Как предотвратить и уменьшить образование камней в почках?

для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Часть Ⅰ Ⅱ: Выворот фосфатидилсерина, регулируемый фосфолипидной скрамблазой, активируемой передачей сигналов TGF-1/Smad на ранней стадии образования камней в почках

Сю Го Гань1 · Хай Тао Сюй1 · Чжи Хао Ван

для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Введение

Мочекаменная болезнь является одним из наиболее распространенных заболеваний человека и связана с многочисленными урологическими осложнениями [1]. Сообщается, что оксалат кальция (CaOx) повреждает культивируемые клетки почечных канальцев, после чего фосфатидилсерин клеточной мембраны (PS) перескакивает с внутреннего слоя на внешний слой in vitro, играя важную роль впочечный каменьформирования [2]. Подобные результаты были получены в различных исследованиях [3-6], проведенных на клеточном уровне. Однако механизм, лежащий в основе экстернализации ФС в клетках почечных канальцев, вызванной CaOx-опосредованным повреждением, остается неясным. Предыдущие исследования показали, что высокая концентрация оксалата кальция приводит к перепроизводству активных форм кислорода (АФК) [7], что впоследствии способствует экстернализации ФС в клетках почечных канальцев, что приводит к зарождению и росту кристаллов СаОх [8]. АФК и перекисное окисление липидов сильно активируют фосфолипидную скрамблазу (PLSCR) [9], тогда как воздействие поглотителей АФК, таких как глутатион, коэнзим Q10 или идебенон (синтетический гомолог кофермента Q10), снижает активацию PLSCR при поликистозной болезни почек [10]. . PLSCR, прикрепленный к клеточной мембране [11], функционирует как один из трех ферментов, переворачивающих фосфолипиды, способных катализировать быстрое двустороннее движение ФС по обеим сторонам мембраны по градиенту концентрации [12]. В физиологических условиях клеточная мембрана находится в асимметричном состоянии, и PLSCR не влияет на мембрану [13]. Однако после повреждения эукариотических клеток PLSCR активируется и перемещает PS из внутреннего слоя во внешний [14,15]. Кроме того, сверхэкспрессия PLSCR в клетках яичника китайского хомячка K1, как сообщается, стимулирует экстернализацию PS, усиливая движение PS наружу к клеточной поверхности во время апоптоза [16]. Поэтому мы предположили, что PLSCR также участвует в экстернализации ФС в клеточной мембране почечных канальцев посредством активации АФК.

Потенциальный молекулярный механизм индуцированной оксалатом продукции АФК происходит посредством индукции передачи сигналов TGF- 1/Smad, которая может играть роль в продукции АФК [17,18]. Действительно, по сообщениям, передача сигналов TGF- 1/Smad вовлечена во множество заболеваний почек, таких как гломерулонефрит, почечный интерстициальный фиброз и нефролитиаз [19]. Более того, мононуклеарные клетки, обработанные TGF- 1, проявляют экстернализацию PS в клеточной мембране, вызывая переключение PS из внутреннего слоя во внешний [20]. Однако, насколько нам известно, взаимосвязь между передачей сигналов TGF- 1/Smad и PS-версией в клеточных мембранах почечных канальцев остается неизвестной. Мы предположили, что TGF- 1 участвует в выворачивании ФС в клеточных мембранах почечных канальцев путем активации PLSCR на ранней стадии крысиногопочечный каменьобразование, опосредованное АФК.

Поэтому мы исследовали, стимулирует ли передача сигналов TGF- 1/Smad экстернализация ФС через активацию АФК и активирует ли TGF PLSCR в клеточной мембране почечных канальцев на ранней стадиипочечный каменьразвитие in vitro и in vivo, заложив тем самым теоретическую основу этиологиипочечный каменьформирование.

Щелкните Цистанхе ДГТ при заболевании почек

материалы и методы

Крысиная модель образования камней в почках CaOx на ранней стадии

Шестьдесят чистых 3-самцов крыс Wistar в возрасте 200±20 г были предоставлены Центром экспериментальных животных Харбинского медицинского университета и содержались при комнатной температуре (22°±2°) и 50-70% влажности. Через 3 дня адаптивного размножения их случайным образом разделили на три группы (по 20 крыс в группе) — контрольную,почечный камень, а такжепочечный каменьплюс SB431542 (ингибитор сигнального пути TGF- 1/Smad).

Почечный каменьобразование инициируется как раннее патологическое изменение после повреждения клеток почечных канальцев [21,22]. Чтобы изучить этот процесс повреждения, крысиная модель ранней стадиипочечный каменьформирование было установлено, так как стандартизированный подход еще не описан. Чтобы наблюдать ранние изменения после повреждения клеток почечных канальцев, мы применили метод, описанный Liet al. [23]. Вкратце, крысам в контрольной группе ежедневно через пероральный желудочный зонд вводили 2 мл дистиллированной воды, тогда как крысам впочечный каменьгруппе вводили 2 мл 1-процентного раствора этиленгликоля и 1-процентного раствора NHCl ежедневно через пероральный зонд. Крысы в.почечный каменьплюс группе SB431542 внутрибрюшинно вводили сорастворитель SB431542 (5 мг/кг, S1067; Selleckchem, Шанхай, Китай) каждые 7 дней [24]. Еду и воду давали вволю. На 14-й день крыс подвергали эвтаназии путем передозировки анестетика (пентобарбитал натрия, 200 мг/кг, путем внутрибрюшинной инъекции) и вырезали их почки. Левые почки были немедленно сохранены в жидком азоте для последующего обнаружения белка. Правые почки фиксировали, обезвоживали и заливали в парафин. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике использования экспериментов на животных Первой дочерней больницы Харбинского медицинского университета (номер разрешения: 2020005, Харбин, Китай).

Кристаллообразование в почечной ткани

Образцы тканей окрашивали по методу Пиццолато [23] и наблюдали кристаллы CaOx под поляризованным световым оптическим микроскопом (Sinico Optical Instrument Co., Шэньчжэнь, Китай). Пиццолато-положительные области измеряли и выражали как промилле возраста общей площади поперечных сечений ткани с использованием ImageJ 1.49v (Национальные институты здравоохранения, США).

Обнаружение ФС в клеточной мембране почечных канальцев in vivo методом проточной цитометрии

Воздействие ФС на почечные эпителиальные клетки оценивали с помощью окрашивания аннексином V, меченным флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), как описано ранее [2]. Клетки наблюдали (в каждой группе) под конфокальным лазерным микроскопом (Olympus, Токио, Япония). Количество экстернализации PS определяли как процент аннексина V-позитивных клеток. Флуоресценцию аннексина V образцов измеряли с использованием проточного цитометра (возбуждение 488 нм/испускание 530 нм; Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США).

Измерение уровней TGF- 1 и Smad7 в клеточной мембране почечных канальцев с помощью вестерн-блоттинга

После извлечения замороженных образцов ткани белок экстрагировали с использованием набора для экстракции белков из природных мембран ProteoExtract (M-PEK) (MERCK Co., Кенилворт, штат Нью-Джерси, США), а концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad. комплект (Геркулес, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Затем 40 мкг белка наносили на 8-процентный SDS-полиакриламидный гель (накопительный гель 100 В, разделяющий гель 200 В) на 1 час при постоянном токе электрода 300 мА. Белки в геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Kexing Co., Пекин, Китай), блокировали в течение 1 часа при 37°С в 5-процентном сухом обезжиренном молоке и инкубировали в течение ночи при 4°С с овечьим анти-крысиным TGF 1 ( ab208466; Abcam, Кембридж, Великобритания) и Smad7 (66,478; Proteintech, Ухань, Китай) [25]. Добавляли меченные пероксидазой хрена вторичные кроличьи антитела против овец (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Пекин, Китай) и инкубировали при 37 градусах в течение 1 часа. Сигнал регистрировали с помощью реагента усиленной хемилюминесценции (Abcam). Положительные полосы анализировали с использованием программного обеспечения для анализа оптической плотности геля Gel-Pro 4.0 и измеряли кумулятивную оптическую плотность (значение IOD), при этом значение R представляло относительное содержание белка следующим образом: R =эталонное значение IOD PLSCR (цель)/эталонное значение IOD GAPDH (эталонный белок).

Культура клеток и РНК-интерференция

Линию почечных эпителиальных клеток (клетки MDCK, CCL34, пассажи 53-90; ATCC, Манассас, Вирджиния, США) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением антибиотиков (10{{1{{14}). }}} Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина; Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) и 10-процентной фетальной телячьей сыворотки (Life Technologies Co.) при 37 градусах в 5-процентном СО, атмосфере и субкультуре с 0,25-процентным трипсина и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (Life Technologies Co., Калифорния, США). Клетки обрабатывали CaOx (0,5 мМ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в течение 2 часов и 0,5 мМ CaOx и 100 мкг/мл нейтрализующего антитела против TGF- 1 (R&D Systems, Миннеаполис). , Миннесота, США) в течение 2 ч. Все опыты проводились в трехкратной повторности.

Чтобы определить роль PLSCR в вывороте PS, эпителиальные клетки почечных канальцев трансфицировали PLSCR siRNA [26]. миРНК была разработана и синтезирована компанией Anhui General Biological System (Аньхой, Китай; см. Таблицу 1). Липофектамин TM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) использовали для трансфекции в соответствии с инструкциями производителя. . Через 24 ч после трансфекции клетки расщепляли трипсином, центрифугировали при 1000×g в течение 5 мин, дважды промывали PBS и снова центрифугировали. Супернатант удаляли, а осадок суспендировали в PBS с образованием суспензии одиночных клеток с плотностью 1×10 градусных клеток/мл. Положительный уровень экспрессии FAM (карбоксифлуоресцеин) составлял 93% ± 5%, как определено с помощью проточной цитометрии. Для дальнейшей оценки взаимосвязи между TGF-1 и PLSCR клетки обрабатывали 0,5 мМ CaOx или 10 нг/мл TGF- 1 в течение 2 часов, а затем трансфицировали миРНК PLSCR.

Измерение уровня PLSCR в клеточных мембранах почечных канальцев методом вестерн-блоттинга

Белок экстрагировали с использованием набора для экстракции белков из природных мембран ProteoExtract (Chemical Book Co., Пекин, Китай), а концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белков Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Пекин, Китай). Затем 40 мкг белка наносили на 8-процентный SDS-полиакриламидный гель (накопительный гель 100 В, разделяющий гель 200 В) на 1 ч при постоянном токе 300 мА. Белки в геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Kexing Co., Шэньчжэнь, Китай) и блокировали 5-процентным обезжиренным молоком в течение 1 ч при 37°С и инкубировали в течение ночи при 4°С с овечьим моноклональным антителом против крысиного PLSCR (1:200, PAB781HuO1, Abcam, Гуанчжоу, Китай). Затем добавляли кроличьи антиовечьи вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (1:400), и смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После промывки мембраны сигнал детектировали с помощью реагента для усиления хемилюминесценции (Abcam, Гуанчжоу, Китай). Положительные полосы анализировали с использованием программного обеспечения для анализа оптической плотности Gel-Pro 4.0gel и измеряли значение IOD, причем значение R представляло относительное содержание белка, как описано выше.

Таблица 1. Последовательности миРНК для PLSCR

Измерение мембранного распределения фосфатидилсерина

Величину выворота ПС клеточной мембраны определяли с использованием метода тушения флуоресценции, описанного Kim et al. [27]. и наша исследовательская группа [2] с нитробензол-2-окса-1,3-диазолом (NBD, Шанхай, Китай) в качестве флуоресцентного зонда. После мечения ФС внешнего слоя клеточной мембраны NBD клетки культивировали в PBS, содержащем 5 мМ диизопропилфторфосфата. После этого добавляли PBS, содержащий оксалат кальция (1,0 мМ), и клетки инкубировали при 37°С. Равное количество клеточной суспензии выпускали каждые 10 мин, а интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра RF-5000 (Shimadzu, Киото, Япония). Настройки спектрофлуориметра были следующими: ширина щели 10 нм для длины волны излучения 530 нм; ширина щели 5 нм для длины волны возбуждения 470 нм. Затем регистрировали среднее значение флуоресценции (FT) за 50 с. Среднее значение сниженной интенсивности флуоресценции (FD) регистрировали также после использования раствора дитионита для тушения NBD-флуоресценции из внешнего слоя клетки. После этого добавляли 1% (мас./об.) Triton X-100 для повышения проницаемости клеточной мембраны. Затем флуоресценцию NBD от внутреннего слоя клеточной мембраны гасили и регистрировали интенсивность флуоресценции (FO). Процент NBD-PS во внутренних дольках был позже рассчитан с использованием следующего уравнения: процентный возраст интернализированного NBD-PS=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Процент экстернализации PS определяли в соответствии с принципом, используемым для измерения интернализации NBD-PS. Процент NBD-PS в наружных дольках также рассчитывали с использованием следующего уравнения: процент NBD-PS в наружных дольках =100 × [(FT-FD)/(FT-FO)].

статистический анализ

Непрерывные переменные выражены как среднее ± стандартное отклонение. Использовали непараметрический парный критерий суммы рангов, t-критерий и критерий хи-квадрат. Все анализы проводились с использованием программного обеспечения SPSS 19.0(SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Результаты с P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Полученные результаты

Передача сигналов TGF- 1/Smad стимулирует экстернализацию PS in vivo

Кристаллообразование в почечной ткани крысиной модели

Для создания крысиной модели ранней стадиипочечный каменьобразования, этиленгликоль и хлорид аммония вводили в желудок крыс в течение 2 недель, а затем каждый срез почки исследовали с помощью цифрового микроскопа. В образцах контрольной группы наблюдались нормальные структуры почечных канальцев без образования кристаллов на 14-й день (рис. 1А). Когда ткань почки изпочечный каменьгруппе при микроскопии почечные канальцы выглядели расширенными с видимыми микрокристаллами; в некоторых почечных канальцах наблюдалось случайное накопление кристаллов СаОх, что указывает на успешное создание крысиной модели ранней стадиипочечный каменьобразование и повреждение клеток почечных канальцев.

Наличие ФС в клеточной мембране почечных канальцев

Аннексин V-FITC, флуоресцентная молекула, которая связывается с ФС на поверхности клетки, широко используется для обнаружения перераспределения ФС. В нашем исследовании клетки MDCK в нормальном контроле,почечный камень, а такжепочечный каменьплюс группы SB431542 наблюдали под конфокальным лазерным микроскопом (фиг.1В). Скорость PS-эверсии увеличилась впочечный каменьгруппе по сравнению с контрольной группой (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">почечный каменьплюс группа SB431542 показала более низкий базальный уровень экстернализации ФС, чем в группепочкакаменьгруппа (П<0.05, fig.="" 1c,="">

Измерение уровней TGF- 1 и Smad7

Уровень TGF- 1 впочечный каменьгруппу определяли методом вестерн-блоттинга. Типичный вестерн-блот показан на рис. 2А вместе с денситометрическим анализом уровня TGF- 1. Значения нормализовали к значениям контроля и выражали как отношение TGF- 1 к тубулину. Добавление этиленгликоля и NHCl значительно повышало уровень TGF- 1 и снижало уровень Smad7 по сравнению с таковыми в контрольных клетках (рис. 2А); однако обработка SB431542 плюс этиленгликоль и NH Called значительно снижала уровень TGF- 1 и повышала уровень Smad7 по сравнению с клетками, обработанными этиленгликолем и NH, Cl.

TGF активирует активность PLSCR в клеточной мембране почечных канальцев in vitro.

PLSCR

Уровень PLSCR оценивали вестерн-блоттингом. Клетки обрабатывали CaOx в течение 2 часов. Уровень PLSCR был незначительным в контрольных клетках, но значительно увеличился в группе CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Нарушение внутреннего движения NBD-PS

Мы определили внутреннее и внешнее движение PS в мембране эпителиальных клеток почечных канальцев для оценки активности PLSCR. Чтобы оценить, влияет ли PLSCR на движение ФС от внешнего листка к внутреннему листку плазматической мембраны, мы интегрировали флуоресцентно меченый ФС (NBD-PS) во внешний листок плазматической мембраны и наблюдали за его интернализацией (рис. 3). Количество NBD-PS, усвоенного клетками MDCK в контрольной группе и группе CaOx, составляло примерно 46,2% и 17,8% соответственно. Следовательно, скорость интернализации ФС в клетках группы CaOx была значительно ниже, чем в клетках контрольной группы (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Рис. 1. Образование кристаллов и экстернализация PS наблюдались в контрольной группе, группе с камнями в почках и группе с камнями в почках плюс SB431542.

(А) Кристаллообразование в почечной ткани на 14-й день; стрелка указывает на микрокристаллические структуры. (B) клетки MDCK наблюдали с помощью конфокальной лазерной микроскопии.

(C) Проточные цитометрические графики скорости выворота. (D) Скорость выворота (в процентах). Треугольник указывает P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">почечный каменьгруппа

Усовершенствованное движение NBD‑PS наружу

Чтобы определить, влияет ли оксалат на внешний транспорт PS, клетки MDCK внутриклеточно метили NBD-PS, и определяли степень его перемещения в листок примеров-микробов. Среда для инкубации содержала альбумин бычьей сыворотки (1% мас./об.), который быстро экстрагировал экспрессированный на поверхности NBD-PS. Приблизительно 34,5% NBD-PS мигрировали к внешнему листку в контрольных клетках, тогда как скорость переноса наружу PS в клетках группы CaOx была увеличена до 75,3% по сравнению с общим внутренним меченым NBD-PS, что было значительно выше, чем у всех NBD-PS с внутренней меткой. что в клетках контрольной группы (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Рис. 2 Экспрессия TGF- 1/Smad в контрольной группе, группе почечных камней и почечных камней плюс SB431542 и экспрессия PLSCR в клеточной мембране почечных канальцев.

(A)Выражение TGF- 1/Smad. (B) Относительные уровни фосфолипидной скрамблазы (PLSCR) и репрезентативный блот с экспрессией, нормализованной к экспрессии GAPDH.P<>

Треугольник указывает P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅱ