ЧАСТЬ Ⅰ: Острое повреждение почек при тяжелом течении COVID-19 имеет сходство с повреждением почек, связанным с сепсисом

для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

ЧАСТЬ Ⅰ:Острое повреждение почек при тяжелом течении COVID-19 имеет сходство с повреждением почек, связанным с сепсисом: мульти-омическое исследование

Мариам П. Александр, доктор медицины; Киран К. Мангалапарти, доктор философии и др.

ВВЕДЕНИЕ

Заражение коронавирусом 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) вызывает коронавирусную болезнь 2019 г. (COVID-19. 19) и связан сострая почечная недостаточность(ОПН) более чем у трети госпитализированных пациентов. АКИ (острая почечная недостаточность) часто бывает от умеренной до тяжелой и является независимым фактором риска внутрибольничной летальности. Острое канальцевое повреждение считается патологическим признакомCOVID-19заболевание почек, как показано как в нативных, так и в аутопсийных исследованиях почек. Микротромбы, описанные в сердце и легких, редко обнаруживаются в почках.COVID-19связан с системной воспалительной реакцией и воспалением как в легких, так и в сердце, мало что известно об иммунном ответе в почках.

Прямая вирусная токсичность, нестабильность гемодинамики, цитокиновый шторм. и иммуноопосредованное повреждение были предложены в качестве вероятных причин повреждения почек уCOVID-19.5,13,14 Недавние исследования выявили сходство между сепсис-ассоциированным ОПП (острая почечная недостаточность) (С-АКИ (Повреждение почек, связанное с сепсисом)) а такжеCOVID-19связанное с повреждением почек., e На сегодняшний день отчеты об оценке почечной патологии вCOVID-19в основном сосредоточились на световой микроскопии и ультраструктурных исследованиях; молекулярные исследования были ограничены.

Здесь мы представляем сериюCOVID-19пациенты, прошедшие патологоанатомическое исследование с акцентом на находки почечной патологии. Наше исследование стремилось описать патологический спектрCOVID-19-ассоциированное повреждение почек и охарактеризовать молекулярный профильCOVID-19-ассоциированный ОПП (острая почечная недостаточность)по сравнению с S-AKI ((Повреждение почек, связанное с сепсисом))и несвязанное с сепсисом ОПП (острая почечная недостаточность)(НС. АКИ (острая почечная недостаточность)выявить сходства и различия в лежащей в основе патофизиологии.

Щелкните, чтобы получить преимущества экстракта цистанхе при заболеваниях почек

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Клинические данные

Все случаиCOVID-19(подтверждено прижизненной полимеразной цепной реакцией SARS.CoV-2 в носоглотке или ротоглотке), прошедших согласованную с исследованием патологоанатомическую экспертизу в клинике Майо (Рочестер, Миннесота) в период со 2 апреля по 9 сентября 2020 года, были включены в исследование. Существенная информация для всех случаев была извлечена из выполненной после лазерного захвата микродиссекции тубулоинтерстициального компартмента с экссудацией любых клубочков и/или областей интерстициального фиброза или атрофии канальцев. Апоптоз в каждой группе оценивали с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP в анализе мечения концов nick-концов.

Статистический анализ

Анализ экспрессии генов после нормализации проводили с использованием R версии 3.6.3 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Наборы генов функциональных аннотаций были получены с использованием аннотаций, предоставленных NanoString, на основе литературы. z-показатели среднего нормального zedcounts составляющих генов. Показатели Гезетца сравнивали между группами образцов с использованием t-теста Стьюдента. Верхние относительно повышающие и подавляющие отдельные гены в каждой выборочной группе (по сравнению со всеми другими выборочными группами) определяли с использованием кратности изменения и t-критерия Стьюдента. В случае количественных данных протеомики, интенсивности каналов тандемных масс-меток идентифицированных белков использовались для статистического анализа с использованием Python 3.6.5. Интенсивности каналов представляли собой логарифм, трансформировали и нормализовали медиану перед применением независимого t-критерия Стьюдента. Значения P были скорректированы для проверки нескольких гипотез с использованием метода Бенджамини-Хохберга. Дифференциально экспрессируемые белки (p<.05) were="" analyzed="" using="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" software(ipa,="" qiagen="" redwood="" city,="" ca,="" usa)to="" identify="" altered="" signaling="" pathways.="" the="" significance="" values="" (p-value="" of="" overlap)for="" the="" canonical="" pathways="" were="" calculated="" by="" the="" right-tailed="" fisher="" exact="" test.="" we="" used="" a="" nonparametric="" rank-sum="" test="" to="" compare="" the="" groups="" because="" of="" the="" small="" number="" of="" cases="" per="" group.="" all="" statistical="" analyses="" were="" perfomed="" using="" imp="" (sas="" institute.="" cary.="" nc:="" version="" 14.1).="" p="" values="" less="" than="" .05="" were="" considered="" to="" be="" statistically="">

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинические характеристики

Демография 17ХОБЛ-19случаи вскрытия представлены в таблице 1. Средний возраст когорты составлял 78 лет (диапазон от 29 до 94 лет), а 14 (82,4 процента) были старше 70 лет. Было 15 мужчин. и все идентифицировали себя как белые (64,7%). Еще трое (17,6%) пациентов идентифицировали себя как азиаты, ни один из них не был чернокожим. Время, проведенное в больнице, сильно различалось: 12 (70,6%) были госпитализированы за 5 или более дней до смерти. Частые и заметные сопутствующие заболевания включали гипертонию у 9 (52,9%), сахарный диабет у 4 (23,5%), сердечно-сосудистые заболевания (такие как ишемическая болезнь сердца) или нарушение мозгового кровообращения у 12 (70,6%) и хроническое заболевание почек у 1 (5,9%). ). Только у 1 из 17 пациентов (5,9%) не было в анамнезе артериальной гипертензии, сахарного диабета, ишемической болезни сердца, хронической болезни почек или ожирения. Семеро (41,1%) в момент смерти находились на искусственной вентиляции легких.

Все 17 пациентов умерли отCOVID-19разработан ОКИ (острая почечная недостаточность). Среди больных ОПП (острая почечная недостаточность)у которых был терминальный уровень креатинина в сыворотке в течение 24 часов после смерти, у восьми было ОПП (острая почечная недостаточность) стадия 1 (47,1%), у двоих было ОПП (острая почечная недостаточность)2-я стадия (11,8%), а у троих — ОПП. (острая почечная недостаточность)3 стадия (17,6%). Один пациент с ОПП (острая почечная недостаточность)3 стадия получала постоянную заместительную почечную терапию. Оценка протеинурии с помощью тест-полосок в моче была недоступна у четырех пациентов, но у остальных 13 пациентов (76,5%) она была 100 мг/дл или меньше. Шесть из 17 пациентов получали лечение по поводуCOVID-19включая только дексаметазон (n=1), ремдесивир (n=1), комбинацию дексаметазона и ремдесивира (n=2), а также комбинацию ремдесивира и реконвалесцентной плазмы(n{{ 3}}).

У всех 17 пациентов была положительная полимеразная цепная реакция на SARS-CoV-2, диагностированная в среднем за 12 дней до вскрытия. На момент вскрытия трое (17,6%) были отрицательными на SARS-CoV-2. Медиана посмертного интервала составила 18 часов, а аутолиз был легким только у 11 пациентов (64,7%). Шестнадцать (94,1%) умерли от осложненийCOVID-19(все 16 имели тяжелое заболевание легких, в том числе острую бронхопневмонию на фоне диффузного альвеолярного поражения у восьми [5{2}}.0 процентов), острую и организующуюся пневмонию у четырех [25,0 процентов], организующую пневмонию у трех [ 18,8 процента] и только диффузное альвеолярное повреждение у одного [6,3 процента]).

ТАБЛИЦА 1. Демографические данные когорты и соответствующие клинические характеристики

Характеристики патологии

Результаты вскрытия почки охарактеризованы в табл. 2. Почечная патология во всех случаях характеризовалась умеренным или тяжелым острым канальцевым повреждением (рис. 1А). Большинство из них показали заметное упрощение эпителия выстилки и люминальную эктазию. Миоглобиновые цилиндры наблюдались в двух случаях и осмотическая тубулопатия в одном. Тубулоинтерстициальное воспаление было легким с преобладанием макрофагов и CD3-положительных Т-клеток. Перитубальный капиллярит со смешанным иммунофенотипом Т-клеток и макрофагов наблюдался у 13 (76,5%) (рис. 1B-F). Точно так же гломерулы со смешанным иммунофенотипом Т-клеток и макрофагов наблюдались у тех же 13 (76,5%). Четверо пациентов, у которых не было признаков воспаления микрососудов, лечились комбинацией ремдесивира и либо дексаметазона (n=2), либо плазмы реконвалесцентов (n=2). У пациентов, получавших монотерапию дексаметазоном или ремдесивиром, отмечалось воспаление микрососудов. Нейтрофильное микрососудистое воспаление и интерстициальная инфильтрация не были выражены ни в одном из случаев. Неиммунная гломерулярная патология вызвала узловой диабетический гломерулосклероз у 1 (5,9%); тогда как коллапсирующий очаговый сегментарный гломерулосклероз или острая тромботическая микроангиопатия не были идентифицированы. Во всех случаях отмечалась выраженная перитубулярная капиллярная гиперемия (рис. 1В и С). Артериосклероз от умеренной до тяжелой степени и гиалиноз артериол были отмечены в 14 (82,4%) и 11 (64,7%) соответственно. Только легкий гломерулосклероз(<25%)and tubulointerstitial=""><25%)were noted="" in="" all="" 17="">

Выводы микрососудистого воспаления свидетельствовали об иммуноопосредованном повреждении в тяжелых случаях.COVID-19-ассоциированное заболевание почек. Далее мы стремились охарактеризовать молекулярный и ультраструктурный профильCOVID-19почки. Были оценены ультраструктурные, транскриптомные и протеомные профили почек семи пациентов, у которых был только легкий аутолиз и у которых была доступна фиксированная глутаральдегидом ткань для ультраструктурного исследования. Результаты сравнивали с двумя несовместимыми по возрастуCOVID-19контрольные когорты с ОПП (острая почечная недостаточность): С-АКИ(Повреждение почек, связанное с сепсисом)(все с бронхопневмонией) и НСАК. Клинические характеристики трех групп показаны в таблице 3. Средний возраст групп составил 78,71 и 74 года соответственно (P=.6). В С-АКИ было больше женщин (Повреждение почек, связанное с сепсисом)группе, чем в любой из двух других групп. Средний терминальный уровень креатинина в сыворотке составил 3,0 мг/дл, 1,6 мг/дл и 1,3 мг/дл соответственно (P=.32). Все три группы имели одинаковое количество сопутствующих заболеваний и были сопоставимы в отношении хронических микроструктурных изменений паренхимы почек.

Морфологические характеристики трех ОПП (острая почечная недостаточность)Когорты

Микроваскулярное воспаление (гломерулит и перитубулярный капиллярит) было более выраженным у пациентов сCOVID-19(5 из 7 пациентов) и С-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом)(7 из 7 пациентов) по сравнению с НС-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом)контрольная группа (0 из 7 пациентов). Мононуклеарные воспалительные клетки были преобладающим типом воспалительных клеток в обоих случаях, тогда как нейтрофилы отмечались лишь изредка и только при S-ОПП. (Повреждение почек, связанное с сепсисом). Паренхиматозное тубулоинтерстициальное воспаление было пятнистым, легким (3 из 7 пациентов) или умеренным (4 из 7 пациентов) и преимущественно мононуклеарным.COVID-19и С-АКИ (Повреждение почек, связанное с сепсисом), по сравнению с минимальным воспалением при НС-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом)контрольная группа (7 из 7 пациентов).

При ультраструктурной оценкеCOVID-19АКИ (острая почечная недостаточность). были признаки повреждения канальцев с цитоплазматической вакуолизацией, потерей щеточной каймы и повреждением митохондрий. Последний характеризовался набуханием, вакуолизацией и искривлением крист. Были идентифицированы конденсированные митохондрии и искаженные кольцевые митохондрии. Также были идентифицированы хлопьевидные уплотнения и крупные везикулы с обильными везикулами, покрытыми клатрином, напоминающими вирусные частицы (рис. 2А-С).COVID-19случаи. Отмечено повреждение эндотелия перитубулярных капилляров. Многослойность базальных мембран клубочков и перитубулярных капилляров, признаки более хронического повреждения эндотелия, не оценивались. Апоптоз эпителиальных клеток канальцев чаще встречался уCOVID-19(3,1 л/с) и S-AKI (Повреждение почек, связанное с сепсисом)(4,1/л.с.) по сравнению с НС-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом)управления (0.7/hpf (P<.001)(figure>

Исследования HC SARS-CoV-2 и гибридизации in situ на срезах почек были отрицательными во всех семи случаях.COVID-19случаи. При ультраструктурном исследовании подоцитов, эндотелия или канальцев окончательных вирусных включений выявлено не было.

ТАБЛИЦА 2. Резюме основных результатов вскрытия с акцентом на почечную патологию

Молекулярные характеристики трех ОПП (острая почечная недостаточность)Когорты

Определить фенотип клеточных инфильтратов и пространственную архитектуру ОПП. (острая почечная недостаточность)вCOVID-19почек, высокопараметрическую масс-цитометрию с визуализацией для обнаружения 23 маркеров клеточной поверхности выполняли на системе визуализации Hyperion, соединенной с времяпролетным масс-цитометром Helios (дополнительная таблица S1, доступна онлайн на http://www.mayoclinic procedure.org). ). Доказательство адаптивного иммунного ответа было предложено кластеризацией клеток CD3 CD45RO plus в тубулоинтерстициальном слое в каждом случае. Преобладающий врожденный иммунный ответ был подчеркнут обогащенной популяцией макрофагов (CD68 плюс) как в интерстиции, так и в гломерулярных капиллярных петлях (рис. 3А). Вычислительный мультиплексный анализ соседства показал, что в целом CD3 плюс CD4t-клетки были обогащены в непосредственной близости от антигенпрезентирующих клеток (HLA-DR) по сравнению с CD3CD4 Т-клетками и не-Т-клетками (рис. 3B).

Образцы почек изCOVID-19случаи и контроли были проанализированы с помощью платформы NanoString с использованием панели трансплантации органов человека nCounter, которая профилирует экспрессию 770 генов, связанных с различными путями, связанными с иммунным ответом, повреждением тканей и механизмами действия иммунодепрессантов.

Анализ экспрессии генов показал, чтоCOVID-19почки имели значительное обогащение множества функциональных наборов транскриптов аннотаций, включая апоптоз, аутофагию, экспрессию главного комплекса гистосовместимости класса I и I, а также дифференцировку Т-хелперных клеток 1 и регуляторных Т-клеток (Treg). Паттерны экспрессии геновCOVID-19случаи напоминали случаи S-AKI (Повреждение почек, связанное с сепсисом)(Рисунок 4).

В связи с воспалением, наблюдаемым вCOVID-19почек как морфологически, так и на молекулярном уровне, мы хотели выявить изменения в протеоме, которые могли бы предложить уникальные механизмыCOVID-19АКИ (острая почечная недостаточность). Поэтому мы провели количественный протеомный анализ срезов почек, фиксированных формалином и залитых парафином.COVID-19и оба набора контрольных образцов. Всего было идентифицировано 3594 белка, из которых 164 по-разному экспрессировались между группами (P<.05):87 between="" covid-19="" and=""> (Повреждение почек, связанное с сепсисом)(16 с кратностью изменения > 1,2),81 между S-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом)и НС-АКИ (Повреждение почек, связанное с сепсисом) (8 with a fold-change >1.2) и 64 междуCOVID-19и С-АКИ (острая почечная недостаточность)(6 with a fold-change >1.2). Для всех белков, обнаруженных в трех группах, была проведена иерархическая кластеризация, и была создана тепловая карта (рис. 5А). Анализ пути изобретательности показал, чтоCOVID-19АКИ (острая почечная недостаточность)почки были обогащены белками, участвующими в сигнальных путях сиртуина и некроптоза, оба вовлечены в регуляторный ответ на воспаление (дополнительная таблица S2, доступна онлайн на http://www.mayodinicproceedings.org). Активация сигнального пути церамидов была уникальнойCOVID-19почек по сравнению с НС-ОПП (Повреждение почек, связанное с сепсисом), в то время как окислительное фосфорилирование подавляется вCOVID-19АКИ (острая почечная недостаточность)(Рисунок Б).

РИСУНОК 1. Острое повреждение канальцев и инфильтрация иммунными клетками в почках, вызванных коронавирусной болезнью 2019 года.(A) Световая микроскопия коры почек показывает острое повреждение канальцев с эктазией просвета (окрашивание гематоксилином и эозином [HE], исходное увеличение * 20). (B) Отмечаются умеренная мононуклеарная интерстициальная инфильтрация и застой перитубулярных капилляров (окрашивание HE, исходное увеличение *40). (C и D) Перитубулярный капиллярит (стрелка) является заметной особенностью перегруженных капилляров (C) Микрососуды при воспалении состоят из CD3-положительных Т-клеток (E) и CD68-положительных макрофагов (F ) (исходное увеличение * 40 для E и F).