Как экстракт цистанхе уменьшает воспалительную гиперплазию

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Уменьшение воспалительной гиперплазии в кишечнике у мышей, склонных к раку толстой кишки, с помощью водного экстракта цистанхе пустынного

Ямин Цзя,1,2 и др.

ЦистанхеDeserticola обычно используется в традиционной китайской медицине для лечения многих проблем со здоровьем, включая синдром раздраженного кишечника или запор. Это исследование было разработано для проверки эффективности водного экстракта C. Deserticola в профилактике колоректального рака на модели мышей. Богатый полисахаридами водный экстракт C. Deserticola готовили путем кипячения порошка его стеблей в дистиллированной воде. В качестве экспериментальной модели использовали нулевых мышей Tgfb1Rag2. Здесь мы показали, что кормление водным экстрактом C. Deserticola значительно уменьшило количество слизистых оболочек.гиперплазиякишечная инфекция Helicobacter у мышей. Этот благоприятный эффект коррелировал со значительной стимуляцией иммунной системы, о чем свидетельствует увеличение селезенки с увеличением количества селезеночных макрофагов и естественных клеток-киллеров, а также с более выраженной цитотоксичностью спленоцитов. Водный экстракт C. Deserticola in vitro усиливал цитотоксичность наивных спленоцитов против клеточной линии рака толстой кишки человека, а в культурах макрофагов усиливал экспрессию синтазы оксида азота II и стимулировал фагоцитоз. В заключение, наши данные показывают, что пероральное введение экстракта C. Deserticola снижаетвоспалительныйгиперпластическийполипы и хеликобактерная инфекция у мышей благодаря его иммуностимулирующей активности, что позволяет предположить, что экстракт C. Deserticola может иметь потенциал для предотвращения воспалительных заболеваний кишечника, включая колоректальный рак. Авторское право © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Ключевые слова: растительная иммуномодуляция;Цистанхеизвлекать; полисахариды; хеликобактер;воспалительныйгиперплазия; колоректальный рак.

Цистанхеизвлекатьможет уменьшитьвоспалительныйгиперплазия

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является третьим наиболее распространенным видом рака у мужчин и вторым среди женщин во всем мире и занимает четвертое место среди наиболее частых причин смерти от рака (8 процентов всех смертей от рака; Ferlay et al., 2010). Эпидемиологические исследования показывают, что с этим заболеванием связаны многие факторы риска, в том числе генетические (например, рак толстой кишки в семейном анамнезе) (Strate and Syngal, 2005) и диетические факторы (например, красное мясо и низкое содержание клетчатки; Chao et al., 2005; Park et al., 2005). др., 2005) ивоспалительныйзаболевания кишечника (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). На сегодняшний день, несмотря на множество новых цитостатиков и усовершенствованные хирургические и радиотерапевтические методы, которые используются для лечения этого заболевания (Cunningham et al., 2010), большая часть больных колоректальным раком все еще остается неизлечимой; по оценкам, в 2008 г. во всем мире от этого заболевания умерло около 608 000 человек (Ferlay et al., 2010). Следовательно, необходимы новые методы лечения, и одним из кандидатов является иммунотерапия. Были оценены различные иммунотерапевтические подходы для лечения колоректального рака, и результаты пока обнадеживают (Burgdorf et al., 2009). Было продемонстрировано, что растительные полисахариды обладают специфической иммунорегуляторной активностью (Jiang et al., 2010), что позволяет предположить, что эти растительные продукты можно использовать в качестве специфического иммуностимулирующего адъюванта против колоректального рака.

ЦистанхеDeserticola Ma, известная в китайской фитотерапии как Rou Cong Rong, была включена в травяные формулы для лечения многих проблем со здоровьем, включая импотенцию, патологические бели и синдром раздраженного кишечника/запор (Jiang and Tu, 2009). Экспериментальные исследования выявили различную биологическую активность различных экстрактов C. Deserticola; Экстракт фенилэтаноидных гликозидов этого растения обладает противоусталостным действием у мышей (Cai et al., 2010), а также обезболивающим и анти-воспалительныйдействие на грызунов (Lin et al., 2002), в то время как его полисахариды стимулируют пролиферацию T- и B-лимфоцитов в культурах лимфоцитов (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Однако эффективность экстракта полисахаридов C. Deserticola в стимуляции иммунного ответа in vivo еще не изучалась.

Тряпка2^-/-у мышей отсутствуют зрелые Т- и В-лимфоциты, а на смешанном фоне (~97% 129 S6 и ~3% CF-1) спонтанно развиваются ассоциированные с воспалениемгиперплазияв кишечнике (Engle et al., 1999). Генетическое введение нулевого аллеля Tgfb1 (ген трансформирующего фактора роста b1 (TGF-b1)) этой линии мышей приводит к дальнейшему прогрессированиюгиперплазияк аденоме и карциноме (Engle et al., 2002), а колит, зависимый от патогенной микрофлоры, необходим для развития рака толстой кишки (Engle et al., 2002), что позволяет предположить, что эта линия мышей представляет собой идеальную модель для изучение потенциальной терапии при лечении колоректального рака, вызванного воспалением/ВЗК. В этом исследовании мы впервые демонстрируем эффективность богатого полисахаридами водного экстракта C. Deserticola в снижениивоспалительныйгиперплазияв этой модели.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Богатый полисахаридами водный экстракт препарата C. Deserticola.

Травяной сбор C. Deserticola был собран доктором Ю. Го (Китайский сельскохозяйственный университет) в автономном районе Внутренняя Монголия, Китай. Порошок цельных высушенных стеблей (300 г) дважды кипятили в бидистиллированной воде: сначала 1 ч в 500 мл воды с последующим сбором надосадочной жидкости, затем 45 мин в 400 мл воды. Супернатанты фильтровали через бумажный фильтр Whatman (среднебыстрый) после каждого кипячения и объединяли. Раствор экстракта сушили лиофилизацией и хранили при 80°С. Конечный продукт составлял около 10 г (выход: ~3%).

Мыши и клеточные культуры. Мыши с дефицитом TGF-b1 (Tgfb1 plus/- Rag2^-/-) на смешанном фоне (~97% 129 S6 и ~3% CF-1) были получены из племенной колонии, содержащейся в свободных от патогенов условиях в виварии Исследовательского центра Джека Белла (Ванкувер, Британская Колумбия). Эти мыши были получены из репозитория Консорциума моделей рака человека на мышах (MMHCC) (Национальный институт рака во Фредерике, штат Мэриленд, США). Мыши C57BL/6 J (B6) (самцы, возраст 8–10 недель) были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Всех животных для экспериментов содержали при обычном содержании и диете (5001 Rodent Diet, LabDiet) после отлучения от груди в возрасте 4 недель, а лечение травами и сбор образцов проводили в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными в соответствии с
протоколы, одобренные Подкомитетом по использованию животных Университета Британской Колумбии.

Как клеточную линию аденокарциномы толстой кишки человека SW480, так и клеточную линию мышиных лейкозных макрофагов RAW 246.7 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), содержащей 10 процент эмбриона быка. сыворотка (FBS) (полная среда DMEM) при 37-C в инкубаторе с увлажненным 5-процентным CO2/95-процентным воздухом. Спленоциты выделяли путем осторожного дробления фрагментов селезенки в фосфатно-солевом буфере (PBS) с последующим удалением эритроцитов с использованием лизирующего буфера (0,15 М NH4Cl, 1,0 мМ KHCO3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 6,8). После повторной промывки PBS спленоциты суспендировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS (полная среда RPMI).

Цистанхеизвлекатьможет уменьшитьвоспалительныйгиперплазия

Лечение экстрактом.

Экстракт трав, называемыйЦистанхеизвлекатьв этом исследовании был окончательно приготовлен путем восстановления высушенного порошка стерилизованной бидистиллированной водой и содержал 2–3 процента (масс./масс.) фенилэтаноидов, 65–70 процентов (масс./масс.) полисахаридов и 0.6–1 процент (масс./масс.) белка на основе следующих анализов: количество фенилэтаноидов определяли по поглощению при 332 нм с использованием ранее описанной спектрофотометрии (Ouyang et al., 2005); содержание полисахаридов измеряли стандартным фенол-сернокислотным методом (Dubois et al., 1956) после осаждения этанолом; и белок определяли с помощью анализа белка Bio-Rad в соответствии с протоколом производителя (Bio-Rad Lab, Геркулес, Калифорния, США). Дозировка экстракта цистанхе составляла 0,4 г/кг/день на основании нашего экспериментального исследования. Среднее потребление воды на взрослую мышь в день составляло примерно 4 мл, а если в 1 мл питьевой воды содержалось 3 мгЦистанхеизвлекать, каждая мышь получала перорально 12 мг экстракта в день. Исходя из того, что средняя масса тела взрослой мыши составляла 30 г, питьевая вода, содержащая 3 мг/млЦистанхеизвлекатьдавали мышам дозу 0,4 г/кг/день. Мышей лечили, давая им питьевую воду ad labium, содержащую 3 мг/млЦистанхеизвлекатьчто пополняли не реже одного раза в двое суток, с двухмесячного возраста в течение трех месяцев в обычном помещении зоозавода.

Гистологическая классификация колоректального рака.

В конце трехмесячного лечения ткани как тонкого, так и толстого кишечника были собраны и вскрыты в продольном направлении с последующим осторожным вымыванием содержимого PBS. Всего было собрано шесть кусочков (каждый длиной 2 см) кишечной ткани от каждой мыши: три из тонкой кишки в проксимальном, среднем и дистальном отделах; два от толстой кишки в проксимальном и дистальном отделах и один от слепой кишки. Все ткани фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Каждый срез окрашивали гематоксилином и эозином (HE) для гистологической классификации колоректального рака. Классификацию заболевания проводили по патологическим признакамгиперплазия, аденому или карциному в каждом образце, как описано ранее (Engle et al., 1999) методом слепого теста. Общее количество каждого патологического изменения (гиперплазия, аденома и карцинома) подсчитывали в двух срезах кишечной ткани для каждой мыши.

Цистанхеизвлекатьможет уменьшитьвоспалительныйгиперплазия

Обнаружение Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) в фекалиях мышей.

Чтобы изучить эффект отЦистанхеизвлекатьрост патологической микрофлоры в кишечнике, H. hepaticus в фекалиях определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифичными праймерами рДНК 16S, как описано ранее (Shames et al., 1995). Приблизительно 200 мг свежих фекалий растворяли в 1 мкл PBS и инкубировали при 5{18}} градусах в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант (200 мл) собирали и смешивали с равным количеством раствора протеиназы К, содержащего 5 процентов (об./об.) раствора протеиназы К с концентрацией 18,7 мг/мл (Fermentas Canada, Burlington, ON, Канада) в буфере для гидролиза (50 мкМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1 М ЭДТА, 0,5% додецилсульфата натрия) и инкубировали при 70°С в течение 30 мин. ДНК из полученного раствора экстрагировали с использованием набора QIAprep Miniprep в соответствии с протоколом производителя (QIAGEN, Миссиссога, Онтарио, Канада).
Амплификацию бактериальной ДНК методом полимеразной цепной реакции проводили в смеси, содержащей {{0}},75 мкл 10 ПЦР-буфера, 0,5 мкл 50 мМ MgCl2, по 0,5 мкл каждого праймера (смысловой: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; антисмысловой: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, по 100 мМ каждый), 0,5 мкл полимеразы Taq, 18,75 мкл не содержащей нуклеаз H2O и 1 мкл неколичественного раствора ДНК фекалий. Смесь для ПЦР нагревали при 94 градусах в течение 5 минут, затем проводили 40 циклов денатурации при 94 градусах в течение 1 минуты, отжиге при 55 градусах в течение 1,25 минут и удлинении при 72 градусах в течение 1,5 минут. ПЦР заканчивали стадией элонгации продолжительностью 10 мин при 72°С. Полученный продукт ПЦР (25 мкл) подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле в трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфере, содержащем 0,5 мг/мл бромистого этидия, и визуализировали в УФ-свете.

Определение макрофагов и естественных киллеров (NK).

Процентное содержание макрофагов и NK-клеток в суспензии спленоцитов определяли с помощью анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Один миллион спленоцитов в буфере FACS инкубировали с подходящей комбинацией антител для различных фенотипов клеток на льду: анти-CD3-флуоресцеинизотиоцианат (FITC) и анти-CD49b-фикоэритрин (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Канада) для CD3 CD49b плюс NK-клетки, и крысиное антимышиное F4/80 плюс в качестве первичного антитела и антикрысиное IgG-FITC в качестве вторичного антитела (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США) для F4/80 плюс макрофаги. Интенсивность флуоресценции для каждого типа клеток измеряли с помощью проточной цитометрии и анализировали путем сравнения с фоновым контролем с использованием программного обеспечения CELLQUEST (BD Biosciences).

Анализ цитотоксичности кальцеин-ацетоксиметил (кальцеин-АМ).

Литическую активность эффекторных спленоцитов в отношении клеток-мишеней SW480 оценивали с помощью анализа цитотоксичности кальцеин-АМ с использованием системы совместного культивирования, как описано ранее (Neri et al., 2001). Вкратце, клетки SW480 метили флуоресцентным красителем кальцеин-АМ следующим образом: 1×10⁶клеток/мл клеток SW480 в полной среде DMEM инкубировали с 15 мкМ кальцеина-АМ при 37°С при периодическом встряхивании. Через 30 минут инкубации клетки тщательно промывали полной средой DMEM для удаления внеклеточного красителя. Меченые флуоресцентным красителем клетки SW480 в полной среде DMEM (0,2 x 10⁶клеток/{{0}}.25 мл/лунку) высевали в 24-луночные планшеты. На основании различных соотношений (12:1, 6:1, 3:1 и 1,5:1) E (эффектор): T (мишень), спленоциты в 0.25 мл полной среды RPMI на лунку добавляли в лунки с клетками-мишенями в трехкратной повторности. Совместные культуры инкубировали при 37°С в 5% CO2 в течение 24 часов. Супернатанты собирали после вращения планшета при 2{26}}00 об/мин в течение 5 мин. Высвобождение кальцеина-AM в супернатант определяли с использованием спектрофлуориметра для микропланшетов (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) при эмиссии 527 нм при возбуждении на 485 нм. Клетки-мишени, инкубированные со смесью 0,25 мл полной среды DMEM и 0,25 мл полной среды RPMI, использовали в качестве контроля фонового или спонтанного высвобождения, а в присутствии 2% тритона X-100 использовали в качестве максимальное управление выпуском. Цитотоксичность спленоцитов рассчитывали следующим образом:

Измерение оксида азота (NO). Оксид азота, выделяемый клетками, быстро окислялся до нитрита в культуральной среде. Поэтому концентрацию нитратов в среде определяли по методу Грисса в качестве измерения продукции NO. Ячейки RAW264.7 (0.25 x 10⁶

клеток/лунку в 0,5 мл полной среды DMEM) в 24-луночных планшетах стимулировалиЦистанхеизвлекать(50–200 мг/мл) и липополисахарид (ЛПС) (10 нг/мл) в качестве положительного контроля. Через 24 часа обработки 50 мл культурального супернатанта сначала смешивали с 50 мл 1-процентного раствора.
сульфаниламида в 5-процентном растворе фосфорной кислоты в 96-луночных планшетах в трех экземплярах и инкубировали в течение 10 мин, затем в каждую лунку добавляли 50 мл 0,1-процентного раствора нафтилэтилендиаминдигидрохлорида в дистиллированной воде. Поглощение измеряли при 550 нм после инкубации в течение 10 минут, а уровень NO/нитрита рассчитывали, используя стандартную кривую с известными концентрациями нитрита натрия.

Цистанхеизвлекатьможет уменьшитьвоспалительныйгиперплазия

Вестерн-блот.

Клеточные уровни синтазы оксида азота II (NOS 2 или iNOS) исследовали с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее (Du et al., 2006). Вкратце, образцы белка (приблизительно 100 мг/образец) фракционировали с помощью 7-процентного SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Полосы белка NOS II идентифицировали с помощью первичных кроличьих поликлональных антител к NOS II (N-20) (разведение 1:500; Santa Cruz Biotech, Санта-Крус, Калифорния, США) и вторичных козьих антител к IgG кролика ( разведение 1:10000; Vector Laboratory, Бурлингейм, Калифорния, США). Комплекс белок-антитело NOS II визуализировали с помощью анализа усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England). Блоты повторно исследовали с использованием анти-b-актинового IgG (Sigma-Aldrich Canada, Оквилл, Онтарио, Канада) для подтверждения загруженного белка в каждом образце.

Анализ на фагоцитоз. Фагоцитоз измеряли по количеству латексных гранул с флуоресцентной меткой (SigmaAldrich Canada, L-3030, модифицированных карбоксилатом, средний размер 2 мм), поглощенных клетками RAW264.7, как описано ранее (Wu et al., 2{{ 9}}07). Вкратце, клетки RAW264.7 (0,1·106 клеток/0,5 мл/лунку) в полной среде DMEM высевали в 24-луночные планшеты и стимулировали 100 мг/млЦистанхеизвлекатьили полную среду DMEM только в качестве контроля. После стимуляции в течение ночи к культурам макрофагов добавляли 2,5 мл флуоресцентных латексных шариков на лунку и инкубировали в течение 2 часов. Для анализа проточной цитометрии клетки отделяли пипетированием после промывки в PBS, а интенсивность флуоресценции фагоцитирующих клеток измеряли с помощью проточного цитометра и анализировали путем сравнения с фоновым контролем (без шариков) с использованием программного обеспечения CELLQUEST (BD Biosciences).

Статистический анализ.

Данные были представлены как среднее плюс стандартное отклонение (SD). Дисперсионный анализ (ANOVA) или t-критерий Стьюдента выполняли при необходимости для сравнения данных между группами. Значение р < 0,05="" считалось="">

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Лечение сЦистанхеизвлекатьснижает частотугиперплазияи инфицирование кишечника H. hepaticus. В течение периода лечения (3 месяца) вес тела и потребление питьевой воды контролировали один раз каждые 2 дня у мышей из группы, получавшей экстракт, по сравнению с группой, получавшей носитель, значимой разницы не было. отмечено (данные не показаны). Однако гистологический анализ показал, что пероральное введениеЦистанхеэкстрактызначительно сократилось количествовоспалительныйгиперплазияв кишечнике (рис. 1), о чем свидетельствует тот факт, что у мышей, получавших воду с экстрактом,гиперплазия(5,00 плюс -2,83 на мышь, n=15), чем те, кто пьет простую воду или транспортное средство (7,53 плюс -3,09 на мышь, n {{9 }}) (экстракт по сравнению с носителем: p=0.0133, t-критерий). Разница в количестве аденомы и карциномы между мышами, получавшими экстракт и носитель, не была статистически значимой, поскольку только у нескольких мышей были эти стадии патологических изменений (данные не показаны).

Рисунок 1. Снижение частоты гиперплазии при лечении водным экстрактом C. Deserticola (Цистанхеизвлекать). Мышей Tgfb1 plus /-Rag2-/- кормилиЦистанхеизвлекатьв питьевой воде (группа «Экстракт») по сравнению с теми, кто употреблял только простую питьевую воду (группа «Автомобиль»). Раковые поражения в кишечнике исследовали гистологически с окрашиванием H&E. (A) Типичное изображение среза здоровой ткани. (B) Типичное изображение гиперплазии на срезе, указанном стрелкой. (C) Число гиперплазий в кишечнике каждого животного подсчитывали с помощью гистологии (p=0.0133, экстракт по сравнению с носителем, n=15). Эта фигура доступна в цвете онлайн на сайте wileyonlinelibrary.com/journal/ptr.

Было продемонстрировано, что микробное содержимое кишечника, особенно инфекция H. hepaticus, необходимо для развития всех стадий рака толстой кишки, включая гиперплазию в Rag2.^-/- мыши (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Чтобы проверить, если лечение сЦистанхеэкстрактыснижение патологической микрофлоры в кишечнике, наличие H. hepaticus в фекалиях мышей, получавшихЦистанхеизвлекатьопределяли с помощью ПЦР по сравнению с контролем носителя. В каждом эксперименте по три мыши на клетку получали экстракт цистанхе или носитель. Образцы стула собирали в конце 14-часового ночного периода после очистки клетки. Как показано на рис. 2, рДНК 16S H. hepaticus в фекалиях была эффективно обнаружена методом ПЦР. В трех отдельных экспериментах (табл. 1) только 20–40% проб изЦистанхе-извлекать-обработанные мыши были обнаружены как ПЦР-положительные, в то время как 60-80 процентов из контрольной группы носителя были положительными (экстракт по сравнению с носителем: p=0.0189, t-критерий, n=3), предполагая, что лечение с помощью Экстракт цистанхе уменьшал кишечную инфекцию H. hepaticus у мышей.

Лечение экстрактом цистанхе увеличивает количество селезеночных макрофагов и NK-клеток.

Иммунный ответ играет ключевую роль в элиминации хеликобактерной инфекции. Проверить, еслиЦистанхе извлекатьлечение влияло на иммунную систему у мышей, склонных к раку толстой кишки, в конце лечения определяли размер селезенки (12 мышей в каждой группе) и количество спленоцитов (шесть мышей, выбранных случайным образом из каждой группы). Селезенки 12 мышей в каждой группе взвешивали, остальных трех мышей в исходный эксперимент не включали. Как показано в таблице 2,Цистанхе-извлекать-мыши, получавшие лечение (0.055 плюс -0,022 г/селезенка), были тяжелее, чем в группе, получавшей носитель (0,038 плюс -0,01 г/селезенка; экстракт по сравнению с транспортным средством: p=0.04, t-критерий). Эти данные были дополнительно подтверждены увеличением количества спленоцитов у мышей, получавшихЦистанхеизвлекать, обозначенное как 7,095 плюс -1,353 (x10⁶ клеток/селезенка) по сравнению с 2,941 плюс -1,492 (x10⁶клетки/селезенка) контрольные мыши в транспортном средстве (экстракт по сравнению с носителем: p=0.002, t-критерий).

Для дальнейшей оценки того,Цистанхеизвлекатьлечение влияло на определенный подтип спленоцитов у мышей, количество селезеночных NK-клеток (CD3^-CD49b^плюсклетки) и макрофаги (FT/80^плюсклеток) подсчитывали с помощью анализа FACS. Процент CD3^-CD49b^плюсклетки в спленоцитахЦистанхе-извлекать-обработанных мышей (32,06 плюс -2,13 %), существенно не отличался от такового у мышей, получавших носитель (28,47 плюс -2,74 %; экстракт по сравнению с носителем: p=0. 3741, t-критерий, n=6), но общее количество NK-клеток в селезенкеЦистанхе-извлекать-обработанные мыши (2,22 плюс - 0,44x10⁶/селезенка) был выше, чем в контрольной группе в автомобиле (0,83 плюс -0,17x10⁶/селезенка; экстракт против носителя: p=0.01, t-критерий, n=6; Рис. 3Б). Аналогичные результаты были получены при исследовании клеток селезенки FT/80 plus; как и в популяции NK-клеток селезенки, разница в процентном содержании клеток селезенки FT/80 plus между мышами, получавшими экстракт (35,25 плюс -7,28 процента), и мышами, получавшими носитель (31,74 плюс -5). 07 процентов) не было значимым (экстракт по сравнению с носителем: p=0,407, n=6), но общее количество селезеночных макрофагов в группе, получавшей экстракт (2,439 плюс -0 .452x10⁶клеток/селезенка) был выше, чем в контрольных группах (1,114 плюс -0,685x10⁶клетки/селезенка; экстракт против носителя: p=0.001, t-критерий, n=6; рис. 3D). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что лечениеЦистанхеизвлекатьможет увеличить общее количество, но не процент или долю подтипов эффекторных спленоцитов, NK-клеток и макрофагов в селезенке.

Рисунок 3. Увеличение количества NK-клеток и макрофагов селезенки при леченииЦистанхеизвлекать. NK-клетки или макрофаги в суспензии спленоцитов определяли с помощью FACS-анализа с комбинированным окрашиванием антител FITC-анти-CD3e и маркером клеток APC-анти-CD49b/Pan-NK (для NK-клеток) или с одним окрашиванием FITC-анти-CD3e. FT/80 (для макрофагов). (A) Репрезентативный график процента NK-клеток селезенки (CD3^-CD49b^плюс) в спленоцитах мышей, получавшихЦистанхеизвлекатьпо сравнению с транспортным средством. (B) Общее количество NK-клеток на селезенку. Данные представлены как среднее плюс -SD в каждой группе (p= 0.01, n= 6). (C) Репрезентативный график процентного содержания селезеночных макрофагов (FT/80 плюс) в спленоцитах мышей, получавшихЦистанхеизвлекатьпо сравнению с транспортным средством. (D) Общее количество макрофагов на селезенку. Данные представлены как среднее плюс -SD в каждой группе (p= 0.001, n=6).

Лечение экстрактом цистанхе стимулирует цитотоксичность спленоцитов in vivo и in vitro.

Иммунный ответ зависел не только от количества спленоцитов, но и от их функции, такой как цитотоксичность. ЭффектЦистанхеизвлекатьвоздействие на функцию спленоцитов (т.е. цитотоксичность) исследовали в кокультурах с клетками SW480. Как показано на рис. 4А, цитотоксичность спленоцитов мышей, получавшихЦистанхеизвлекатьбыл выше, чем у клеток мышей, получавших носитель, на что указывает 39,38 плюс -2,64% высвобождения кальцеина-АМ в совместных культурах обработанных экстрактом спленоцитов с клетками SW480 при 6 :1, 51,11 плюс -2,6 процента при соотношении 3:1 и 57,33 плюс -2,53 процента при соотношении 1,5:1 по сравнению с 27.75- 0,18 процентов в сокультурах спленоцитов, обработанных носителем, с клетками SW480 при соотношении 6:1, 40,97 =-2,85 процентов при соотношении 3:1 и 45,16 плюс -0,18 процентов при соотношении Соотношение 1,5:1 (экстракт по сравнению с носителем: p <0,0001, двусторонний="" anova).="" для="" дальнейшего="" подтверждения="" стимулирующего="">Цистанхеизвлекатьна цитотоксичность спленоцитов, цитотоксичностьЦистанхе-извлекатьОбработанные наивные спленоциты от мышей B6, содержащие функциональные Т- и В-клетки, исследовали в кокультурах с клетками SW480. Как показано на рис. 4B, добавлениеЦистанхеизвлекать(100 мг/мл) значительно увеличивал высвобождение кальцеина-АМ в совместных культурах в зависимости от спленоцитов: 57,64 плюс -3,41 процента при соотношении 12:1, 52,25 плюс { {11}},77 процента при соотношении 6:1 и 45,72 плюс -2,43 процента при соотношении 3:1 по сравнению с 14,36 плюс -0,05 процента при соотношении 12:1 , 20,67 плюс -2,03 процента при соотношении 6:1 и 23,1 плюс -3,73 процента при соотношении 3:1 в нестимулированных совместных культурах (экстракт по сравнению с носителем: p < 0,0001,="" два="" -способ="" дисперсионного="" анализа).="" эти="" результаты="" показывают,="">Цистанхеизвлекатьстимулирует литическую активность спленоцитов. Причина меньшей цитотоксичности при добавлении большего количества эффекторных спленоцитов неизвестна. Одна возможность заключалась в том, что уровень высвобождения кальцеина-АМ в этой системе совместного культивирования мог не точно отражать гибель клеток-мишеней, поскольку кальцеин-АМ мог реабсорбироваться эффекторными спленоцитами после длительного периода инкубации.

Экстракт цистанхе активирует макрофаги

Активация макрофагов является одним из важнейших иммунных ответов против инфекции и развития опухоли (Mantovani et al., 2002, 2008). Для дальнейшего раскрытия механизмов, с помощью которыхЦистанхеизвлекатьлечение уменьшило гиперплазию кишечника и микробное содержание, эффектЦистанхеизвлекатьна продукцию NO и фагоцитоз макрофагов, клеток RAW264.7. Как показано на фиг. 5А, экспрессия белка NOS II повышалась в культурах после инкубации сЦистанхеизвлекать. Эти результаты были дополнительно подтверждены увеличением продукции NO вЭкстракт цистанхе стимулированныйкультур (рис. 5B), о чем свидетельствует 3,88 плюс -0,13 мМ нитрита в 50 мг/млЦистанхеизвлекатьстимулированных культурах клеток RAW264.7 по сравнению с 0.11 плюс -0.12 мМ нитрита в нестимулированных контрольных культурах (односторонний ANOVA, p<>

Фагоцитоз — это клеточный процесс поглощения твердых частиц, таких как бактерии. Как показано на фиг. 5C и D, добавлениеЦистанхеэкстрактыстимулированный фагоцитоз макрофагов, на что указывает большее количество фагоцитирующих клеток (9,8 плюс -0,1 процента), обнаруживаемых вЦистанхе-извлекать-стимулированные культуры макрофагов по сравнению с таковыми (5,2 плюс -0,4 процента) в культурах, стимулированных носителем (экстракт по сравнению с носителем: p=0.0007, t-критерий, n=3) после 2 ч инкубации. Эти данные говорят о том, чтоЦистанхеизвлекатьможет напрямую активировать макрофаги за счет усиления локальной продукции NO и стимуляции фагоцитоза макрофагов в кишечнике мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование впервые демонстрирует, что пероральное введениеЦистанхеизвлекатьзначительно снижает частоту гиперплазии и инфекции H. hepaticus в кишечнике мышей, склонных к раку толстой кишки. Благоприятный эффект отЦистанхеизвлекатьлечение связано с увеличением количества и цитотоксичности селезеночных NK-клеток и макрофагов. Добавление in vitroЦистанхеизвлекатьстимулирует продукцию NO и фагоцитоз в макрофагах. Rag2 с дефицитом TGF-b1^-/-было показано, что у мышей развивается рак толстой кишки (гиперплазия, аденома или аденокарцинома) в возрасте от 3 до 6 месяцев, и было продемонстрировано, чтовоспалительныйочаги всегда связаны с этими опухолевыми поражениями (Engle et al., 1999). Дальнейшие исследования показали, что у этих мышей развитие рака толстой кишки необходимо при наличии инфекции патогенной микробной флорой, поскольку рак толстой кишки полностью устраняется при содержании мышей в стерильных условиях (Engle et al., 2002), а H. hepaticus инфекция также вызывает колит и карциному толстой кишки у Rag2.-/-мыши (Erdman et al., 2003). Точно так же у людей микробный статус и иммунитет хозяина являются ключевыми факторами прогрессирования ВЗК (Fiocchi, 1998), и сообщалось, что карцинома желудка связана с хронической инфекцией или воспалением, вызванными H. pylori (Parsonnet et al., 1991; Эль-Омар и Малфертейнер, 2001). Результаты этих исследований показывают, что желудочно-кишечные инфекции могут играть ключевую роль в развитии рака толстой кишки. Таким образом, воздействие на желудочно-кишечные инфекции может стать терапевтической стратегией для профилактики или лечения рака толстой кишки, а также ВЗК. Наше исследование впервые демонстрирует, что пероральное введениеЦистанхеизвлекатьснижает частотувоспалительныйгиперплазияв кишечнике и количество H. hepaticus в фекалиях у мышей с дефицитом TGF-b1. Благоприятный эффект отЦистанхе извлекатьможет быть связано с его активацией макрофагов, о чем свидетельствует увеличение как продукции NO, так и фагоцитоза после леченияЦистанхеизвлекать(рис. 5), что может ограничивать патогенную микрофлору кишечника, в том числе хеликобактерную (Mantovani et al., 2002, 2008). Как следствие, поражениевоспалительныйгиперплазиябыл уменьшен.

В экстрактах C. Deserticola было обнаружено множество биологически активных соединений, включая фенилэтаноидные гликозиды и полисахариды (Jiang and Tu, 2009). Фенилэтаноидные гликозиды обладают цитопротекторным действием, на что указывает тот факт, что эти соединения предотвращают гибель клеток в культивируемых гепатоцитах и ​​гранулярных нейронах мозжечка (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). В то время как полисахариды стимулируют митоген-индуцированную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов (Wu and Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Хорошо задокументировано, что растительные полисахариды модулируют иммунный ответ (Jiang et al., 2010).Цистанхеизвлекатьсодержит 2-3% фенилэтаноидов и 65-70% полисахаридов, что свидетельствует об иммуномодулирующем эффектеЦистанхеизвлекатьлечение может быть связано с иммунорегуляторной активностью полисахаридов, большинства биологически активных веществ экстракта цистанхе. Однако его иммунные клетки-мишени (например, макрофаги или NK-клетки, или и то, и другое) и молекулярные пути требуют дальнейшего изучения. Кроме того, недавнее исследование показало, что введение растительного фенилэтаноида ацетонида, одного из биоактивных фенилэтаноидов в экстракте C. Deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang and Tu, 2009), оказывает благотворное влияние на снижение уровня декстрана. вызванный сульфатом натрия колит у мышей (Hausmann et al., 2007), что свидетельствует о том, что фенилэтаноиды (2–3 процента) вЦистанхеизвлекатьможет способствовать, по крайней мере частично, его эффективности в снижениивоспалительныйгиперплазия, что также требует оценки в будущем.
В заключение, колоректальный рак является одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, и в большинстве случаев его можно предотвратить. Использование нетоксичных растительных экстрактов может предложить эффективную стратегию предотвращения развития колоректального рака, а также может применяться в качестве химиоадъювантного средства, которое может способствовать усилению химиотерапевтической противоопухолевой эффективности и/или снижению химиотерапевтического эффекта. побочные эффекты. Данные, представленные в этом исследовании, ясно демонстрируют, что лечение водным экстрактом C. Deserticola уменьшает гиперплазию и инфекцию H. hepaticus в кишечнике мышей, склонных к раку толстой кишки. Хеликобактерная инфекция или кишечниквоспалениегиперплазияявляется фактором риска развития колоректального рака. Наше текущее исследование показывает, что использование этой травы может иметь потенциал для профилактики и лечения колоректального рака, особенно у людей с ВЗК.

Подтверждение

YM был поддержан стипендией для аспирантов Китайского стипендиального совета.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов.

Цистанхеизвлекатьможет уменьшитьвоспалительныйгиперплазия

Из: «СокращениевоспалительныйГиперплазияв кишечнике мышей, склонных к раку толстой кишки, водным экстрактомЦистанхеDeserticola от Yamin Jia,1,2 et al.

---Авторское право © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Рез. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Бургдорф С.К., Нильсен Х.Дж., Розенберг Дж. 2009. Иммунотерапия при колоректальном раке. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Противоусталостная активность богатого фенилэтаноидом экстракта изЦистанхепустыня Phytother Res 24: 313–315.
Чао А., Тун М.Дж., Коннелл С.Дж. и др. 2005. Потребление мяса и риск колоректального рака. ДЖАМА 293: 172–182.
Каннингем Д., Аткин В., Ленц Х.Дж. и др. 2010. Колоректальный рак. Ланцет 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Структурная характеристика и иммунологическая активность двух экстрагируемых холодной водой полисахаридов изЦистанхепустынная YC. Ма. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Оксид азота индуцирует апоптоз в эпителиальных клетках почечных канальцев посредством активации каспазы-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M., Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Колориметрические методы определения сахаров родственных веществ. Анальная химия 28: 350–356.

Иден Дж.А., Абрамс К.Р., Мэйберри Дж.Ф. 2001. Риск колоректального рака при язвенном колите: метаанализ. Гут 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori и рак желудка. Curr Opin Gastroenterol 17 (Приложение 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Трансформирующий фактор роста бета1 подавляет неметастатический рак толстой кишки на ранней стадии онкогенеза. Рак Res 59: 3379–3386.
Энгл С.Дж., Ормсби И., Павловский С. и др. 2002. Исключение рака толстой кишки у стерильных мышей с дефицитом трансформирующего фактора роста бета 1-. Рак Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 плюс CD25 плюс регуляторные Т-лимфоциты ингибируют микробно-индуцированный рак толстой кишки у мышей с дефицитом Rag2-. Ам Дж. Патол 162: 691–702.
Ферли Дж., Шин Х.Р., Брей Ф., Форман Д., Мазерс С., Паркин Д.М. 2010. Оценки мирового бремени рака в 2008 г.: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Фиокки К. 1998.воспалительныйзаболевания кишечника: этиология и патогенез. Гастроэнтерология 115: 182–205.
Хаусманн М., Обермайер Ф., Пейпер Д.Х. и др. 2007. Лечение in vivo травяным фенилэтаноидным актеозидом уменьшает воспаление кишечника при колите, вызванном декстрансульфатом натрия. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Цзян М.Х., Чжу Л., Цзян Дж.Г. 2010. Иммунорегуляторные действия полисахаридов из китайской фитотерапии. Экспертное заключение Ther Targets 14: 1367–1402.
Цзян И, Ту ПФ. 2009. Анализ химических составляющих вЦистанхеразновидность. J Хроматогр А 1216: 1970–1979.
Линь Л.В., Се М.Т., Цай Ф.Х., Ван В.Х., Ву Ч.Р. 2002. Антиноцицептивные и анти-воспалительныйдеятельность, вызваннаяЦистанхеDeserticola у грызунов. Дж. Этнофармакол 83: 177–182.
Лукас М. 2010.воспалительныйЗаболевания кишечника как фактор риска колоректального рака. Раскопки Дис 28: 619–624.
Мантовани А., Аллавена П., Сика А., Балквилл Ф. 2008. Воспаление, связанное с раком. Природа 454: 436–444.
Мантовани А., Соццани С., Локати М., Аллавена П., Сика А. 2002. Поляризация макрофагов: ассоциированные с опухолью макрофаги как парадигма поляризованных мононуклеарных фагоцитов М2. Тенденции Иммунол 23: 549–555.
Нери С., Мариани Э., Менегетти А., Каттини Л., Факкини А. 2001. Анализ цитотоксичности кальцеин-ацетоксиметил: стандартизация метода, позволяющего проводить дополнительные анализы восстановленных эффекторных клеток и супернатантов. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Оуян Дж., Ван XD, Чжао Б., Ван Ю.С. 2005. Улучшение производства фенилэтаноидных гликозидовЦистанхеDeserticola, культивированные в эрлифтном биореакторе с внутренней петлей и просеивающим стояком. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Парк Ю., Хантер Д., Шпигельман Д. и др. 2005. Потребление пищевых волокон и риск колоректального рака: объединенный анализ проспективных когортных исследований. ДЖАМА 294: 2849–2857.
Парсоннет Дж., Фридман Г.Д., Вандерстин Д.П. и др. 1991. Инфекция Helicobacter pylori и риск рака желудка. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Актеозид изЦистанхеSalsa ингибирует апоптоз с помощью иона 1-метил-4-фенилпиридиния в гранулярных нейронах мозжечка. Планта Мед 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Идентификация широко распространенной инфекции Helicobacter hepaticus в фекалиях коммерческих колоний мышей с помощью посева и анализа ПЦР. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Синдромы наследственного колоректального рака. Рак вызывает контроль 16: 201–213.
Фон Роон А.С., Риз Г., Тир Дж., Константинидес В., Дарзи А.В., Теккис П.П. 2007. Риск рака у пациентов с болезнью Крона. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Протеомный анализ эффектов пикногенола в макрофагах RAW 264.7 показывает индукцию экспрессии катепсина D и усиление фагоцитоза. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Ву ХМ, Гао ХМ, Цим ​​КВ, Ту ПФ. 2005. Арабиногалактан, выделенный из стеблейЦистанхеDeserticola индуцирует пролиферацию культивируемых лимфоцитов. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-глюканы изЦистанхепустыня J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Гепатопротекторная активность фенилэтаноидов изЦистанхепустыня Планта Мед 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Антиоксидантное действие фенилэтаноидов изЦистанхепустыня Биол Фарм Бык 19: 1580–1585.