Решающие роли TRPM6 в циркадной регуляции артериального давления

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Значение почечного ионного канала TRPM6 в циркадной секреции ренина для повышения артериального давления

Йосуке Фунато, Дайсуке Ямадзаки, Дайсуке Окадзаки, Нобухико Ямамото и Хироаки Мики

Кровяное давлениеимеет дневной характер с более высокими значениями в активный период. Его повышение в начале активного периода существенно увеличивает риск фатальных сердечно-сосудистых событий. Секреция ренина, стимулируемая почечными симпатическими нейронами, считается важной для этого процесса; однако его регулирующий механизм остается в значительной степени неизвестным. Здесь мы показываем важностьтранзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6 (TRPM6), Mg2 plus-проницаемый катионный канал, увеличивающий секрецию ренина в активный период.TRPM6экспрессия значительно снижена в дистальных извитых канальцах гипотензивных мышей с дефицитом Cnnm2-. Мы генерируем специфичные для почекTRPM6-дефицитных мышей и наблюдают снижениекровяное давлениеи исчезновение его циркадных вариаций. Следовательно, секреция ренина не увеличивается в активный период. Кроме того, секреция ренина после фармакологической активации -адренорецептора, мишени стимуляции нейронов, отменяется, а экспрессия рецептора снижается в ренин-секретирующих клетках. Эти результаты указывают на решающую рольTRPM6 в циркадной регуляциикровяное давление.

По оценкам, примерно один миллиард человек во всем мире страдает гипертонией, что значительно увеличивает риск различных заболеваний, в том числе потенциально смертельных, таких как ишемическая болезнь сердца и инсульт. Известно, что эти смертельные случаи, связанные с гипертонией, часто происходят рано утром, в начале активного периода, когдакровьдавлениерезко поднимается. Секреция ренина, запускаемая почечными симпатическими нейронами, играет ключевую роль в этом процессе.кровяное давлениевозвышения, но механизм его регуляции изучен недостаточно².

бодибилдинг

Общепризнанно, что некоторые пищевые минералы, особенно натрий и калий, играют важную роль в контролекровьдавление. Магний является основным важным элементом, участвующим в различных биологических процессах. Эпидемиологические исследования показали значительную обратную зависимость между содержанием магния в пище и риском гипертонии3-6. Кроме того, экскреция магния с мочой, которая, как предполагается, находится в приблизительном равновесии с абсорбцией магния кишечником, обратно коррелирует с риском артериальной гипертензии. Эти данные свидетельствуют о тесной связи между гомеостазом магния в организме икровяное давлениерегуляции, подчеркивая важность Mg2 плюс каналов и/или транспортеров в регуляциикровяное давление.

В почках постоянно реабсорбируется большое количество магния. Большая часть магния в клубочковом фильтрате реабсорбируется в толстой восходящей части петли Генле, но последний этап реабсорбции происходит в дистальном извитом канальце (DCT)8. Последний процесс жестко регулируется, чтобы регулировать количество реабсорбции до уровня, подходящего для поддержания гомеостаза магния. Геномный анализ врожденных заболеваний с симптомами гипомагниемии выявил несколько ключевых молекул, участвующих в этом процессе.TRPM6, кодированиетранзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6(TRPM6), который мутирует у пациентов с рецессивной гипомагниемией со вторичной гипокальциемией2,10.TRPM6образует проницаемый для Mg2 плюс ионный канал, локализованный на апикальной мембране клеток DCT, и обеспечивает поступление Mg2 плюс из просвета канальцев1. Другой ключевой молекулой является циклин M2 (CNNM2) и переносчик Mg2 плюс, локализованный на базолатеральной мембране клеток DCT12,13. Мутации Cnnm2 вызывают семейную доминантную гипомагниемию, которая характеризуется дефектами реабсорбции магния в почках12. Cnmm2-дефицитные мыши демонстрируют сходные симптомы гипомагниемии с потерей магния в почках14. Точная молекулярная роль CNNM2 все еще остается спорной, но несколько линий доказательств предполагают, что он опосредует отток Mg2 плюс отток из клеток DCT через базолатеральную мембрану15, тем самым способствуя реабсорбции магния. Дальнейший анализ мышей с 2-дефицитом Cnnm показал, что у этих мышей также значительно нижекровьдавлениечем контрольные мыши4. Однако механистические детали и участие других каналов/транспортеров Mg2 plus в этомкровьдавлениерегулирования остаются неизвестными.

Также известно, что почечная DCT играет критическую роль вкровьдавлениерегулирование, потому что он значительно реабсорбирует натрий и регулирует объем жидкости в организме6. Ряд катионных каналов/транспортеров, таких как котранспортер Na-Cl (NCC), эпителиальный натриевый канал (ENaC) и обменник Na plus/H plus 2 (NHE2), экспрессируются на апикальной мембране DCT, а некоторые из эти белки опосредуют поглощение Na+ клетками DCT из просвета канальцев. Затем внутриклеточный Na plus вытесняется из клеток через базолатеральную мембрану с помощью Na plus /K plus -ATPase для осуществления его реабсорбции. Помимо прямого участия в регуляции объема жидкости в организме, DCT расположен рядом с плотным пятном, которое контролирует секрецию ренина, гормона, играющего основную роль в оркестровке.кровяное давлениерегулирование17,18. Определяя уровни Cl- в моче, клетки плотного пятна стимулируют близлежащие юкста-гломерулярные (JG) клетки к секреции ренина.

В этой работе мы проводим анализ транскриптома с почками гипотензивных мышей с дефицитом Cnnm2-. Мы обнаруживаем значительное снижениеоборотов6, побуждая нас генерировать специфичные для почекоборотов6-дефицитные мыши. Неожиданно анализы этой линии мышей выявили фенотип, качественно отличный от фенотипа Cnnm2-дефицитных: потеря циркадных вариацийкровьдавление. Мы также находим, что этот фенотип вызван нарушением секреции ренина,кровяное давление-гормон, уровень которого в норме повышен в активной фазе.

бодибилдинг

Полученные результаты

ПонижениеTRPM6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)экспрессия у мышей с дефицитом Cnnm2-. Для изучения молекулярного механизмакровяное давлениеснижение у мышей с дефицитом Cnnm2-, мы провели анализ ДНК-микрочипов, чтобы исследовать изменения экспрессии генов в почках Cnnm2f/il; Шесть 2-мышей Cre с отсутствием обоих аллелей Cnnm2 в почках l4. Среди дифференциально экспрессируемых генов (таблица 1) мы выбрали для анализа Pvalb иоборотов6, оба из которых выражены в DCT919. Количественный анализ ПЦР (кПЦР) показал, чтооборотов6экспрессия была одинаково снижена в почках обоих Cnnm2fi; Шесть2-мышей Cre и Cnnm2 plus /. Поскольку оба Cnnm2 плюс /A и Cnnm2fi/; Шесть 2-мышей Cre были гипотензивными4, мы проанализировалиTRPM6 выражение более подробно. Иммуноблот-анализ лизатов почек подтвердил значительное снижениеTRPM6на уровне белка из-за дефицита Cnnm2-, в то время как уровни NCC и фосфорилированного NCC (активная форма) не были заметно затронуты, экспрессия CNNM2 была подтверждена последовательными анализами иммунопреципитации и иммуноблоттинга). уменьшениеTRPM6в почках Cnnm2f/i; Шесть мышей 2-Cre также были подтверждены иммунофлуоресцентным анализом.

Мы также рассмотрелиTRPM6экспрессия у мышей, лишенных CNNM4, которые также проявляют симптомы гипомагниемии,20 но имеют повышенный уровенькровяное давление4. Иммуноблоттинг и иммунофлуоресцентный анализ показали, чтоTRPM6экспрессия увеличивается в клетках DCT мышей с дефицитом Cnnm4-, что позволяет предположить, чтоTRPM6выражение тесно связано скровяное давлениезначений, но это не связано напрямую с уровнем магния в крови.

РегулированиеTRPM6экспрессия внутриклеточным Mg2 plus в клетках DCT. Охарактеризовать молекулярный механизмTRPM6 подавления у мышей с дефицитом Cnnm2-, мы использовали клеточную линию MDCT21, полученную из DCT, которая экспрессирует преимущественно Cnnm2 и умеренно Cnnm3 и Cnnm4 среди генов семейства Cnnm. Поскольку CNNM2 и CNNM4 обладают сильной активностью Mg2 плюс отток, в то время как CNNM3 не имеет активности Mg2 плюс отток15, мы выполнили опосредованный малой интерферирующей РНК (миРНК) нокдаун Cnnm2, Cnnm4 или обоих. Нокдаун Cnnm2 увеличивал внутриклеточные уровни Mg plus ([Mg plus]), а одновременный нокдаун Cnnm4 приводил к небольшому повышению среднего [Mg2]; значение, которое не было статистически значимым. Далее мы рассмотрелиоборотов6экспрессии с помощью qPCR и обнаружил значительное снижение после нокдауна Cnnm2 и гораздо большее снижение после двойного нокдауна Cnnm2 и Cnnm4. Следовательно,оборотов6экспрессия, по-видимому, отрицательно регулируется внутриклеточными уровнями Mg2 plus, что согласуется с предыдущими сообщениями23. Чтобы непосредственно изучить важность Mg2 plus, мы культивировали клетки MDCT в среде с различными концентрациями Mg2 plus .1h, снижение внеклеточной концентрации Mg2 plus приводило к снижению внутриклеточного уровня Mg2 plus и увеличениюоборотов6экспрессия, предполагающая супрессорную роль Mg2 plus. В случае двойного нокдауна (Cnnm2/Cnnm4) клеток MDCT,оборотов6экспрессия была подавлена ​​с уменьшением Mg2 плюс

плюс концентрации до 0,2 мМ, но дальнейшее снижение отменяло подавляющий эффект; как внутриклеточный Mg2 plus, так иоборотов6уровни существенно не отличались от контрольных клеток, трансфицированных миРНК, как в условиях 0.1, так и в условиях 0.02 мМ. Эти результаты указывают на Mg2 plus-зависимый регуляторный механизмоборотов6выражение, объясняющееоборотов6подавление в почках мышей с дефицитом Cnnm2-.

Условное нарушениеоборотов6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)в почке. Далее мы стремились создатьоборотов6-дефицитных мышей для дальнейшего изучения важностиTRPM6в регулированиикровяное давление. Мы использовали клон эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, несущий рекомбинантныйоборотов6аллель (оборотов6-), которая содержит акцепторную последовательность сплайсинга, вызывающую преждевременный сплайсинг мРНК и приводящую к усечению мРНК после экзона 6. Химерных гетерозиготных мышей получали путем инъекции бластоцисты ES-клеток, и рекомбинацию подтверждали с помощью ПЦР. Мы скрестили этиоборотов6плюс/- мыши, но нетоборотов6-/--от_весны. Этот результат согласуется с предыдущими отчетами, показывающими эмбриональную летальность воборотов6-дефицитные мыши24,25

Поэтому мы выполнили почечно-специфическое условное нарушениеоборотов6с помощью Six2-Cre, который обеспечивает эффективную и специфическую экспрессию рекомбиназы Cre, слитой с GFP, в эмбриональной почке.оборотов6fl/, шесть2-мышей Cre (специфические для почекоборотов6-дефицитные мыши) родились с ожидаемым менделевским соотношением. Для определения выраженияTRPM6мы провели иммуноблот-анализ с использованием анти-TRPM6антитело.TRPM6уровень белка значительно снижен в почкахоборотов6fl/fl, шесть2-мышей Cre, но никаких существенных изменений в других органах не наблюдалось. Анализы иммунофлуоресцентного окрашивания также не показали экспрессииTRPM6в NCC-положительных клетках DCT. Мы не наблюдали значительныхTRPM6-положительный сигнал в более чем 100 таких скоплениях NCC-позитивных клеток, что свидетельствует о том, чтоTRPM6экспрессия практически полностью подавлена ​​в клетках DCT Trpmfi/; Шесть2-мышей Cre. Эти результаты подтверждают успешное получение специфичных для почекоборотов6-дефицитные мыши.

Сначала мы изучили влияние почечных специфическихоборотов6-дефицит гомеостаза магния. Мы содержали мышей в метаболических клетках и собирали образцы мочи и сыворотки, которые затем подвергали колориметрическому количественному определению уровней магния с использованием Xylidyl Blue-I. Уровни магния в сыворотке были значительно ниже уоборотов6л/л; Шесть2-мышей Cre по сравнению с контрольной группойоборотов6плюс/плюс; Шесть мышей 2-Cre, тогда как уровень магния в моче был выше. Мы также провели анализ эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-ES) для измерения нескольких основных металлических элементов в сыворотке и обнаружили, что только уровни магния были значительно затронуты в Trpmd/; Шесть2-мышей Cre. Эти результаты ясно показывают, что у мышей с дефицитом Trpm6-, специфичных для почек, наблюдается гипомагниемия с почечной тратой магния, как это наблюдается у мышей с дефицитом Cnnm2-4, специфичных для почек.

Отсутствие циркадной вариациикровьдавлениеи активность ренина. Далее мы подверглиоборотов6я/л; Шесть2-мышей Cre длякровьдавлениеизмерения с помощью радиотелеметрии. Систолическое и диастолическоекровяное давлениеоба значения были значительно ниже воборотов6л/; Шесть2-мышей Cre, чем у контрольных мышей. Примечательно, что обычная циркадная вариациякровяное давление, с высокими значениями в темный период и низкими значениями в световой период у мышей, не наблюдалось у мышей.оборотов6ф/л; Шесть2-мышей Cre. Чтобы проверить, нормально ли протекает циркадный ритм, мы использовали радиотелеметрию для измерения двигательной активности мышей и подтвердили очень четкие циркадные колебания воборотов6л/; Шесть{{0}}мышей Cre. Мы также исследовали уровни вазопрессина (AVP) в крови и уровни мРНК двух часовых генов Bmall и Per2 в головном мозге и почках; известно, что все они демонстрируют типичные циркадные вариации27,28. Мы анализировали в шести разных временных точках (0, 4, 8 часов по Гринвичу (ZT) для светлого периода и 12, 16, 20 часов ZT для темного периода). У контрольных мышей наблюдаются четкие циркадные паттерны их экспрессии, как сообщалось ранее28, и опять же, мы не обнаружили существенных аномалий воборотов6/ил; Шесть2-мышей Cre. Мы также проверили уровень экспрессии Trpm7, который кодирует Mg2 плюс-проницаемый канал, тесно связанный сTRPM6, в почках. Паттерны экспрессии были очень похожи у обоихоборотов6плюс/плюс; Шесть2-Cre и Trpm6f/; Шесть 2-мышей Cre, и не было выявлено четких циркадных закономерностей. В совокупности мы делаем вывод, что циркадный ритм протекает нормально воборотов6я; Шесть2-мышей Cre. Считалось, чтокровьдавлениеповышение в течение активного периода (темнового периода для мышей и светлого периода для людей) как у людей, так и у мышей происходит в ответ на увеличение секреции ренина в кровь2. Мы измерили активность ренина в образцах крови, собранных в шесть различных моментов времени, описанных выше. Отчетливое повышение активности ренина в крови наблюдалось в темные периоды в образцах от контрольных мышей, но не наблюдалось значительного повышения в образцах от мышей из контрольной группы.оборотов6/lШесть2-мышей Cre. Мы также измерили уровень норадреналина в крови, высвобождение которого, как известно, стимулируется активацией ренин-ангиотензиновой системы29,30. Как и ожидалось, их циркадные вариации также исчезли воборотов6, Шесть2-мышей Cre. В то же время уровень белка ангиотензиногена (АГТ) в крови, другой молекулы, ограничивающей скорость активации ренин-ангиотензиновой системы у мышей31, не подвергался влиянию.оборотов6 дефицит. Результаты показывают, что нарушение циркадных колебаний ренина важно для потери циркадных колебанийкровьдавлениепооборотов6-дефицит.

БлизостьTRPM6-экспрессирующих клеток в ренин-секретирующие клетки. Ренин экспрессируется и секретируется JG-клетками в почках17,18. JG-клетки находятся в непосредственном контакте с плотным пятном, которое расположено рядом с DCT и стимулирует секрецию ренина из JG-клеток в ответ на снижение уровня Cl в моче18. Иммунофлуоресцентное окрашивание на ренин и нейрональную синтазу оксида азота (nNOS), маркер плотного пятна, не выявило аномалий ни в характере, ни в интенсивности положительных сигналов, наблюдаемых вблизи клубочков воборотов6ж/; Шесть2-мышей Cre. Следовательно, клетки, непосредственно участвующие в секреции ренина и ее регуляции, по-видимому, не подвергаются заметному влиянию.оборотов6дефицит. В качествеTRPM6коэкспрессируется с NCC в DCT, мы затем исследовали пространственные отношения междуTRPM6/NCC-экспрессирующие клетки (DCT) и клетки macula densa или JG. Конфокальные изображения сагиттальных срезов DCT показали почти полное перекрытиеTRPM6и сигналы NCC по всему DCT. Затем мы окрашивали nNOS и NCC и обнаружили, что области, положительные для nNOS и NCC, связаны без какого-либо перекрытия сигналов. Кроме того, двойное окрашивание для ренина иTRPM6/NCC обнаружил, что некоторыеTRPM6/NCC-экспрессирующие клетки находятся рядом с экспрессирующими ренин JG-клетками, что позволяет предположить, чтоTRPM6/NCC-экспрессирующие клетки, а также плотное пятно могут оказывать значительное влияние на секрецию ренина.

Нарушение секреции ренинаоборотов6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)дефицит. В целом, вегетативная нервная система играет решающую роль в управлении циркадным ритмом. Секреция ренина JG-клетками в активный период, как полагают, стимулируется норадреналином, секретируемым почечными симпатическими нейронами32. Чтобы непосредственно исследовать влияние такой стимуляции на секрецию ренина, мы подготовили срезы почек и стимулировали их изопротеренолом, агонистом -адренорецепторов (AR). Результаты показали очень четкое снижение ренин-положительного сигнала, остающегося в срезе после стимуляции изопротеренолом в течение 30 минут. Количественный анализ показал, что процент клубочков, окруженных ренин-положительным сигналом, уменьшился примерно с 80 до 30 процентов после стимуляции изопротеренолом, что указывает на возникновение массивной секреции ренина. Однако мы не наблюдали значительного влияния стимуляции изопротеренолом на сигнал ренина в срезах почек изоборотов6/1; Шесть2-мышей Cre. Для подтверждения результата мы также измерили активность ренина в крови после введения изопротеренола. Результаты показывают, что значительное повышение активности ренина в крови наблюдалось только у контрольных мышей, в то время как увеличение частоты сердечных сокращений обычно наблюдалось у обеих линий. Эти результаты указывают на то, что секретирующие ренин клетки JG не могут реагировать на стимуляцию почечных симпатических нейронов, что согласуется с исчезновением циркадного увеличениякровьдавлениеи активность ренина втрм6л/фл; Шесть2-мышей Cre.

Клетки JG также можно стимулировать к секреции ренина в ответ на простагландины, среди которых простагландин E2 (PGE2) считается наиболее важным, поскольку он физиологически секретируется клетками macula densa, когда уровни Cl- в моче снижаются17,18. Более того, также известно, что обработка срезов почек ПГЕ может эффективно стимулировать секрецию ренина33. Стимуляция клеток JG с помощью PGE2 и изопротеренола обычно активирует продукцию цАМФ, что в конечном итоге вызывает секрецию ренина. Поэтому мы также проверили действие PGE, и мембранопроницаемый аналог цАМФ, дибутил-цАМФ (db-cAMP).PGE2 и db-cAMP успешно стимулировали секрецию ренина в срезах почек из Trpmdi/A, Six2- Мыши Cre и контрольные мыши. Это указывает на то, чтооборотов6 дефицит не отменяет общий механизм, участвующий в восприятии внешних сигналов, ретрансляции внутриклеточных сигналов и выполнении секреции ренина, но он специфически влияет на реакцию на -AR.

Снижение экспрессии -AR в клетках JG наоборотов6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)дефицит. Нарушенный ответ рецептора -ARтрм6л/л; Шесть мышей 2-Cre побудили нас исследовать состояние экспрессии рецептора -AR, и поэтому мы провели иммунофлуоресценцию 1-AR, основного подтипа -AR, экспрессируемого в клетках JG34. Как сообщалось ранее34, мы обнаружили полосообразную картину окрашивания в срезах почек как контрольных мышей, так и мышей Trpmdi/l, Six2-Cre. Известно, что 1-AR сильно экспрессируется как в кровеносных сосудах, так и в клетках JG34, и последовательно 1-AR-положительные клетки в конце полосообразного окрашивания в почках контрольных мышей также были положительными. для окрашивания ренина (показано стрелкой). Напротив, окрашивание Trpm6l/fl; В почках шести 2- мышей Cre было обнаружено меньшее количество 1- AR/ренин-двойных положительных клеток, что свидетельствует о снижении экспрессии 1-AR в клетках JG. Чтобы подтвердить этот вывод, мы выделили клетки JG, используя метод центрифугирования в градиенте плотности Percoll в соответствии с предыдущим отчетом35. Иммуноблоттинг-анализ показал, что ренин-положительные клетки JG обогащены фракцией полосы 3, что согласуется с их отчетом35, и экспрессия 1-AR в этой фракции полосы 3 была значительно ниже в Trpmdi/1; Шесть2-мышей Cre. В совокупности мы обнаружили, чтооборотов6дефицит снижает уровень экспрессии 1-AR в клетках JG, что согласуется с нарушением секреции ренина.

Влияние искусственного вмешательства на циркадныекровьдавлениевариация. В последней серии экспериментов мы проверили влияние различных вмешательств на циркадные ритмы.кровьдавлениевариация. Чтобы подтвердить важность ренина, мы вводили клинически доступный ингибитор ренина aliskiren36 мышам дикого типа. Нравитьсяоборотов6абляции введение алискирена путем хирургической имплантации осмотической минипомпы значительно подавляло циркадныекровьдавлениевариация. Затем мы выполнили операции по денервации почек, поскольку активация -AR на клетках JG через симпатическую нервную систему является основным путем стимуляции секреции ренина циркадным образом2. Опять же, мы обнаружили, что вмешательство подавлялокровьдавлениевариация. Эти результаты согласуются с нашей моделью, согласно которой дефекты -AR-реакции и секреции ренина ответственны за потерюкровяное давлениеизменение Tpmdl/л; Шесть2-мышей Cre.

Мы также проверили влияние повышения содержания магния в рационе. С этой целью мышам дикого типа давали диету с высоким содержанием магния, содержащую 0,6% (нормальная диета: 0,3% магния) в течение 1 месяца. Как и ожидалось, у этих мышей был повышен уровень магния в крови. Затем мы проверили уровень экспрессииTRPM6в ДКП; он резко снизился при кормлении пищей с высоким содержанием магния, а степень сниженияTRPM6экспрессия была больше, чем абляция почечного Cnnm2. Когда мы измериликровяное давлениеу этих мышей мы обнаружили, что у мышей, получавших диету с высоким содержанием магния, наблюдались значительно меньшиекровьдавлениеизменение, чемоборотов6-дефицитных мышей, что согласуется с нашим представлением о том, что почечныеTRPM6важно для циркадныхкровяное давлениевариация.

Таблица 1. Гены, экспрессия которых повышалась или подавлялась в почках Cnnm2flfl/flfl; Шесть2-мышей Cre.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали важностьTRPM6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)в регулированиикровяное давление. В частности, мы показываем почти полное исчезновение циркадной вариациикровяное давлениев почкахоборотов6-дефицитные мыши. Мы также обнаружили, что секреция ренина, ключевого гормона, отвечающего за артериальное давление, резко снижена уоборотов6-дефицитных мышей, что согласуется с наблюдаемымикровяное давлениефенотип. В нескольких отчетах показано, что TRPM7, еще один проницаемый для Mg2 плюс канал, очень похожий наTRPM6, также влияет на кровяное давление37,38. TRPM7 предотвращает увеличениекровяное давлениепри введении ангиотензина II путем подавления реакции эндотелиальных клеток сосудов на ангиотензин II37. Напротив, недавно сообщалось, что TRPM7 также способствует повышениюкровяное давлениепри введении лептина путем опосредования притока Mg2 plus в клетки каротидного тела38. Таким образом, роль TRPM7 вкровяное давлениерегулирование неоднозначное. Однако, поскольку уровень экспрессии TRPM7 в почках не зависел от почечныхоборотов6абляции (дополнительная рис. 5), похоже, что TRPM7 не принимает непосредственного участия в фенотипах, наблюдаемых в этом исследовании.

Как наблюдалось у мышей с дефицитом Cnnm2-,кровяное давлениезначения были снижены воборотов6-дефицитные мыши (рис. 2) 14. Однако следует отметить, что между этими мышами была четкая разница. Нарушение Cnnm2 в целом сниженокровяное давление, но циркадные вариации все еще четко наблюдались. Напротив, эта вариация исчезла воборотов6-дефицитные мыши. Такая качественная разница также согласуется с нашим наблюдением, что циркадные колебания ренина сохранялись у мышей с дефицитом Cnnm 2- (дополнительная рис. 9). Следует отметить, что как CNNM2, так иTRPM6считаются важными для реабсорбции Mg2 plus в почках путем опосредования векторного транспорта Mg2 plus через DCT, и действительно, мыши с дефицитом любого гена проявляли идентичный фенотип почечного Mg2 plus-истощение (Fig. 1 and ref. 39). Качественное отличиекровяное давлениефенотип между Cnnm2-иоборотов6Мыши с дефицитом Mg2 предполагают, что Mg2 плюс транспорт в DCT, общая функция двух молекул, не участвует напрямую в циркадных вариацияхкровяное давлениеи секрецию ренина, предполагая, что CNNM2-независимая рольTRPM6лежит в основе этих интригующих фенотипов.

Несколько механизмов работают, чтобы стимулировать секрецию ренина JG-клетками для поддержаниякровяное давление. Среди них считается, что вход от почечных симпатических нейронов играет основную роль в увеличениикровяное давлениев активный период циркадных вариаций32. Эти нейроны секретируют норадреналин, который связывается и активирует -AR на клетках JG, чтобы стимулировать продукцию цАМФ, что в конечном итоге приводит к секреции ренина1732. В наших опытах использовали срезы почек, полученные изоборотов6-дефицитных мышей стимуляция изопротеренолом, агонистом -AR, не оказывала влияния на секрецию ренина, в то время как стимуляция PGE2 или db-cAMP эффективно увеличивала секрецию ренина (рис. 4). PGE2 секретируется плотным пятном в ответ на низкие уровни Cl- в моче и активирует рецепторы EP2 и EP4 на клетках JG, которые, как и активация -AR, в конечном итоге стимулируют продукцию цАМФ40. Следовательно, эти результаты подразумевают, что передача сигналов -AR избирательно аннулируется в клетках JG.оборотов6-дефицитных мышей, не влияя на нижестоящий сигнальный путь, опосредованный цАМФ. Соответственно, иммунофлуоресценция срезов почек мыши и иммуноблоттинг выделенных клеток JG показали, что экспрессия -AR была значительно снижена в клетках JG.оборотов6-дефицитные мыши (рис. 5). Такая сниженная экспрессия -AR должна сделать JG-клетки неспособными секретировать ренин в ответ на стимуляцию симпатического нерва в течение активного периода, тем самым устраняя циркадные колебания уровня ренина в крови икровяное давление. Следует отметить, что есть исследование с использованием мышей с нокаутом 1/ 2-AR, которое показало снижение циркадного ритма.кровяное давлениеизменение какоборотов6-дефицитные мыши41. Они связывают это со снижением двигательной активности, но остается возможным, что снижение циркадных вариаций активности ренина способствует уменьшению циркадных вариаций активности ренина.кровяное давлениеe. В качестве альтернативы, необычный фон их мышей (смешанный фон C57BL6/J, 129 и VFB; мы использовали чистый фон C57BL6/) может маскировать эффект -AR накровяное давлениевариация; генетический фон имеет решающее значение для циркадныхкровяное давлениевариант42.

бодибилдинг

Как потеряTRPM6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)в клетках DCT приводит к снижению экспрессии -AR в клетках JG, остается неуловимым. Эксперименты с использованием других типов клеток показали, что экспрессия -AR регулируется различными молекулами, которые, как известно, опосредуют межклеточную передачу сигналов: добавление глюкокортикоидов в культуральную среду клеточной линии, происходящей из семявыносящего протока DDT1 MF-2, увеличивает экспрессию -AR43. Также сообщалось, что оксид азота (NO) подавлял деградацию -AR в клетках сердца посредством S-нитрозилирования GRK24. Среди этих молекул следует отметить, что NO секретируется клетками почечного пятна densa, стимулируя JG-клетки паракринным образом для увеличения секреции ренина 45 . В то время как экспрессия nNOS, фермента, продуцирующего NO в почках, ограничена клетками macula densa, они находятся в прямом контакте с клетками DCT, следующим сегментом почечных канальцев6. Таким образом, возможно, чтооборотов6-дефицит клеток DCT приводит к снижению экспрессии -AR в клетках JG, влияя на продукцию или высвобождение NO из соседних клеток macula densa.

Известно, что JG-клетки также взаимодействуют с другими клетками, образуя щелевые контакты с окружающими клетками, такими как мезангиальные клетки, и получают Ca2 plus для подавления секреции ренина7. Хотя клетки JG и клетки DCT не контактируют напрямую друг с другом, они все же расположены близко (ссылка 46 и рис. 3), и возможно, что эти клетки используют щелевые соединения через промежуточные клетки, такие как мезангиальные клетки; все три типа клеток, как сообщается, экспрессируют Cx3747,48, изоформу коннексина, которая олигомеризуется и образует щелевые соединения. Дальнейший анализ может выявить молекулу и путь, ответственный за межклеточную передачу сигналов между клетками DCT и JG, что важно для раскрытия общего механизма нарушения циркадных ритмов.кровяное давлениевариация наоборотов6-дефицит.

Воборотов6-дефицитных мышей исчезли циркадные колебания уровней не только ренина, но и норадреналина в крови. Активация ренин-ангиотензиновой системы стимулирует высвобождение норадреналина в кровоток29,30, поэтому кажется разумным, что эффектоборотов6 (транзиторный рецепторный потенциал, связанный с меластатином 6)абляция уровней ренина и норадреналина в крови была одинаковой. Поскольку норадреналин также действует на -AR клеток JG, стимулируя секрецию ренина, предполагается, что две молекулы образуют петлю положительной обратной связи, стимулируя секрецию друг друга. Однако следует отметить, что результаты экспериментов по введению изопротеренола явно показывают дефект секреции ренина (рис. 4), и, таким образом, он, по-видимому, является основной причиной потери циркадных колебаний как ренина, так и норадреналина.

К настоящему времени разработано множество эффективных лекарств, которые используются для лечения пациентов с артериальной гипертензией. Однако у значительного числа пациентов наблюдается резистентность к традиционным методам лечения, в которых используется комбинация основных антигипертензивных препаратов с различным функциональным механизмом4. Хирургическая денервация почечных симпатических нейронов с использованием эндоваскулярных катетеров была проведена на экспериментальной основе для лечения такой резистентной гипертензии50. Его практическая эффективность в улучшениикровяное давлениеконтроль был спорным51,52, но недавно опубликованные исследования показали значительное снижениекровяное давлениепо сравнению с фиктивным контролем53,54. Имеются также смешанные результаты о влиянии почечной денервации на циркадные вариациикровяное давление. Некоторые отчеты показали, что степенькровяное давлениеснижение за счет почечной денервации было больше в активные периоды53, но другие не сообщили об изменении циркадных вариацийкровяное давление55,56. При анализе с использованием лабораторных животных наши операции по денервации почек против мышей подавляли циркадные вариациикровяное давление(рис.6). Аналогичные операции проводились и с крысами, но даже у контрольных крыс дикого типа циркадные ритмы практически отсутствуют.кровяное давлениевариации в первую очередь57,58, что затрудняет оценку эффекта операции. Необходимы дополнительные исследования, чтобы прояснить влияние почечной денервации на циркадные ритмы.кровяное давлениевариации, что также помогло бы нам понять более детальный механизмкровяное давлениенарушение регуляцииоборотов6-дефицит.

Телеметрические измерениякровяное давление, частота сердечных сокращений и двигательная активность. Телеметрические измерениякровяное давлениебыли выполнены следующим образом4.Кровяное давлениеДатчики (TAL1PA-C10, Data Sciences International) хирургическим путем вводили в левую общую сонную артерию мышей от 2- до 3-месячного возраста под анестезией (путем внутрибрюшинного введения 0,3 мг/сутки). кг медетомидина, 4 мг/кг мидазолама и 5 мг/кг буторфанола). Через 3 недели восстановления систолическое и диастолическоекровяное давлениезначения были записаны с запланированной выборкой 2-мин каждые 60 минут с использованием программного обеспечения Dataquest ART (Data Sciences International). Записи были получены в течение по крайней мере пяти дней подряд, а средние значения измерений, снятых в одно и то же время каждый день, были определены для каждой мыши и использованы для дальнейшего статистического анализа, за исключением дополнительной рис. 4. На основании Nakamori et al. денервация проводилась за 2 недели до установкикровяное давлениепреобразователи следующим образом. Почки обнажают путем разреза брюшной полости и рассекают соединительную ткань вокруг почечных сосудов. Затем почечные сосуды погружали в 95%-ный этанол на 2 мин, а затем в PBS на 2 мин. Имитацию операции проводили по аналогичной методике без погружения в этанол. Алискирен вводили в дозе 25 мг/кг/сут путем подкожной установки осмотической помпы (1004, ALZET), запись начинали со дня после введения помпы. В качестве добавки магния мышам давали диету, обогащенную магнием, содержащую 0,6% магния (CLEA Japan) в течение 1 месяца до начала эксперимента.кровяное давлениеизмерение.

Частота сердечных сокращений измерялась с помощью той же радиотелеметрической системы, за исключением того, что запись выполнялась с запланированной выборкой 30-s каждую минуту, а одно измерение использовалось для дальнейшего анализа.

Двигательную активность оценивали с помощью той же радиотелеметрической системы, наблюдая за изменениями силы сигнала от преобразователя в связи с передвижением животного. В этом случае датчики хирургическим путем вводили в подкожное пространство на правом фланге. Записи проводились с теми же временными интервалами, что и описанные выше.

бодибилдинг

использованная литература

1. Джайлз Т.Д. Циркадный ритмкровяное давлениеи отношение к сердечно-сосудистым событиям. J. гипертензии. 24, S11-S16 (2006).

2. Смоленский М.Х., Порталуппи Ф. и Эрмида Р.С.Кровяное давлениеМониторинг в сердечно-сосудистой медицине и терапии, 3-е издание EDT (ред. Уайт, ВБ), часть II, глава 6, 105-128 (Springer, 2016).

3. Виттеман Дж. С соавт. Проспективное исследование пищевых факторов и гипертонии среди женщин США. Тираж 80, 1320-1327 (1989).

4. Ашерио, А. и др. Проспективное исследование факторов питания и гипертонии среди мужчин в США. Тираж 86, 1475-1484 (1992 г.).

5. Ашерио, А. и др. Проспективное изучение факторов питания,кровяное давление, и гипертензия среди женщин США. Гипертония 27,1065-1072(1996).

Примечание:приведенное выше не является полным справочным списком