Врожденный иммунный ответ на голодание и возобновление питания в почках рыбок данио

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Цзунчжэнь Ляо, Дихан Линь, Джиронг Цзя, Ран Цай, Ян Юй и Вэньшэн Ли *

Ключевая государственная лаборатория биоконтроля, ключевая лаборатория водных экономических животных провинции Гуандун, научно-исследовательский центр инженерных технологий провинции Гуандун для здорового разведения важной экономической рыбы, школа наук о жизни, университет Сунь Ятсена, Гуанчжоу 510275, Китай;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (ГГ)

* Переписка: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Цистанхе очень хорошо влияет на функцию почек.

Абстрактный: Животные получают питательные вещества и энергию через кормление, чтобы достичь баланса между ростом и здоровьем организма. Когда происходит изменение в усвоении питательных веществ, изменяется состояние роста, что также может вызвать изменения в собственной иммунной системе. Компенсаторный рост (КГ), специфический феномен роста, включает вопрос о том, могут ли изменения в росте сопровождаться изменениями врожденного иммунитета. Данио рерио (Danio rerio), хорошо известный модельный организм рыб, может служить подходящей моделью. В этом исследовании рыбки данио подвергались 3-недельному голоданию и повторному кормлению в течение 3-7 дней. Было обнаружено, что CG может быть достигнута у рыбок данио. Восприимчивость рыбок данио к Streptococcus agalactiae увеличилась после голодания. Кроме того, количество центров меланомакрофагов увеличилось после голодания, а доля поврежденных канальцев увеличилась после возобновления питания в течение 3 и 5 дней соответственно. Кроме того,почкирыбок данио, страдающих от голодания, подвергались окислительному стрессу, и после голодания повышалась активность нескольких антиоксидантных ферментов, включая каталазу, глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазу. На параметры врожденного иммунитета влияло голодание. Кроме того, после голодания повышалась активность щелочной фосфатазы и лизоцима. Экспрессия мРНК генов, связанных с иммунитетом, таких как il-1, повышалась в разной степени после голодания с или без введения липополисахаридов (LPS). Это исследование показало, что на функцию врожденной иммунной системы у рыбок данио может влиять статус питания.

Ключевые слова: врожденная иммунная система; почка; окислительный стресс; компенсаторный рост; данио

1. Введение

Основные виды жизнедеятельности зависят от энергообеспечения организма. Питательный статус организма животного может влиять на функционирование иммунной системы [1,2]. Компенсаторный рост (КГ) – это период быстрого роста после фазы подавления роста, что может быть вызвано дефицитом пищи и другими факторами внешней среды [3,4]. Впервые это явление было зарегистрировано у млекопитающих, а затем было обнаружено у птиц [3] и костистых рыб [5]. КГ делится на две фазы: катаболическую фазу и гиперанаболическую фазу [6]. Один из основных паттернов CG — голодание и повторное питание. После повторного кормления у рыб может наблюдаться частичная, полная, избыточная или отсутствующая компенсация [4]. Особый режим кормления ЦГ рассматривается как потенциальный способ повышения эффективности производства разводимых видов [7].

Врожденный иммунный ответ является первой границей защиты хозяина, защищая организмы от патогенов. У рыб к органам иммунной системы относятся тимус,главапочка, хвостовая почка, жабры, печень,и кишечник [8,9]. Широкий спектр типов клеток принимает участие в неспецифических клеточных защитных реакциях у рыб, включая моноциты/макрофаги, неспецифические цитотоксические клетки и гранулоциты (нейтрофилы). Иммунометаболизм представляет собой взаимодействие иммунологических и метаболических процессов [10]. Метаболический статус рыб может влиять на их иммунную функцию. У людей состояние питания влияет на количество иммунных клеток и их активность [11]. Было обнаружено, что на функцию иммунной системы мышей может влиять их метаболический статус [12–14]. Прерывистое голодание у карася (Carassius auratus) изменило бактериальное сообщество кишечника и повысило активность супероксиддисмутазы (СОД) и лизоцима [15]. Голодание также изменяет экспрессию генов врожденных иммунных реакций в печени лосося [16]. Кроме того, исследования влияния метаболического состояния на иммунную систему можно найти и у других костистых рыб [17–19]. Однако влияние метаболического состояния на иммунную систему костистых рыб еще недостаточно изучено. Окислительный стресс может ограничивать функциональность врожденной иммунной системы и индуцировать такие компоненты, как толл-подобные рецепторы [20,21]. Между тем голодание может увеличить выработку АФК и вызвать аутофагию [22,23]. Было бы целесообразно выяснить, опосредует ли окислительный стресс взаимосвязь между голоданием и иммунитетом.

Рыбка данио (Danio rerio) широко применяется в качестве модели при изучении иммунитета и болезней. Врожденная иммунная система рыбок данио начинает развиваться на 1-й день эмбриогенеза, а адаптивная иммунная система отсутствует до 4-6 недель после оплодотворения. Это делает рыбок данио отличной моделью для изучения врожденной иммунной системы [9]. Почки являются первичным лимфоидным органом у рыбок данио [24]. Ген havcr1 кодирует трансмембранный канальцевый белок, называемыймолекула повреждения почек-1 (КИМ-1) [25]. KIM-1 является индикатором повреждения ткани в почках, а сверхэкспрессия KIM-1 вызывает повреждение почек у рыбок данио [26]. Было обнаружено, что голодание может изменить состояние метаболизма у рыбок данио [27]. Голодание приводило к снижению потребления кислорода и содержания липидов в печени и гликогена. Он также повышал активность 8-окисления и глюконеогенеза в печени. В то же время активные формы кислорода (АФК) принимали участие в ХГ у рыбок данио [28]. АФК, продуцируемые в печени, были необходимы для CG у рыбок данио, поскольку они индуцировали путь AMPK. В настоящем исследовании мы приняли стратегию голодания и повторного кормления, чтобы изучить характер ХГ у рыбок данио. Streptococcus agalactiae вызывает тяжелый сепсис и менингит у рыбок данио и может инфицировать более 30 видов рыб [29]. Мы выбрали Streptococcus agalactiae и липополисахариды (LPS) для инъекций, чтобы изучить влияние CG на врожденную иммунную систему в сочетании с изменениями иммунных параметров и экспрессии генов.

2. Материалы и методы

2.1. Рыбки данио, режимы кормления и масса тела

Взрослые рыбки данио, использованные в эксперименте, были приобретены на рынке рыб-птиц-цветов Юэхэ (Гуанчжоу, Китай) и акклиматизированы в течение двух недель. Все выращивание рыбы осуществлялось на экспериментальной станции рыбоводства в Университете Сунь Ятсена, провинция Гуандун, Китай. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями и одобрением Комитета по уходу и использованию животных Университета Сунь Ятсена. В экспериментальный период pH колебался от 7,8 до 7,9, растворенный кислород – от 6,95 до 7,23 мг/л, температура воды – от 26,5 до 28 °С. Концентрации аммиачного азота и нитратного азота поддерживались ниже 0,2 и 0,{{20}}05 мг/л соответственно. Соленость воды составляла 0,2 промилле. Рыбки данио содержались при 12-часовом цикле свет-темнота. Чтобы изучить изменения массы тела во время голодания и возобновления питания, массу тела регистрировали один раз в неделю. Исходная масса тела рыбок данио в эксперименте составляла 0,35 ± 0,06 г, а возраст их составлял примерно 3 мес. Рыбок данио случайным образом распределяли по 24-литровым аквариумам, в каждом из которых содержалось по 30 рыб. Им предлагали коммерческую диету два раза в день с насыщением. Режимы кормления для каждого эксперимента показаны в Таблице 1. После лечения рыбок данио анестезировали передозировкой MS-222 (Sigma, Берлингтон, Массачусетс, США) и умерщвляли. Затем почку извлекали в пробирку Эппендорфа и сразу же помещали в жидкий азот. Образец переносили из жидкого азота и хранили при -80 oC.

2.2. Вызов Streptococcus agalactiae

Рыбок данио, подвергавшихся голоданию и повторному кормлению, заражали Streptococcus agalactiae. Штамм Streptococcus agalactiae был любезно предоставлен профессором Ансин Ли из Школы наук о жизни Университета Сунь Ятсена [30]. Рыбки данио в каждой группе были далее разделены на четыре небольшие группы по 15 рыб в каждой. Рыбок данио в трех из этих групп анестезировали 80 мг/л MS-222 и внутрибрюшинно вводили 5 мкл, содержащих 5 × 106 колониеобразующих единиц Streptococcus agalactiae. Остальным рыбкам данио инъецировали 5 мкл PBS. За всеми рыбками данио наблюдали в течение 4 дней без кормления. Зафиксирован уровень смертности.

2.3. Инъекция ЛПС

Рыбкам данио, подвергавшимся голоданию и повторному кормлению (F24, S24 и F21R3), вводили ЛПС (Sigma, Берлингтон, Массачусетс, США). Порошок ЛПС растворяли в стерильной воде до конечной концентрации 1 мг/мл. Перед использованием 1 мг/мл LPS разбавляли PBS, и конечная концентрация составляла 20 мкг/мл. Рыбки данио в каждой группе были разделены на две небольшие группы, и в каждой небольшой группе было по 12 рыб. Рыбам в двух группах вводили LPS и PBS. Рыбок данио анестезировали MS-222 и внутрибрюшинно вводили 5 мкл 20 мкг/мл LPS или PBS. Через 3 часа рыбок данио анестезировали и умерщвляли. После этого почку удаляли и хранили при -80 oC.

2.4. гистопатология

Рыбок данио содержали с повторным кормлением в течение 14 дней после голодания в течение 21 дня. Образцы брали на 21, 24, 28 и 35 дни. После забоя почки рыбок данио удаляли и погружали в 4-процентный формальдегид. Затем производили парафиновые срезы почек. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином (HE) (Beyotime, Шанхай, Китай) и исследовали с помощью светового микроскопа (Olympus, Токио, Япония). Для количественной оценки изменений поврежденных канальцев и мелано-макрофагальных центров (MMC) с каждого предметного стекла было снято 5 неперекрывающихся изображений. Площади поврежденных канальцев и всего образца измеряли с помощью программного обеспечения Cellsens (Olympus, Токио, Япония). По каждому снимку рассчитывали долю поврежденных канальцев путем деления площади поврежденных канальцев на площадь всей выборки. Количество ММС подсчитывали на каждом снимке, затем делили на площадь всей выборки. Затем были рассчитаны кратные изменения MMC с группой F21 в качестве стандарта.

2.5. Родственный анализ биохимических параметров

Содержание малонового диальдегида (МДА) и оксида азота (NO), а также ферментативную активность СОД, щелочной фосфатазы (ЩФ), каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (GSH-Px) и лизоцима в почках определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. в соответствии с протоколами производителя. Вкратце,почкиснятые с рыбок данио, помещали в жидкий азот и хранили при -80 oC. Перед тестированием каждую почку извлекали и превращали в гомогенат в предварительно охлажденном PBS с разрушителем тканей.Гомогенат почкицентрифугировали при 4 oC и 12,000×g в течение 10 мин, супернатант отбирали какпочкаэкстракт для обнаружения. Содержание MDA определяли с помощью набора для анализа перекисного окисления липидов MDA (Beyotime, Шанхай, Китай), и определение основывалось на цветной реакции между MDA и тиобарбитуровой кислотой. Используемая длина волны составляла 535 нм. Содержание NO измеряли с помощью системы реактивов Грисса (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Система реагентов Грисса основана на реакции нитрита с сульфаниламидом и дигидрохлоридом N-1-нафтилэтилендиамина в кислых условиях. Содержание NO рассчитывали по стандарту нитрита натрия и нормализовали по содержанию белка. Поглощение измеряли с помощью фильтра при 490 нм. Активность лизоцима определяли с помощью набора для анализа лизоцима (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Экстракт почек инкубировали с клеточной стенкой Micrococcus lysodeikticus, конъюгированной с флуоресцеином. Флуоресценцию измеряли через 45 мин инкубации при 37 oC при длинах волн возбуждения и испускания 485 и 535 нм. Значение лизоцима рассчитывали по стандартной кривой и нормализовали по содержанию белка. Ферментативную активность SOD, ALP, CAT и GSH-Px определяли отдельно с помощью наборов для анализа типа SOD, наборов для анализа щелочной фосфатазы, наборов для анализа каталазы и наборов для анализа глутатионпероксидазы (Nanjing Jiancheng, Nanjing, China). За единицу активности СОД принимали количество СОД, соответствующее 50-процентному ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия на мг белка в 1 мл системы. Используемая длина волны составляла 570 нм. За единицу активности ЩФ принимали объем фермента, прореагировавшего с субстратом с образованием 1 мг фенола за 30 мин при 37°С и нормированного на содержание белка. Используемая длина волны составляла 490 нм. Активность CAT была основана на потреблении перекиси водорода. Используемая длина волны составляла 405 нм. Активность GSH-Px измеряли по скорости катализирующей реакции между пероксидом водорода и GSH. За вычетом неферментативной реакции единицу активности GSH-Px определяли как снижение концентрации GSH на 1 моль/л в каждой системе. Используемая длина волны составляла 405 нм. Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка BCA (Beyotime, Шанхай, Китай). Используемая длина волны составляла 570 нм.

2.6. РОС Производство

Содержание АФК впочкаопределяли с помощью флуоресцентного зонда 2/,7/-дихлорфлуоресцеиндиацетат (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA), как описано ранее [28]. Вкратце, почки, извлеченные из рыбок данио, помещали в предварительно охлажденный 100 мкл PBS и превращали в гомогенат с растворителем тканей. После центрифугирования в течение 10 мин с 10,000 × g при 4 oC, 20 мклпочкаизвлекатьдобавляли в 96-черные микропланшеты с лунками и в каждую лунку добавляли 25 мкМ DCF-DA. Микропланшет инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Флуоресценцию измеряли в планшет-ридере с несколькими метками (PerkinElmer Victor X5, Уолтем, Массачусетс, США) с фильтрами возбуждения и эмиссии, установленными на 485 и 535 нм. Содержание белка в экстракте почек измеряли с помощью набора для анализа белка BCA. Содержание АФК для каждого образца рассчитывали нормированием значения флуоресценции на содержание белка. Концентрацию белка измеряли с помощью набора для анализа белка BCA (Beyotime, Шанхай, Китай). Используемая длина волны составляла 570 нм.

2.7. Анализ респираторного взрыва

Рыбок данио, подвергавшихся голоданию и повторному кормлению (F24, S24 и F21R3), использовали для измерения активности респираторного взрыва. Протокол анализа респираторного взрыва был выполнен в соответствии с ранее опубликованным методом [31,32]. Короче говоря,почкиотделяли от анестезированных рыбок данио и помещали в {{0}}луночные микропланшеты со 100 мкл среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM)/F-12. После инкубации планшета в течение 30 минут при 28 oC 100 мкл DMEM/F-12, содержащего DCF-DA, диметилсульфоксид (ДМСО) и ацетат форболмиристата (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) добавляют в каждую обнаруженную лунку. Тем временем в каждую контрольную лунку добавляли 100 мкл DMEM/F-12, содержащего ДМСО. Конечные концентрации различных растворов были следующими: 500 нг/мл DCF-DA, 0,2% ДМСО и 200 нг/мл ПМА. Флуоресценцию измеряли в планшет-ридере с несколькими метками с фильтрами возбуждения и эмиссии, установленными на 485 и 535 нм. Флуоресценция каждой лунки

измеряли сразу после добавления растворов в лунку и затем каждые 15 мин в течение 150 мин. Момент времени для сравнения значений флуоресценции составлял 150 мин. Значения флуоресценции неиндуцированной контрольной группы вычитали из значений флуоресценции.

значения отдельных групп, индуцированных PMA. Рассчитывали нормированные значения флуоресценции. Эти нормализованные значения флуоресценции были рассортированы по трем столбцам.

2.8. Экстракция РНК и ПЦР в реальном времени

Замороженныйпочкирастирали в TRIzol (Omega, Norcross, GA, USA) и выделяли тотальную РНК согласно протоколу [33]. После расщепления ДНКазой 1 (NEB, Ипсвич, Массачусетс, США) кДНК получали с помощью набора для синтеза кДНК первой цепи RevertAid (Thermo Fisher, Уолтем, Массачусетс, США) со случайным гексамерным праймером. qRT-PCR устанавливали в 10 мкл реакционных смесей, содержащих 5 мкл 2× SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Хьюстон, Техас, США). Все образцы анализировали в двух экземплярах и нормализовали по экспрессии eEF1a1a. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, использованных в настоящем исследовании, описаны в дополнительной таблице S1. Относительное количественное определение мРНК мишени и эталона определяли с использованием метода 2-AACT [34].

2.9. Статистический анализ

Количественные данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с помощью SPSS версии 24 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Статистические сравнения между двумя группами проводили с использованием критерия Стьюдента или непараметрического критерия в зависимости от результата критерия нормальности. Анализы для нескольких групп с нормальным распределением были выполнены с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а остальные были выполнены с использованием непараметрических тестов. Все статистические данные и методы можно проверить в таблице S2.

3. Результаты

3.1. Изменения массы тела и антибактериальных свойств рыбок данио во время голодания и повторного кормления

Полный компенсаторный рост был реализован у рыбок данио. После голодания от 7 до 14 дней данио теряли не менее 15 процентов массы тела. После 14 дней повторного кормления масса тела рыбок данио в голодающей группе сравнялась с таковой в контрольной группе (рис. 1А-С). После голодания и повторного кормления для изучения устойчивости рыбок данио к патогенам им внутрибрюшинно вводили Streptococcus agalactiae. Рыбки данио в группе натощак имели повышенный уровень смертности по сравнению с контрольной группой. С расширением повторного кормления уровень смертности продолжал снижаться (рис. 1D).

Рисунок 1. Модель компенсаторного роста у рыбок данио. От А до С: изменение массы тела рыбок данио во время голодания и повторного кормления. (A) Рыбки данио голодали в течение 7 дней и получали пищу в течение 28 дней. (B) Рыбки данио голодали в течение 14 дней и получали пищу в течение 21 дня. (C) Рыбки данио голодали в течение 21 дня и получали пищу в течение 14 дней. п=21–22. (D) Выживаемость рыбок данио, которым внутрибрюшинно вводили S. agalactiae; F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

3.2. Морфологические изменения почек рыбок данио во время голодания и повторного кормления

почкаявляется основной иммунной тканью рыбок данио. Голодание вызвало морфологические изменения впочки. Через 21 день голодания в почках произошли явные морфологические изменения. Мы обнаружили, что больше поврежденных канальцев с гиалиновыми каплями появилось после возобновления кормления на 3 и 5 сутки. Ситуация улучшилась на 7 день. Кроме того, было отмечено, что количество меланомакрофагальных центров (ММЦ) впочкаувеличивается после голодания (рис. 2А-С). Наряду с повторным кормлением этот симптом был спасен. Экспрессия мРНК havcr1 увеличилась после голодания (рис. 2D), показывая, что голодание может вызватьпочкарана.

Рисунок 2. Морфологические изменения впочкиданио во время голодания и повторного кормления. (A) HE-окрашиваниепочкау рыбок данио во время голодания и повторного кормления. Черный треугольник обозначает поврежденные канальцы. Красная стрелка обозначает MMC. Красная звездочка обозначает гиалиновые капли. (B) Статистический анализ доли поврежденных канальцев впочка. (C) Статистический анализ MMCs в почках. п=3–4. (D) Относительная экспрессия мРНК гена havcr1 впочкаданио во время голодания и повторного кормления. п {{0}}–10. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. *: р <>

3.3. Окислительный стресс был вызван во время голодания и возобновления питания

Содержание МДА значительно увеличилось после голодания в течение 21 и 24 дней и уменьшилось после 3 дней возобновления питания (рис. 3А). Однако содержание АФК снижалось при голодании в течение 24 дней и восстанавливалось при повторном кормлении в течение 7 дней (рис. 3Б). Содержание NO увеличивалось после голодания в течение 21 дня (рис. 3С). Активность антиоксидантных ферментов, в том числе SOD, GSH-Px и CAT, увеличивалась после голодания. Активность GSH-Px и CAT быстро снижалась и восстанавливалась на 3-й день повторного кормления. Хотя активность СОД снижалась при повторном кормлении, она все же была выше, чем в контроле (рис. 4).

Рисунок 3. Окислительный стресс в почках рыбок данио во время голодания и повторного кормления. (А) Содержание МДА в почках. (Б) Изменение АФК в почках. (C) Содержание NO в почках. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. п=6–10. *: р < 0.05,="" **:="" р="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Рис. 4. Активность ферментов антиоксидантных систем в организмепочкиданио во время голодания и повторного кормления. (А) Активность СОД в почках. (B) Активность GSH-Px в почках. (C) Активность CAT в почках. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. п=6–10. *: р < 0.05,="" **:="" р="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

3.4. Врожденная иммунная система почек рыбок данио была затронута голоданием и повторным кормлением

Активность ЩФ увеличилась в почках после голодания и снизилась после возобновления питания (рис. 5А). При повторном кормлении в течение 7 дней не было существенной разницы между группой повторного кормления и контролем. Активность лизоцима в почках имела сходную с ЩФ тенденцию, которая увеличивалась при голодании (рис. 5В). Он быстро снижался после повторного кормления. Реакция на респираторный взрыв в почках не показала значительных изменений в разных группах, но реакция была выше в группе, получавшей голодание и повторное питание (рис. 5С). Экспрессия мРНК провоспалительного цитокина il-1 показала заметное увеличение во всех группах натощак, но быстро снизилась после возобновления питания (рис. 6А). Экспрессия мРНК tgfb1a и tgfb1b показала ту же тенденцию, что и il-1 (рис. 6E, F). Однако экспрессия мРНК nfkb1 заметно увеличивалась только после голодания в течение 24 дней и снижалась после повторного кормления в течение 3 дней. Экспрессия мРНК nfkb2 показала тенденцию, аналогичную экспрессии nfkb1 (рис. 6B, C). Ген arg2 кодирует аргиназу II, связанную с провоспалительной реакцией. Кроме того, экспрессия мРНК arg2 заметно увеличилась во всех группах натощак и снизилась после возобновления питания (рис. 6D). После испытания рыбок данио, которые прошли через голодание и повторное кормление, реакция была сильнее в голодающей группе. Экспрессия мРНК il-1 и mmp9 в группе, получавшей ЛПС натощак, была значительно выше, чем в контрольной группе, получавшей ЛПС, или группе, получавшей повторное питание (рис. 7).

Рисунок 5. Показатели системы врожденного иммунитета упочкиданио во время голодания и повторного кормления. (А) Активность ЩФ в почках рыбок данио во время голодания и повторного кормления. (B) Активность лизоцима впочкаданио во время голодания и повторного кормления. (C) Реакция почек на респираторный взрыв у рыбок данио после голодания и сытного питания. (C1) Значение флуоресценции/белка почки в разное время. (C2) Значения флуоресценции/белкапочкав 150 мин. (C3) Нормализация значения флуоресценции/белка почки через 150 мин. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. п=12. *: р < 0,05,="" **:="" р="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Рисунок 6. Относительная экспрессия мРНК генов, связанных с иммунитетом, в почках рыбок данио во время голодания и повторного кормления. (A–F):il-1 , nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a и tgfb1b. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. п=8–1{{10}}. *: р < 0,05,="" **:="" р="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

Рисунок 7. Относительная экспрессия мРНК иммунозависимых генов впочкирыбок данио, которым вводили 5 мкл 20 мкг/мл ЛПС после голодания и повторного кормления. (A–C) il-1 , mmp9 и nfkb1. F: кормление; S: голодание; Р: подпитка. п=8–12. *: р < 0.05,="" **:="" р="">< 0,01;="" ***:="" р=""><>

4. Дискуссия

В настоящем исследовании мы обнаружили, что полный CG может быть реализован у рыбок данио после разной продолжительности голодания. Даже после 3 недель голодания масса тела рыбок данио достигла массы тела контрольной группы через две недели. Этот результат согласуется с предыдущей работой [28]. Исследования показали, что голодание и повторное кормление влияют на метаболическое состояние рыбок данио [27,28]. Для выращиваемых видов значение CG заключается в том, что он повышает эффективность производства. Для выращиваемых видов важно сохранять антибактериальные свойства во время голодания и повторного кормления. Во время этого процесса рыбки данио могут пострадать от патогенов. Сообщалось, что голодание не влияло на иммунный ответ инфицированных Piaractus mesopotamicus [18]. К сожалению, голодание повышает восприимчивость рыбок данио к S. agalactiae. В то же время голодание влияло на биохимические параметры и экспрессию мРНК системы врожденного иммунитета.

У рыбок данио лимфатические узлы отсутствуют, а почки являются первичным лимфоидным органом, эквивалентным костному мозгу млекопитающих [24]. У взрослых рыбок данио почки являются основным местом кроветворения [35]. Популяции в почечном мозге содержат многие типы гемопоэтических клеток, включая макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты [36,37]. Правильная функция почек важна для врожденной иммунной системы у рыбок данио. В настоящем исследовании мы наблюдали некоторые морфологические изменения в почках рыбок данио, подвергнутых голоданию. Отложение ММС в почках значительно увеличивалось после голодания. Ранее было установлено, что голодание может вызывать отложение мелано-макрофагов (ММ) в почках и селезенке рыб [38]. ММС в основном появляются в почках, печени и селезенке, диффузные и менее структурированные в почках [39]. Считается, что MMC функционируют как в иммунной защите, так и в нормальных, неиммунологических, физиологических процессах. Основной функцией ММС является фагоцитоз. Считается, что ММС могут принимать участие как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Добавление ММС после голодания может быть связано с гемофагоцитозом и клиренсом клеточного детрита. Кроме того, в первые дни рефида наблюдалась структура гиалиновых капель. Считается, что присутствие гиалиновых капель свидетельствует главным образом об альфа2и-глобулине в эпителиальных клетках канальцев [40]. Кроме того, в модели гистиоцитарной саркомы неопластические гистиоциты продуцировали лизоцим, и лизоцим накапливался в эпителиальных клетках канальцев [41]. Таким образом, образование гиалиновых капель происходит потому, что почки не могут переваривать белок, который накапливается в эпителиальных клетках канальцев. Уровень KIM-1 (кодируется havcr1) может свидетельствовать о структурном повреждении канальцев [42]. После голодания экспрессия мРНК havcr1 заметно увеличивалась и уменьшалась при повторном кормлении. Мы можем предсказать, что функция почек нарушается при голодании, а при повторном питании функция почек восстанавливается. Однако требования обременительны в начале повторного кормления.

Фагоцитоз является важным защитным процессом врожденной иммунной системы рыб. Окислительный стресс ограничивает иммунный ответ [20]. Антиоксидантная защита в основном зависит от ферментов. СОД, ГП и каталаза являются важными компонентами антиоксидантных систем [43]. SOD опосредует превращение супероксид-аниона и H2O2. Каталаза принимает участие в детоксикации H2O2 до воды. GPx катализирует гидропероксиды (например, H2O2 и гидропероксиды липидов) в H2O путем окисления глутатиона (GSH) в дисульфид глутатиона (GSSH) [43–45]. МДА является одним из основных продуктов окисления липидов и образуется из полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в результате химических реакций и реакций, катализируемых ферментами. АФК могут переокислять ПНЖК с образованием МДА. Содержание МДА является биомаркером, обычно используемым для оценки окислительного стресса [46]. В настоящей работе, несмотря на снижение содержания АФК, содержание МДА в почках заметно увеличилось, а также была повышена активность всех ферментов антиоксидантной системы. Обнаружение АФК является временной реакцией. Изменение активности антиоксидантного фермента произошло в результате длительного голодания. Противоположные тенденции между АФК и антиоксидантными ферментами могут быть связаны с тем, что нормальные процессы клеточной активности продуцируют АФК, а длительное голодание приводит к снижению клеточной активности. Этот результат показал, что голодание вызывает хронический окислительный стресс в почках. Сохраняющийся окислительный стресс может вызвать повреждение веществ в клетках, таких как липиды и белки, и в конечном итоге привести к апоптозу и накоплению окисленных молекулярных агрегатов [20]. Сообщалось, что у костистых рыб голодание индуцировало содержание МДА в печени и кишечнике и повышало активность антиоксидантных ферментов [47–49]. Эти результаты подразумевают, что, хотя антиоксидантная система была активирована, этого было недостаточно для устранения повреждений, вызванных голоданием. Между тем окислительный стресс может активировать широкий спектр факторов транскрипции, таких как NF-kB, Nrf2 и HIF-1a. Впоследствии эти факторы транскрипции индуцируют экспрессию многих цитокинов и хемокинов. Таким образом, окислительный стресс может привести к хроническому воспалению [44].

При заражении Streptococcus agalactiae у рыбок данио в группе натощак смертность была выше, чем у рыбок в контрольной группе. Между тем активность ЩФ и лизоцима улучшалась при голодании. Лизоцим является важным компонентом врожденной иммунной системы рыб и принимает участие в процессе фагоцитоза [50]. Согласно результатам, голодание вызывало экспрессию мРНК il-1 , nfkb1, tgfb1a, tgfb1b и arg2. Эти изменения могут быть вызваны окислительным стрессом. TGFB1 представляет собой цитокин, обладающий как про-, так и противовоспалительным действием [51]. Рекомбинантный TGFB1 проявлял иммунодепрессивную активность и подавлял экспрессию провоспалительных цитокинов в лейкоцитах костистых рыб. У рыбок данио экспрессия tgfb1a вызывает воспаление печени [52]. Хроническая индукция tgfb1a активировала воспаление, а его экспрессия индуцировала фиброз печени при ранней гепатоцеллюлярной карциноме у рыбок данио. Аргиназа является первичным ферментом и отвечает за превращение L-аргинина в L-орнитин и мочевину. Аргиназа имеет два изофермента (аргиназа I и аргиназа II) [53,54]. Аргиназа II является геном, связанным с иммунитетом, и было обнаружено, что он связан с провоспалительными реакциями в макрофагах через митохондриальные АФК. Эти данные показали, что голодание может вызывать иммунный ответ в почках. У мышей голодание снижало чувствительность к ЛПС и не влияло на экспрессию il-1 [55]. Однако у рыбок данио, стимулированных LPS, наблюдался грубый ответ на LPS, а экспрессия il-1 и mmp9 была значительно выше, чем в других группах. В отличие от мышей, рыбки данио стали более чувствительными к липополисахаридам после голодания, поэтому голодание может ухудшить их способность уничтожать патогены.

5. Выводы

В настоящем исследовании мы предварительно изучили влияние голодания и повторного кормления на врожденную иммунную систему рыбок данио. У рыбок данио реализовывался компенсаторный рост, сопровождающийся повышением восприимчивости к патогенам после голодания. Окислительный стресс, вызванный голоданием и связанными с опасностью молекулярными паттернами, вызванными повреждением почечных канальцев, мог способствовать воспалению. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, как голодание повышает восприимчивость и как метаболическое состояние влияет на различные виды иммунных клеток.

Дополнительные материалы: следующие материалы доступны в Интернете по адресу https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom11060825/s1, таблица S1: список праймеров, использованных в этом исследовании; Таблица S2: статистический результат эксперимента.

Вклад авторов: концептуализация, ZL и WL; Курирование данных, JJ; Формальный анализ, ZL и DL; приобретение финансирования, WL; Расследование, ZL, DL, RC и YY; Методология, ЗЛ; Надзор, WL; Написание — первоначальный вариант, ZL; Написание — рецензирование и редактирование, WL Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: эта работа финансировалась Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFD0900101), Китайской системой сельскохозяйственных исследований MOF и MARA (CARS{2}}) и Программой для выдающихся китайских талантов в области сельскохозяйственных научных исследований ({{3 }}) Вэньшэн Ли.

Заявление Институционального наблюдательного совета: исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сунь Ятсена.

Заявление об информированном согласии: неприменимо.

Заявление о доступности данных: неприменимо.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.