Мелатонин из микроорганизмов, водорослей и растений как возможная альтернатива синтетическому мелатонину Часть 1

Абстрактный: Пищевые добавки с мелатонином широко потребляются во всем мире, при этом развитые страны являются крупнейшими потребителями с предполагаемым ежегодным темпом роста примерно в 10 процентов до 2027 года, в основном в развивающихся странах. Широкое использование мелатонина при нарушениях сна и особых проблемах, таких как смена часовых поясов, было добавлено к другим применениям, таким как омолаживание, антистресс, активация иммунной системы, противораковые и другие, которые вызвали его использование, как правило. без рецепта. Химическая промышленность в настоящее время покрывает 100 процентов потребностей рынка мелатонина. Несколько лет назад появилась возможность получения мелатонина из растений, называемого фитомелатонином, благодаря секторам с более естественными привычками потребления. Совсем недавно фармацевтическая промышленность разработала генетически модифицированные микроорганизмы, чья способность производить природный мелатонин в биореакторах была усилена. В данной статье рассматриваются аспекты химического и биологического синтеза мелатонина для потребления человеком, главным образом, в качестве пищевой добавки. Анализируются плюсы и минусы получения мелатонина из микроорганизмов и фитомелатонина из растений и водорослей, а также преимущества природного мелатонина, позволяющего избежать нежелательных химических побочных продуктов химического синтеза мелатонина. Наконец, анализируются экономические и качественные аспекты этих новых продуктов, некоторые из которых уже продаются.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные радикалы кислорода (OH-, H₂O₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение свободных радикалов тимина.

Нажмите на побочные эффекты Cistanche Reddit

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключевые слова: пищевые добавки; ГМО; мелатонин; микроорганизмы; фитомелатонин; растительное сырье

1. Введение

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is widely used around the world as a  dietary supplement. In general, melatonin is used as a sleep aid supplement, a mild tranquilizer, a generalist antioxidant, and an anticancer and anti-aging component, among others [1]. According to the American Psychiatric Association (APA), approximately one-third of adults suffer from insomnia during their lifetime [2]. It manifests itself in ongoing problems falling asleep and staying asleep. Therefore, it is very likely that the use of synthetic melatonin will spread. In 2019, the global production of synthetic melatonin,  which was around 4000 tons, accounted for around 1.3 billion USD. This vast market is fully assisted by the chemical melatonin, whose synthesis process is very cheap, effective, and,  therefore, lucrative. The melatonin market is expected to grow at a CAGR (compound annual growth rate) of >10 процентов в течение следующих 5 лет. При таком значительном увеличении спроса проблемы бессонницы, вызванные пандемией COVID-19, приобрели большую актуальность [3]. В Северной Америке самый высокий уровень потребления, за ней следует Европа. Мировой рынок мелатонина в основном контролируется несколькими крупными компаниями, такими как BASF, Aspen Pharmacare Australia, Nature's Bounty, Pfizer Inc., Natrol LLC, Aurobindo Pharma и Biotics Research Co. Обратите внимание, что потребление мелатонина в медицинских целях включает около 50 процентов произведенного синтетического мелатонина; остальные имеют химическое и промышленное применение [2,4].

Биологически мелатонин представляет собой молекулу, широко распространенную во всех царствах живых организмов [5]. Обнаруженный в 1958 году в шишковидной железе коровы [6], а затем и у человека [7], он является одной из наиболее изученных биомолекул, и его многочисленные функции известны, в основном, у млекопитающих [8,9], но также и у рыб. [10–12], домашняя птица [13,14] и беспозвоночные [15]. В клетках животных и человека мелатонин действует как антиоксидант — важная роль, приписываемая ему в 1993 г. [16–18]. Мелатонин действует как интересный защитник клеток в стрессовых ситуациях, в различных физиологических аспектах у людей и, согласно многочисленным исследованиям, способствует улучшению состояния при различных заболеваниях и дисфункциях. На рисунке 1 показаны некоторые защитные и регулирующие действия мелатонина у человека и мелатонин представлен как интересная плейотропная молекула, выделяющаяся своей актуальностью, ролью мелатонина в регуляции метаболизма липидов и глюкозы, вызывая ночную инсулинорезистентность и дневную инсулинорезистентность. чувствительность. Этот эффект, по-видимому, связан с ночным голоданием и дневным питанием, что предотвращает чрезмерное увеличение веса [19]. Мы также подчеркиваем его роль в качестве антионкогенного агента, подавляющего рост, пролиферацию и метастазирование некоторых опухолей. Лечение опухолей мелатонином улучшало чувствительность к химио- и лучевой терапии, действуя как синергетическая молекула в борьбе с раковыми клетками. Кроме того, мелатонин смягчает острое повреждение нормальных клеток, защищая их от лекарственной токсичности, возможно, за счет усиления иммунных реакций [20–22]. Среди дисфункций и заболеваний, при которых изучено благотворное влияние мелатонина, — неврологические, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, фибромиалгия, депрессия, синдром дефицита внимания и гиперактивности, аутизм и мигрень; сердечно-сосудистые заболевания, включая гиперхолестеринемию, гипертензию, метаболический синдром и гликемический дисбаланс; проблемы со здоровьем желудочно-кишечного тракта, такие как гастроэзофагеальный рефлюкс, язвы и синдром раздраженного кишечника; иммунологические проблемы со здоровьем, такие как рассеянный склероз, аутоиммунные реакции (спортивный стресс, токсический стресс, псориаз и т. д.), сепсис, COVID-19 и т. д. [3,23–26]; а также остеопения [27], саркопения [28], преэклампсия, фертильность, синдром поликистозных яичников и менопауза, среди прочего [29–32]. Однако, несмотря на то, что мелатонин является молекулой, которая широко изучается с 1950-х годов, проведенные исследования требуют более клинических и обширных двойных слепых испытаний, чтобы прояснить его иногда сбивающее с толку плейотропное действие [33,34].

Тем не менее, мелатонин хорошо известен как гормон, регулирующий сон. Его колеблющиеся уровни в кровотоке в соответствии с периодами света и темноты (циркадные ритмы) из-за высвобождения мелатонина шишковидной железой являются одним из наиболее изученных и известных аспектов этой молекулы. Повышение уровня мелатонина в крови в течение первого периода сна примерно до 150–220 полюсов/мл воздействует на инициацию сна, уменьшает латентность и фрагментацию сна, увеличивает продолжительность и качество сна [1,35,36]. Мелатонин действует как внутренний синхронизатор циркадного цикла сна-бодрствования и сезонной ритмичности. В этом смысле мелатонином лечили многие нарушения сна, в том числе синдром замедленной фазы сна, расстройство сна при работе в ночную смену, сезонное аффективное расстройство, нарушения сна у слепых и пожилых людей, а также патофизиологические расстройства у детей с заметным улучшением качества сна. 37–41]. Наиболее распространенным заболеванием, которое лечат мелатонином, является синдром смены часовых поясов — дефазировка ритмов сна и бодрствования после трансокеанских перелетов [42–45]. Возможно, упор в исследованиях на его роль регулятора сна вызвал отсутствие исследований его возможной роли во многих других физиологических и клинических аспектах.

Мелатонин в растениях, так называемый фитомелатонин, был обнаружен одновременно тремя исследовательскими группами в разнообразном растительном материале в 1995 г. [46–48]. Термин фитомелатонин, который относится к мелатонину растительного происхождения (растения и водоросли), используется для того, чтобы отличить его от животного и/или синтетического мелатонина. Этот термин очень широко распространен и постоянно используется в исследованиях мелатонина растений в фитохимии, физиологии растений, ботанике, пищевой химии и т. д. В растениях фитомелатонин также является плейотропной молекулой, играющей множество ролей в различных физиологических реакциях (рис. 1). Регуляция мелатонином таких аспектов, как фотосинтез, в том числе поглощение CO2 устьями и экономия воды, метаболизм углеводов, липидов, азота и серы, а также метаболизм простых фенолов, флавоноидов и терпеноидов, продемонстрировала исключительный интерес к основным и техническим процессам вегетативных растений. (прорастание, рост растений, укоренение, ветвление и др.) и репродуктивное развитие, включая фертильность, партенокарпию, развитие семян и плодов, созревание, старение и сохранение плодов и срезанных цветов [49–53]. Как правило, мелатонин регулирует эти процессы посредством действия сети растительных гормонов, повышая/понижая некоторые факторы биосинтеза, катаболизма и транскрипции, связанные с растительными гормонами [54–56]. Одним из аспектов, представляющих наибольший агрономический и биотехнологический интерес, является роль фитомелатонина как стимулятора устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам [57–68] (рис. 1). В настоящее время фитомелатонин представлен как интересный экологически чистый инструмент для борьбы с биологическими заболеваниями и для облегчения устойчивости/адаптации растений к/против изменения климата.

2. Биосинтез мелатонина

Мелатонин представляет собой ацетилированное соединение, полученное из серотонина. Оба индольных амина синтезируются из аминокислоты триптофана путем биосинтеза, который широко изучался как на животных, так и на растениях [69,70]. В растениях триптофан превращается в триптамин ферментом триптофандекарбоксилазой (TDC) (рис. 2). Затем триптамин превращается в 5-гидрокситриптамин (серотонин) с помощью триптамин 5-гидроксилазы (T5H), фермента, который был тщательно изучен на рисе и который может действовать на многие субстраты, хотя это не изучалось. в глубине. Серотонин N-ацетилируется серотонин-N-ацетилтрансферазой (SNAT). Затем N-ацетилсеротонин метилируется ацетилсеротонинметилтрансферазой (ASMT) — гидроксииндол-O-метилтрансферазой, которая генерирует мелатонин. У растений метилирование N-ацетилсеротонина также может осуществляться О-метилтрансферазой кофейной кислоты (COMT), классом ферментов, которые могут действовать на различные субстраты, включая кофейную кислоту и кверцетин [71]. Серотонин также может быть преобразован в 5-метокситриптамин с помощью ASMT/COMT с образованием мелатонина после действия SNAT. Этот путь возникает при старении и/или в стрессовых ситуациях [70,72]. Кроме того, мелатонин может образовываться путем образования N-ацетилтриптамина с помощью SNAT, который будет преобразован в N-ацетилсеротонин с помощью T5H [73], хотя этот путь не был продемонстрирован, возможно, потому, что T5H является наименее изученным ферментом пути. (Фигура 2). Интересно, что в растениях риса было идентифицировано до четырех генов, кодирующих гистоновые деацетилазы (DAC), которые могут обратить шаги от серотонина к N-ацетилсеротонину и от 5-метокситриптамина к мелатонину. DAC, экспрессируемый в хлоропластах, проявлял ферментативную активность в отношении N-ацетилсеротонина, N-ацетилтриптамина и мелатонина, с наибольшей деацетилазной активностью в отношении N-ацетилтирамина [74].

В клетках животных серотонин образуется из 5-гидрокситриптофана после последовательного действия триптофангидроксилазы (TPH) и TDC. Хотя TPH не был обнаружен в растениях, присутствие 5-гидрокситриптофана свидетельствует о том, что некоторая ферментативная активность, такая как активность TPH, действует в клетках растений в меньшей степени. Кроме того, мелатонин может образовываться путем образования 5-метокситриптамина, в основном в условиях стресса, как это было предложено несколькими авторами, предполагая, что путь биосинтеза мелатонина может следовать различным альтернативным путям по сравнению с клетками животных с большей способностью адаптироваться. к метаболическим изменениям в растениях [72,75]. Все названные ферменты обнаружены и охарактеризованы у риса и арабидопсиса, за исключением ТФН, который хорошо известен у животных, но не у растений. Тем не менее, некоторые авторы предположили, что T5H может действовать как гидроксилаза с низкой субстратной специфичностью и способна действовать на всех описанных стадиях гидроксилирования [70,76-79]. Такая же широкая субстратная специфичность также может быть приписана ферментам SNAT, ASMT и COMT. Промежуточные продукты мелатонина продуцируются в различных субклеточных компартментах, таких как цитоплазма, эндоплазматический ретикулум, митохондрии и хлоропласты, которые определяют последующие ферментативные стадии [80,81].

У микроорганизмов мало исследований пути биосинтеза мелатонина [82]. Сахаромицеты и бактерии (Geobacillus, Bacillus и Pseudomonas) продуцировали как серотонин, так и мелатонин в разных концентрациях [83–89]. Более того, продукция мелатонина была отмечена другими авторами в культурах дрожжей Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, S. uvarum и бактерий (Agrobacterium, Pseudomonas, Variovorax, Bacillus и Oenococcus) [85,90,91] и ранее у фотосинтезирующих бактерий Rhodospirillum rubrum [92], Erythrobacter longus [93] и Escherichia coli [94].

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в отличие от растений и животных, по-видимому, не происходит биосинтеза 5-гидрокситриптофана из триптофана. Интересно, что некоторые из описанных стадий являются обратимыми у S. cerevisiae, например, между 5-гидрокситриптофаном и серотонином, N-ацетилсеротонином и мелатонином и 5-метокситриптамином и мелатонином [90,95]. как подробно показано на рисунке 2. В Bacillus amyloliquefaciens SB-9 и Pseudomonas fluorescens RG11 5- гидрокситриптофан, серотонин и N-ацетилсеротонин, но триптамин не был обнаружен [85,86]. Итак, для создания штамма Escherichia coli, продуцирующего мелатонин, использовали несколько генов бактериального происхождения. Например, были проанализированы ген DDC, кодирующий декарбоксилазу ароматических L-аминокислот из Candidatus Koribacter universal Ellin 345 и Draconibacterium orientale, и ген AANAT, кодирующий алкиламин-N-ацетилтрансферазу из Streptomyces griseofuscus [96,97]. Несомненно, необходимы дальнейшие исследования для выяснения полных путей биосинтеза мелатонина у различных прокариотических и эукариотических микробов [82].

3. Биологический мелатонин против синтетического мелатонина

Первоначально мелатонин получали для экспериментальных и клинических исследований из животных источников (главным образом из шишковидной железы и мочи) с последующим риском передачи вируса [98,99]. Эти методы были отменены, когда мелатонин можно было получить путем химического синтеза [100]. В настоящее время весь мелатонин, используемый в промышленных и медицинских целях, получают методами химического синтеза. Эти методы, представлявшие серьезные проблемы в 1980-х годах, включая смертельные исходы из-за наличия побочных продуктов синтеза триптофана [101], сегодня гораздо безопаснее и эффективнее. Однако в препаратах мелатонина описано наличие целого набора нежелательных побочных продуктов из-за их токсического характера. На рисунке 3 показаны три наиболее часто используемых пути химического синтеза мелатонина и побочных продуктов, образующихся при его синтезе [102]. Синтез мелатонина из производных триптофана (рис. 3, схема A) приводит к образованию токсичных побочных продуктов, которые иногда вызывают серьезные заболевания, такие как синдром эозинофилии-миалгии [101, 103, 104], в то время как самые современные методы (рис. 3, схема B) для синтез мелатонина из фталимида [105] вызывают важные сомнения относительно токсичности некоторых образующихся побочных продуктов [106]. Кроме того, индольные реакции Фишера из аллиламина (рис. 3, схема C) содержат опасные и токсичные реагенты [107].

С другой стороны, получение мелатонина из биологических источников неживотного происхождения представлено как твердая приверженность будущему, не заменить синтетический мелатонин, а стать более естественным дополнительным и альтернативным источником [108].

4. Стратегии получения биологического мелатонина

Мелатонин присутствует у всех известных биологических видов, от прокариот до эукариот, включая дрожжи, водоросли, грибы и растения, а также у животных [80, 109–111]. Ниже представлены методологии, разработанные на микроорганизмах и растениях как возможных источниках природного мелатонина.

4.1. Мелатонин из микроорганизмов

а. сахаромицеты

Первый подход к производству биологического мелатонина недавно был предпринят группой датской фармацевтической компании Novo Nordisk с использованием генетически модифицированных Saccharomyces cerevisiae (таблица 1, продукт №1). Германн и его коллеги сконструировали рекомбинантный путь мелатонина в штамме дрожжей, содержащем гетерологичные гены, кодирующие несколько ферментов биосинтеза мелатонина и пути, поддерживающие кофакторы [112]. Трансгенные дрожжи кодифицировали различные гены Rattus norvegicus, Lactobacillus ruminis, Pseudomonas aeruginosa, Homo sapiens, Schistosoma mansoni, Bos Taurus и Salmonella enterica. При кормлении дрожжей только глюкозой и ацетил-Ко-А продукция мелатонина достигала 14,5 мг·л-1 за 76 часов. Тем не менее, по мнению других авторов, некоторые проблемы, такие как высокое накопление N-ацетилсеротонина в дрожжевых клетках, несбалансированная экспрессия генов и идентификация некоторых потенциально токсичных интермедиатов, требуют решения [113].

б. кишечная палочка

Во втором подходе, на этот раз с использованием трансгенно-модифицированной культуры Escherichia coli (таблица 1, продукт № 2), компания Novo Nordisk сообщила о биологической продукции мелатонина из гетерологичного штамма, сконструированного из рекомбинантной E. coli, включающей несколько генов, таких как ген TDC. из Candidatus Koribacter universal, ген SNAT из Streptomyces griseofuscus и ген ASMT человека. Кроме того, некоторые гены, связанные с триптофаном, были заблокированы или удалены, чтобы предотвратить нежелательную репрессию, деградацию и экспортный транспорт [96,97]. После нескольких улучшений штамма и подкормки минеральными солями, витаминами и антибиотиками культивируемые клетки продуцировали мелатонин в количестве ~ 1 г·л-1, используя глюкозу в качестве единственного источника углерода, и до 2 г·л-1 в клетках, питавшихся триптофаном. с незначительным количеством побочных продуктов. Таким образом, по мнению авторов, эти штаммы ГМО E. coli могут стать основой для будущего биологически коммерческого производства мелатонина с использованием микробных клеточных фабрик. Тем не менее, использование трансгенных организмов для производства веществ для потребления человеком может быть проблематичным, когда цель состоит в том, чтобы донести натуральный продукт до чувствительных потребителей или потребителей, выступающих против ГМО.

в. Молочнокислые бактерии

Мелатонин также производился в промышленных масштабах путем микробной ферментации, как сообщается в [114]. Биосинтез мелатонина направлялся мультиштаммовыми молочнокислыми бактериями, такими как Lactobacillus sp. (L. brevis, acidophilus, bulgaricus, casei подвиды, fermentum, helveticus подвиды jogorti, plantarum); Бифидобактерии сп. (B. breve spp. breve, longum spp. infantis); Энтерококк сп. (Е. faecalis TH10); и термофильный стрептококк. Продукты, произведенные по этой технологии, продаются компанией Quantum Nutrition Labs (Техас, США) как Melatonin Drops, Qultured™, содержащие 8 мг дрожжевого мелатонина (таблица 1, продукт №3).

д. Хлорелла

Продуктом из водорослей является Гербатонин® (Таблица 1, продукт № 4), приготовленный в виде таблеток, содержащих 0,3 или 3 мг фитомелатонина, хотя в Европе он продается в дозах 0,3. и 1,9 мг, согласно законам ЕС. Этот состав содержит несколько видов растений, таких как рис (Oryza sativa L.) и люцерну (Medicago sativa L.), а также зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosa и C. vulgaris. Наши данные показывают, что эти микроводоросли содержали не более 2–15 нг·г DW–1 [115], а виды-компаньоны содержат очень низкие уровни фитомелатонина: 1–5 нг·г–1 в рисе и 16 нг·г −1 у люцерны [116]. Присутствие хлореллы позволяет предположить, что фитомелатонин в основном получают путем культивирования зеленых водорослей в биореакторах, возможно, подкармливаемых предшественниками, такими как триптофан, аналогично тому, как это делается в Achillea millefolium [117], хотя нет опубликованных данных о методе культивирования. получение этих богатых фитомелатонином экстрактов, только их биохимическая характеристика [118]. Также отсутствуют данные о контроле наличия цианотоксинов в этих экстрактах из-за возможной контаминации цианобактериями (сине-зелеными водорослями). Эти цианотоксины обладают несколькими нежелательными эффектами, связанными, среди прочего, с канцерогенностью, гепатотоксичностью и нейротоксичностью. Таким образом, обнаружение цианотоксинов в некоторых пищевых добавках из водорослей усиливает необходимость лучшего контроля качества [119,120].

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】