаэ="" для="" максимального="" tai="" было="" предсказано,="" что="" максимальные="" значения="" условий="" tai="" составят="" 3{{2{0}},0="" мин,="" 26,3="" ◦c="" и="" 99,5%.="" этот="" результат="" аналогичен="" тому,="" о="" котором="" сообщили="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" в="" исследовании="" биологической="" активности="" листьев="" цитрона,="" когда="" в="" качестве="" растворителя="" для="" экстракции="" использовалось="" 20,0-80,0%="" этанола,="" tai="" увеличивался="" пропорционально="" увеличению="" концентрации="" этанола="" и="" продемонстрировал="" максимальное="" значение="" при="" экстракции="" с="" использованием="" 80-процентного="" этанола.="" это="" говорит="" о="" том,="" что="" использование="" более="" высокой="" концентрации="" этанола="" выгодно="" при="" экстракции="" биоактивных="" соединений="">отбеливание кожиэффект от скорлупы арахиса или других растений.

2.4. Влияние условий экстракции на CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >концентрация этанола (p=0,0240) > время экстракции (p=0,8505), что указывает на значительное влияние температуры экстракции и концентрации этанола на CAI.

На рис. 1с показан график возмущений, на котором зафиксированы две переменные, и визуализируется влияние одной переменной на CAI. Было показано, что влияние всех трех переменных на CAI одинаково, и три переменные показали значительное влияние и увеличили, а затем уменьшили CAI по мере увеличения каждой независимой переменной. В нашем исследовании были разработаны трехмерные кривые отклика поверхности для визуализации взаимодействия двух независимых переменных в CAI с использованием уравнений квадратичной регрессии (рис. 4). Когда концентрацию этанола фиксировали в центральной точке, влияние времени экстракции и температуры на CAI оценивали на рисунке 4A. Поскольку две переменные изменялись одновременно, CAI увеличился до 33,4 мин и 76,8 °C и снова уменьшился после максимального CAI 92,8%. Как показано на рис. 4B, C, CAI имел самое высокое значение при концентрации этанола 64,3 процента, демонстрируя после этого тенденцию к постепенному снижению, что свидетельствует о том, что бинарный растворитель, состоящий из 64,3 процента этанола, более подходит в качестве растворителя для экстракции. Этот результат согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что бинарный растворитель из воды и этанола показал более высокий CAI, чем вода, при экстракции биологически активных соединений из Orostachys japonica, что предполагает, что 50-процентный этанол будет более выгоден для экстракции.отбеливание кожиингредиенты [34]. Максимальный CAI экстракта скорлупы арахиса, предсказанный моделью квадратичной регрессии, составил 94,5%, что было получено при условиях времени экстракции 45,1 мин, температуры экстракции 93,6°C и концентрации этанола 42,3%. CAI, полученный в нашем исследовании, составил 94,5 процента, что более чем в два раза превышает эффекты 39,4 процента и 40,3 процента значений CAI экстрактов зеленого чая, о которых сообщают Oh et al. [35].

2.5. Оптимальные условия экстракции

антиоксидант,отбеливание кожии эффекты против морщин - все это важные функции косметики, и необходимо создать условия, которые могут максимизировать эти три функции одновременно при оптимизации условий ЭАЭ. На рис. 5 показана процедура оптимизации, которая может одновременно максимизировать RSA (Y1), TAI (Y2) и CAI (Y3) путем перекрытия каждого оптимального условия контурного графа, полученного с помощью уравнения квадратичной регрессии. Диапазоны независимых переменных для оптимизации трех переменных были ограничены временем экстракции 5,0~55,0 мин, температурой экстракции 26,{{10}}~94. .0 ◦C, а концентрация этанола 0.0 процентов ~99,5 процентов (таблица 5). В соответствии с индивидуальными оптимальными условиями экстракции, оптимальными условиями ЭАЭ были время экстракции 31,2 мин, температура экстракции 36,6 ◦C, концентрация этанола 93,2% и, при указанных выше условиях, RSA 74,9%, TAI 50,6% и CAI 50,6%. 86.8 процентов было предсказано. Когда прогнозируемые значения RSA, TAI и CAI сравнивались с полученными в ходе эксперимента для проверки, значения из проверочного теста были аналогичны предсказанным значениям, где значения составляли 78,2%, 52,3% и 87,7% соответственно.

2.6. Сравнение Юго-Восточной Азии и ОАЭ

Чтобы подтвердить эффективность экстракции ЭАЭ, мы сравнили RSA, TAI и CAI экстракта скорлупы арахиса, полученного с использованием методов экстракции ЭАЭ и Сокслета (СЭ). Когда SE проводили в обычных условиях SE с использованием 99,5% этанола при 70 ◦C в течение 4 часов экстракции, RSA, TAI и CAI были равны 75,5%, 60,2% и 74,4%, что не соответствовало действительности. сильно отличается от результатов, полученных при оптимальных условиях ЭАЭ. Однако, когда условия СЭ были установлены равными оптимальным условиям ЭАЭ с содержанием этанола 31,2 мин и 93,2 %, RSA, TAI и CAI снизились на 62,0, 28,3 и 45,6 % соответственно. по сравнению с ОАЭ при оптимальных условиях. Преимущество ультразвука в производстве полезных материалов из скорлупы арахиса было оценено как процесс, подходящий для высокой производительности и индустриализации из-за низкого расхода растворителя и короткого времени экстракции.

2.7. Экспрессия мРНК MMP-3 и TRP-1

В меланоцитах млекопитающих меланогенез и гидролиз коллагена контролируются генами TRP и MMP, соответственно, а TRP{{0}} и MMP-3 известны как основные гены регуляции меланогенеза и гидролиза коллагена; поэтому был проведен анализ ОТ-ПЦР лизатов целых клеток клеток B16-F0 и влияние экстракта скорлупы арахиса, полученного из ОАЭ в оптимальных условиях (31,2 мин, 36,6 градуса, 93,2 процента) на экспрессию мРНК MMP-3 и TRP-1. Как показано на рис. 6, экстракт скорлупы арахиса значительно снижал экспрессию MMP-3 и TRP-1 в клетках B16-F0, когда эксперименты по экспрессии генов проводились с арахисом. диапазон концентраций экстракта скорлупы 0~1 мг/мл. Экстракт скорлупы арахиса значительно снижал экспрессию MMP-3 и TRP-1 в 6,1- и 8,7- раз соответственно при дозе 1,0 мг. /мл. Эти результаты свидетельствуют о том, что экстракт скорлупы арахиса ингибирует деградацию коллагена в клетках B16F0 путем инактивации MMP 3 до инактивации MMP-1 и препятствует взаимодействию MMP-9 [36]. Существующие исследования показали, что лечение растительными экстрактами ингибирует экспрессию фактора транскрипции, связанного с микрофтальмом (MITF), путем фосфорилирования протеинкиназы, регулируемой внеклеточным сигналом (ERK). Таким образом, ингибирующий эффект выработки меланина экстрактом скорлупы арахиса объясняется ингибированиемтирозиназаактивность за счет ингибирования экспрессии ERK и MITF [37]. Таким образом, экстракты скорлупы арахиса снижают уровни экспрессии мРНК TRP-1 и MMP-3, что указывает на то, что экстракт скорлупы арахиса обладает сильной ингибирующей активностью в отношении коллагенолиза и меланогенеза, что делает его превосходным косметическим материалом сотбеливание кожии эффект против морщин.

3. Материалы и методы

3.1. Материалы и реагенты

Скорлупа арахиса была куплена в магазине Nonghyup (Гочанг, Чонбук, Корея) 2019 марта, и скорлупа была высушена при 60 ◦C в сухой печи (FC 49, Lab House, Сеул, Корея) в течение 24 часов до сухая масса оставалась постоянной. Высушенную скорлупу арахиса измельчали ​​с помощью кухонного комбайна (Hanil HMF-3800, Сеул, Корея) и затем пропускали через сито с размером ячеек 600 мкм. Этанол был приобретен у Samchun Chemical (95,0% об./об., Сеул, Корея). Реагент Фолина-Чиокальтеу, галловая кислота (97%) и кверцетин были приобретены у Merck (Кенилворт, Нью-Джерси, США). 2,2-Дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), аскорбиновая кислота и 3,4-дигидрокси-L-фенилаланин (L-DOPA) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Все другие химические вещества, использованные в этом эксперименте, были аналитической чистоты и приобретены у Sigma-Aldrich. Все исходные растворы готовили из очищенной деионизированной воды с использованием системы очистки Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Ультразвуковая экстракция и экстракция по Сокслету

Порошкообразную скорлупу арахиса (1 г) помещали в экстракционный сосуд с 10 мл растворителя в каждом и перемешивали с помощью вихревого миксера (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея) для 1 мин. Экстракцию проводили путем циркуляции воды в ультразвуковом экстракторе (250 Вт, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея) с использованием внешнего охлаждаемого термостата-ванны (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Вонджу, Корея). ) с цифровым таймером и регулятором температуры. Экстракцию проводили ультразвуковым аппаратом, оснащенным цифровым таймером и регулятором температуры. Образец подвергался ультразвуковой обработке в течение различных экспериментальных периодов и температур при рабочей частоте 40 кГц. Затем экстракт центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 10 мин (236R, Labogene, Сеул, Корея). После центрифугирования объем пробы доводили до 5 мл и фильтровали через мембранный фильтр 0,2 мкм перед анализом. Для экстракции по Сокслету порошкообразную скорлупу арахиса (5 г) непрерывно экстрагировали 100 мл с использованием 99,5% этанола в течение 4 ч (8 циклов) при максимальной температуре 70°С в аппарате Сокслета. Было показано, что метод экстракции с помощью ультразвука очень эффективен при экстракции масла из виноградных косточек. Преимущество ультразвука по сравнению с обычными методами экстракции как для масла, так и для полифенолов было одинаковым, поскольку выход масла/полифенолов был получен при более низком потреблении растворителя и более коротком времени. время экстракции.

3.3. Экспериментальная дизайн

План эксперимента был выполнен с использованием ПЗС, типа RSM, чтобы минимизировать количество экспериментов и изучить взаимодействие между факторами. Программное обеспечение Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) использовалось для планирования экспериментов, анализа данных и оптимизации условий экстракции для максимизации экстракции биоактивных соединений, содержащих антиоксиданты,отбеливание кожии антивозрастной эффект арахисовой скорлупы. Эксперименты были спланированы в соответствии с CCD, значения диапазона и центральной точки трех представленных независимых переменных были основаны на результатах предварительных экспериментов (таблица 1). ПЗС применяли для прогнозирования оптимальных условий ЭМА для максимизации ответов, включая RSA, TAI и CAI из скорлупы арахиса. В качестве независимых переменных были выбраны три переменные: время экстракции (Х1), температура экстракции (Х2) и концентрация этанола (Х3). Всего было проведено 17 экспериментальных прогонов с тремя повторениями в центральных точках для оценки воспроизводимости. Модель квадратичной регрессии использовалась для сопоставления экспериментальных данных и применялась для прогнозирования переменных отклика, как показано в уравнении (1):

Y= 0 плюс 1X1 плюс 2X2 плюс 3X3 плюс 11X12 плюс 22X22 плюс 33X32 плюс 12X1X2 плюс 13X1X3 плюс 23X2X3 (1)

где Y — прогнозируемый отклик; 0 — константа (перехват); 1, 2 и 3 — коэффициенты регрессии для условий линейного эффекта; 11, 22 и 33 — члены квадратичного эффекта; 12, 13 и 23 — условия эффекта взаимодействия соответственно. Анализ поверхности отклика и дисперсионный анализ использовались для определения коэффициентов регрессии и статистической значимости условий модели, а также для подгонки математических моделей эксперимента [38].

3.4. Активность по удалению радикалов DPPH (RSA)

RSA экстракта скорлупы арахиса был описан Pereira-Caro et al. [39]. Готовили раствор 0.01 мМ DPPH в метаноле (95 процентов) и добавляли 1,25 мл к 0,25 мл разбавленного экстракта. RSA определяли для измерения поглощения при 517 нм с использованием УФ-видимого спектрофотометра (UV1650PC, Shimadzu, Киото, Япония) после 20-минутной инкубации. Бланк готовили с использованием дистиллированной воды, и RSA рассчитывали в соответствии с приведенным ниже (уравнение (2)):

RSA (в процентах)={1 − Abs (образец) / Abs (контроль)} × 100 (2)

3.5. Ингибирование активности тирозиназы (TAI)

ТАИ проводили по модифицированному методу с использованием L-ДОФА в качестве субстрата по Jo et al. [40]. Образцы смешивали с 200 мкл L-ДОФА и 200 мкл калий-фосфатного буфера (pH 6,8) и 200 мклтирозиназа(125 ЕД/мл) добавляли в пробирку и инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Поглощение образца измеряли при 475 нм с использованием УФ-видимого спектрофотометра, и результаты сравнивали с контролем. Для каждой концентрации рассчитывали активность фермента в процентах по сравнению с активностью при анализе с использованием буфера без какого-либо ингибитора, а TAI рассчитывали на основе следующей формулы. (Уравнение (3)):

TAI (в процентах)={1 − Abs (контроль) − Abs (образец) / Abs (контроль)} × 100 (3)

где Abs (контроль) – поглощение буфера плюс коллагеназа; Abs (образец) представляет собой поглощение буфера плюс коллагеназа плюс образец/стандарт.

3.6. Ингибирование активности коллагеназы (CAI)

Измерение ЦАИ экстрактов проводили модификацией методов Вюнша и Хайндриха [41]. Субстрат 4-фенилазобезилоксикарбонил-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA) растворяли в 10 мл буфера до концентрации 1,2 мг/мл, затем добавляли 125 мкл раствора и инкубировали в течение 60 мин. при 37 ◦С. Коллагеназу растворяли в буфере до концентрации 0,4 мг/мл и к буферному раствору добавляли 75 мкл раствора фермента. Ферментно-субстратную смесь инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 30 мин и останавливали реакцию добавлением 75 мкл 20%-ной лимонной кислоты (масса/объем). После добавления 1,5 мл этилацетата слой этилацетата отделяли и измеряли оптическую плотность при 320 нм. Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле.

CAI (в процентах)={1 − [Abs (контроль) − Abs (образец)] / Abs (контроль)} × 100 (4)

где Abs (контроль) – поглощение буфера плюс коллагеназа; Abs (образец) представляет собой поглощение буфера плюс коллагеназа плюс образец/стандарт.

3.7. Поддержание и культивирование клеточных линий

Клетки меланомы B16-F0, продуцирующие меланин, были получены из Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Сент-Луис, штат Миссури, США) с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, 10%, Welgene, Gyeongsan, Korea) и раствора антибиотика пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Трипсин-ЭДТА (Gibco, Grand Island, NY, USA) использовали для трипсинизации клеток. Все используемые материалы были пригодны для клеточных культур.

3.8. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR)

Для измерения изменений уровней экспрессии генов MMP-3 и TRP-1, связанных сотбеливаниепротив морщин, клетки B16-F0 культивировали в 24-луночном планшете, обработанном экстрактом скорлупы арахиса в различных концентрациях в среде DMEM без сыворотки, и инкубировали в течение 24 часов. Необработанный контроль клеток содержался в тех же условиях, что и тестируемая группа, во время эксперимента. Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea). Комплементарную ДНК синтезировали с использованием AmfiRiert Platinum для синтеза кДНК MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Анализ RT-PCR проводили с использованием системы CFX 96 touch PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) для определения уровней мРНК. Были использованы следующие праймеры: MMP-3 смысловой, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 и антисмысловой, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; и TRP -1 смысловой, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 и антисмысловой, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Соответствующий набор упомянутых выше праймеров использовали для амплификации соответствующих генов при следующих условиях циклирования: 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов при 95°C в течение 5 с, 60°C в течение 30 с (для ММП-3). , и 60 ◦C в течение 30 с (для TRP-1) и 72 ◦C в течение 30 с. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали с использованием программного обеспечения Gel Doc TM XR plus System и Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Белок «домашнего хозяйства» -актин использовали в качестве контроля загрузки, предполагая, что уровни экспрессии этих белков остаются постоянными.

4. Выводы

В этом исследовании использовался дополнительный подход к извлечению и использованию биоактивных веществ из сельскохозяйственных побочных продуктов скорлупы арахиса для разработки ингредиентов с добавленной стоимостью для многократного использования. Прежде всего, мы попытались повысить эффективность экстракции биоактивных соединений с антиоксидантным, отбеливающим эффектом и эффектом против морщин, оптимизировав процесс ЭАЭ. Поэтому в этом исследовании использовали ОАЭ для эффективного производства биоактивных соединений сотбеливание кожии эффект от скорлупы арахиса против морщин, а также применили статистическую оптимизацию для одновременного увеличения показателей RSA, TAI и CAI. Условия ЭАЭ были оптимизированы с помощью ПЗС, и было подтверждено, что выбор растворителя и концентрации следует учитывать при экстракции биоактивных соединений из скорлупы арахиса. Путем наложения поверхностей отклика, кривых трех зависимых переменных, времени экстракции 31,2 мин, температуры экстракции 36,6°C и концентрации этанола 93,2% были определены оптимальные условия ЭАЭ. Было подтверждено, что RSA экстрактов скорлупы арахиса очень высок, и можно ожидать увеличения TAI и CAI, которые являются индикаторамиотбеливание кожии против морщин эффекты, соответственно. Оптимизация условий ОАЭ подтвердила увеличение выработки биоактивных веществ в скорлупе арахиса, а также отбеливающую и разглаживающую кожу активность экстракта арахисовой скорлупы за счеттирозиназаи снижение активности коллагеназы. Основываясь на этом, было оценено влияние скорлупы арахиса на уровни экспрессии MMP и TRP, чтобы определить, обладают ли они эффектом отбеливания и борьбы с морщинами на уровне экспрессии генов. экспрессии мРНК, а также ингибирование экспрессии белков MMP-3 и TRP-1. Таким образом, было доказано, что экстракт скорлупы арахиса эффективен приотбеливаниеи улучшение морщин на уровне экспрессии белка и генов. Экстракт арахисовой скорлупы, содержащий ОАЭ, обладает высокой антиоксидантной активностью и отличным эффектом отбеливания кожи и против морщин, что дает скорлупе арахиса большой потенциал в качестве натурального косметического и пищевого ингредиента. Кроме того, считается, что производство биоактивных соединений с использованием ОАЭ может применяться в процессе коммерциализации производства косметики, продуктов питания и фармацевтических материалов, учитывая более высокий выход продукции и снижение затрат на обработку по сравнению с обычными процессами.