Новые эффекты комбинированной терапии за счет ингибирования индуцированного каспазы -1/гасдермином D пироптоза при волчаночном нефрите

Для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Хэн Цао, Цзюнюй Лян, Цзин Лю, Е Хе, Ини Кэ, Идуо Сун, Сун Цзян и Цзинь Линь

АННОТАЦИЯ

Цели: комбинированная терапия микофенолата мофетилом, такролимусом и стероидами эффективна для достижения полной ремиссии вволчаночный нефрит(ЛН). Комбинированная терапия уникальным образом подавляет активность каспазы-1 по сравнению с монотерапией, которая может расщеплять гасдермин D (GSDMD) и недавно была идентифицирована какпироптозпалач. Поэтому мы исследовали, позволяет ли комбинированная терапия подавлять опосредованную каспазой -1/GSDMDпироптозв ЛН (волчаночный нефрит).

Нажмите, чтобы увидеть Cistanche Deserticola ma для лечения нефрита

Методы: Экспрессия и активация GSDMD были обнаружены в образцах почек человека и мыши с ВН (волчаночный нефрит) с использованием иммуногистохимического окрашивания и иммуноблоттинга. Первичные подоциты, выделенные из мышей MRLlpr, инкубировали с LPS плюс АТФ и предварительно обрабатывали монотерапией или комбинированной терапией. Ингибирование каспазы-1/GSDMD-индуцированногопироптозс помощью комбинированной терапии оценивали на мышах MRLlpr и образцах человека. Меня обследовали с помощью набора FAM caspase-1 и проточной цитометрии. Корреляция междупироптозв периферической крови и анализировали индекс активности системной красной волчанки (SLEDAl).

Результаты: Образцы почечной ткани из ЛУ (волчаночный нефрит) у пациентов и мышей наблюдались значительно повышенные уровни экспрессии и расщепления GSDMD. В культивируемых подоцитах комбинированное лечение значительно подавляло активацию NLRP3 и каспазы-1 и снижало N-концевые уровни GSDMD. Комбинированная терапия подавляла прогрессирование заболевания за счет ингибирования каспазы -1/GSDMD-опосредованногопироптозкак у людей, так и у мышей MRL/LPR. Каспаза-1/PI-положительные числа клеток в периферической крови положительно коррелировали с SLE-DA1. ЛН (волчаночный нефрит) у пациентов с полной ремиссией и частичной ремиссией было значительно снижено количество клеток, положительных по каспазе-1/PI, по сравнению с исходным уровнем. Ac-FLTD-CMK, производный от GSDMD ингибитор, предотвращал развитие ВН (волчаночный нефрит).

Вывод: комбинированная терапия подавляла каспазу-1/GSDMD-опосредованнуюпироптозin vitro и in vivo и замедление прогрессирования заболевания.

Ключевые слова:волчаночный нефрит, пироптоз, каспаза-1, гасдермин D, терапия

Лечебная терапия дляпироптоз

ВВЕДЕНИЕ

волчаночный нефрит(ВН) — воспаление почек, возникающее вследствие аутоиммунного заболевания системной красной волчанки (СКВ).волчаночный нефрит) является основным проявлением у пациентов, страдающих СКВ. Примерно у 60% пациентов развивается это состояние, примерно у 20% оно прогрессирует до терминальной стадии болезни почек (ТПН) (1). Комбинированная терапия с микофенолата мофетилом (MMF), ингибиторами кальциневрина (CNI) и стероидами дает дополнительные эффекты, а также минимизирует токсичность (2). Эта терапия рекомендуется в качестве начального лечения ВН (волчаночный нефрит) и обеспечивает лучшую эффективность и более полную ремиссию по сравнению с внутривенным циклофосфамидом (IVCY) и стероидами (3-5).

Для исследования молекулярных и клеточных механизмов комбинированной терапии был использован комплексный транскриптомный анализ на мышиной модели ВН. (волчаночный нефрит). Мышам MRL/LPR давали только ММФ, такролимус или преднизолон в виде монотерапии или комбинации из трех препаратов. Профили экспрессии генов в почках мышей с ВН (волчаночный нефрит)выявили потенциальные механизмы, которые могут объяснить аддитивные и синергетические эффекты комбинированной терапии по сравнению с монотерапией. Одним из 45 подавленных генов, которые однозначно модулируются комбинированной терапией, является каспаза-1 (6). Он активируется инфламмасомами, которые представляют собой мультипротеиновые олигомеры, состоящие из NLRP3, прокаспазы -1 и спек-подобного белка, ассоциированного с апоптозом (ASC), со встроенным аффинным доменом каспазы. Инфламмасома NLRP3/ASC/caspase-1 была признана ключевым участником патогенеза ВН. (волчаночный нефрит). Инфламмасома NLRP3 управляет аутовоспалительными расстройствами путем активации каспазы-1, инициируя генерацию провоспалительных цитокинов, например IL-1, который, как известно, вызывает дисфункцию подоцитов в ВН(7-9).

Активная каспаза-1 расщепляет гасдермин D(GSDMD) в пределах связи его N- и С-концевых доменов. Затем N-концевой домен способствует образованию пор в клеточной мембране, стимулирует клетки.пироптози производство цитокинов IL-1 и IL-18(10). Новые исследования показали, что GSDMD-опосредованнаяпироптозучаствует в развитии заболеваний, включая аутоиммунный энцефаломиелит (11), рассеянный склероз (12), алкогольный гепатит (13) и воспалительное заболевание кишечника (14). Кроме того, генетическое или фармакологическое ингибирование каспазы -1/GSDMD имеет было продемонстрировано, что он защищает почки от повреждения в мышиных моделях диабетической болезни почек (15, 16), а также после острого повреждения почек (17-19). Однако,пироптозв ЛН (волчаночный нефрит)до сих пор плохо определен(20). Мы предположили, что комбинированная терапия оказывает положительное влияние на ВН. (волчаночный нефрит)) путем ингибированияпироптозиндуцированный каспазой -1/GSDMD.

В настоящем исследовании изучали активацию каспазы-1 и GSDMD в тканях почек, а также влияние комбинированной терапии на каспазу-1/GSDMD-зависимуюпироптозингибирование у мышей MRL/LPR и пациентов с ВН (волчаночный нефрит). Возможные корреляциипироптозтакже оценивали индекс активности заболевания СКВ (SLEDAI) и ответ на лечение.

Лечениепироптоз

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемая популяция

Группа исследования состояла из пациентов, у которых по данным биопсии был диагностирован ВН (волчанканефрит) Меньше или равно 6 месяцам до зачисления. Возраст пациентов составлял 18-65 лет, и все они соответствовали критериям классификации СКВ Американского колледжа ревматологов (21, 22) и Международного общества нефрологов/почечных патологов (2003). Пациенты были набраны из Медицинской школы Чжэцзянского университета и Медицинской школы Университета Нанкина, у которых была протеинурия (более или равная 1,5 г/день) и концентрация креатинина в сыворотке менее или равная 265,2 мкмоль/л. Критерии исключения включали: пациент ранее лечился высокими дозами метилпреднизолона; биологические препараты (воздействующие на конкретные патогенные молекулы) или комбинированная терапия; текущий плазмаферез или лечение внутривенным глобулином в течение 12 недель после скрининга; аномальные функции печени; текущие активные инфекции; и злокачественная опухоль в течение 4 недель после начала исследования. ЛН (волчанканефрит) пациенты получали пульс-терапию метилпреднизолоном в течение 3 дней в дозе 0,5 г/сут. После завершения пульс-терапии метилпреднизолоном группа комбинированного лечения преднизолоном ({3}},6 мг/кг/сут), ММФ (0,5 г, две дозы/сут) и такролимусом (2 мг, две дозы/день) вводили в общей сложности в течение 4 недель. Затем дозы преднизолона, которые по-прежнему сочетались с ММФ ({9}},5 г, две дозы/сутки) и такролимусом (2 мг, две дозы/сутки), снижали на 5 мг/сутки каждые 2 недели до была достигнута поддерживающая доза 10 мг/сутки(4). Полную ремиссию (CR) принимали за 24-ч концентрации белка в моче менее или равной 0,4 г, отсутствии активного осадка в моче, концентрации сывороточного альбумина более или равной 35 г/л и нормальном уровне креатинина. (23). За частичную ремиссию (ЧР) принимали более или равное 50-процентному снижению концентрации белка в моче 24-ч до менее или равной 3,5 г, концентрации сывороточного альбумина более или равной 30 г/ч. L, и нормальное или меньшее или равное 25-процентному увеличению концентрации креатинина в сыворотке по сравнению с исходным уровнем. Наш институциональный наблюдательный совет одобрил исследование (№ IIT20200410A), и все пациенты предоставили письменное согласие перед включением в исследование.

Модели животных

Самки мышей MRL/emoji-FasPr(MRL/LPR) были предоставлены SLAC Laboratory Animal Co.Ltd (Шанхай, Китай), все мыши были случайным образом разделены с помощью генератора случайных чисел, по 5 мышей в каждой группе и в каждой клетке. . В возрасте 8 недель их лечили перорально комбинацией 0,5 мг/кг такролимуса (MCE HY-13756), 50 мг/кг MMF (MCE HY-B0199) и 1 мг/кг. кг преднизона (MCE HY-B0214) или носителя ежедневно в течение 8 недель, как описано ранее (6). Ac-FLTD-CMK синтезировали с помощью MCE и ежедневно инъецировали 10 мг/кг внутрибрюшинно. Все виды лечения были закрыты для участников, ответственных за последующее обнаружение. Отношение альбумина к креатинину в моче (UACR) определяли с использованием Albuwell M и Creatinine Companion (Excell, Фил, США). Образцы почек фиксировали в 4-процентном параформальдегиде перед гистологическим и иммуногистохимическим окрашиванием и извлекали корковое вещество почек для иммуноблоттинг-анализа. Использование мышей было одобрено нашим Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (№ 2019-883).

Выделение клубочков мышей и культура подоцитов

Клубочки были очищены из почек 12-самок мышей C57 и MRL/LPR недельного возраста, как описано ранее (24). Мышей под наркозом перфузировали предварительно нагретыми до 37°C магнитными шариками. Почки удаляли и измельчали ​​на льду до 1 мм³. Затем почечные ткани расщепляли при 37°С с помощью 1 мг/мл коллагеназы и 100 ЕД/мл ДНКазы I в течение 30 минут, затем дважды фильтровали с помощью фильтров для клеток Falcon 100- мкм (431752, BD). После нескольких промывок 4-градусным раствором HBSS (H1025, Solarbio) и осторожного центрифугирования при 200 g в течение 5 минут клубочки, содержащие шарики, собирали с помощью магнитной подставки (HY-K0200, MCE) и трижды промывали раствором HBSS. Изолированные клубочки культивировали на чашках для культивирования, покрытых коллагеном I типа (C3867, Sigma-Aldrich), в 5% CO при 37°С в соответствии с методом, описанным Jeffrey (25). Подоциты пассажа 2 использовали в эксперименте in vitro.ПироптозИндукция, цитотоксичность и обнаружение секреции ИЛ-1

Подоциты мышей MRL/LPR праймировали 1 мг/мл LPS (tell-pb5lps, InvivoGen), растворенными в Opti-MEM в течение 4 часов, а затем стимулировали 5 мМ АТФ (tlrlatpl, ген In Vivo). Подоциты мышей C57 разрезали в качестве нормального контроля. Монотерапия такролимусом (10 мкМ), ММФ (лкМ) и преднизоном (10 мкМ) или комбинированная терапия предварительно инкубировались с клетками в течение 1 ч перед примированием ЛПС. Цитотоксичность после стимуляции определяли с использованием набора для определения цитотоксичности (11644793001, Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Супернатант после стимуляции собирали и измеряли с использованием набора IL-1 ELISA для мышей (BMS6002, Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

Антитела и реагенты

Уровни каспазы-1(sc-398715, Santa Cruz Biotech), GSDMDC1 (sc-81868, Santa Cruz Biotech) оценивали в соответствии с инструкциями производителя.Пироптозв периферической крови измеряли с помощью FAM FLICAMCaspase-1 Kit (Bio-Rad, США) методом проточной цитометрии.

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием GraphPad Prism (версия 8.0), и данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнение двух групп проводили с использованием t-критерия Стьюдента и корреляционного анализа с использованием корреляции Пирсона. Двухвостый п<0.05 was="" considered="" statistically="">

Лечениепироптоз вволчаночный нефрит (ЛН)

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

GSDMD-опосредованныйПироптозАктивируется в почках, пораженных ЛН (волчанканефрит)

Чтобы выяснить, способствовал ли GSDMD патогенезу ВН (волчанканефрит), мы сначала проверили уровень экспрессии белка GSDMD в образцах почек, взятых из LN (волчанканефрит) пациентов. Иммуногистохимический анализ выявил значительно повышенный уровень экспрессии GSDMD в образцах биопсии почек, взятых из лимфатического узла (волчанканефрит) у пациентов с типом IV, V, I плюс V и IV плюс V и по сравнению со здоровыми субъектами. GSDMD повсеместно экспрессировался в гломерулярных подоцитах, канальцевых клетках и инфильтрированных интерстициальных клетках в ЛУ.волчанканефрит) пациентов. Участки с положительным (красные стрелки) и отрицательным окрашиванием (черные стрелки) были увеличены (рис. 1А). Затем был оценен процент GSDMD-положительной области в почке (рис. 1B). Аналогичные результаты были обнаружены в почках мышей MRL/LPR и контрольных животных дикого типа. Иммуноблоттинг-анализ подтвердил значительное увеличение экспрессии и расщепления GSDMD в образцах почек мышей MRL/LPR (рис. 1C). GSDMD в гломерулярных подоцитах, тубулярных клетках и инфильтрированных интерстициальных клетках был повышен у мышей MRL/LPR по сравнению с контрольными мышами (рис. 1D). Эти данные свидетельствуют о том, что GSDMD-опосредованная активность активируется в почечной ткани, пораженной ВН.волчанканефрит).

РИСУНОК 1|GSDMD сильно повышен и расщеплен в почках пациентов и мышей, пораженных ВН (волчаночный нефрит).

(A) Иммунохимическое окрашивание GSDMD в образцах почек, взятых у здоровых людей и LN (волчанканефрит) пациентов, положительное (красные стрелки) и отрицательное окрашивание (черные стрелки) были увеличены.

(B) Количественная оценка GSDMD-положительных областей показана для типа III плюс V, IV, IV плюс V, V LN (волчанканефрит) пациентов и здоровых лиц.

(C) Иммуноблот-анализ полноразмерного расщепленного N-концевого домена и C-концевого домена GSDMD в корковом веществе почек трех пар контрольных мышей и мышей MRL/LPR.

(D) Иммунохимическое окрашивание GSDMD в образцах почек, взятых у контрольной группы и мышей MRL/LPR.

*р < {{0}}.05,="" **р=""><0,01. лн="">волчанканефрит), волчанканефрит; ФЛ, полнометражный; NT, N-концевой домен; СТ, С-концевой домен.

Комбинированное лечение подавляет GSDMD-опосредованноеПироптозАктивация в первичных подоцитах In Vitro

Изучить ингибирующее действие комбинированной терапии напироптоз, мы применили метод стимуляции ЛПС плюс АТФ, чтобы вызватьпироптозв подоцитах мышей MRL/LPR, взяв подоциты мышей C57 дикого типа в качестве нормального контроля. Подоциты мышей MRLlpr праймировали в течение 4 часов LPS, а затем обрабатывали в течение 4 часов АТФ, обычно используемым стимулом для GSDMD-опосредованногопироптозактивация(26). По сравнению с нормальным контролем подоциты впоследствии проявляли пироптотические морфологические признаки, такие как набухание клеток и образование пузырьков. Предварительное лечение комбинированной терапией значительно улучшило морфологические признаки пироптоза и цитотоксичность (рис. 2А). ЛПС плюс АТФ индуцировали цитотоксичность подоцитов. Для сравнения, комбинированная терапия значительно снижала цитотоксичность и секрецию IL-1 в супернатанте, индуцированную LPS плюс стимуляция АТФ (рис. 2B, C). Для дальнейшей проверки активации GSDMD-опосредованнойпироптоз, мы проанализировали канонические инфламмасомы и активацию GSDMD с помощью иммуноблоттинга. В соответствии с пироптотическими морфологическими изменениями и цитотоксичностью, LPS плюс АТФ значительно активировали NLRP3, каспазу -1 и расщепляли GSDMD в подоцитах (рис. 2D). Комбинированное лечение заметно подавляло активацию NLRP3 и каспазы -1 и снижало уровень N-конца GSDMD. Примечательно, что монотерапия такролимусом, ММФ или преднизоном подавляла ЛПС плюс АТФ, стимулировала клеточную цитотоксичность и секрецию L-1, но комбинированная терапия показала более значительный ингибирующий эффект на каспазу-1 и GSDMD. Эти результаты предоставили доказательства, подтверждающие точку зрения о том, что комбинированное лечение улучшает состояние, обусловленное GSDMD.пироптозпутем подавления активации NLRP3 и каспазы-1.

РИСУНОК 2|Комбинированное лечение уменьшает пироптоз подоцитов in vitro.

(A) Пироптотические признаки проявлялись в культивируемых первичных подоцитах после инкубации с LPS плюс АТФ и предварительной обработки комбинированным лечением. Стрелки указывают на клетки, проявляющие пироптозоподобные признаки.

(B) Супернатанты зараженных клеток анализировали на гибель клеток, измеряемую секрецией ЛДГ.

(C) Супернатанты зараженных клеток анализировали на высвобождение IL-1b.

(D) Иммуноблоттинг-анализ экспрессии NLRP3, каспазы -1, GSDMD-NT и ASC после такролимуса, ММФ, преднизолона или комбинированного лечения после активации воспалительной реакции NLRP3.

*p < {{0}}.05;="" **р="">< 0.01;="" ***р="">< 0,001;="" ****р="">< 0,0001.="" лдг,="">

DSMO, диметилсульфоксид, FK506, такролимус; ММФ, микофенолата мофетил; ПНС, преднизолон; СОМ, комбинированная терапия; ASC, пятнистый белок, ассоциированный с апоптозом.

Комбинированное лечение Подавление каспазы-1/GSDMD-индуцированныйПироптозу мышей MRL/LPR

Восьминедельным мышам MRL/LPR давали комбинацию ММФ, такролимуса и преднизона или контрольного носителя. В соответствии с предыдущим исследованием (6), после лечения в течение 8 недель не было обнаружено различий в смертности или массе тела между группами, получавшими носитель, и группами комбинированного лечения. В отличие от группы, получавшей носитель, комбинированная терапия была очень эффективной в предотвращении протеинурии, гломерулосклероза и инфильтрации почечных интерстициальных иммунных клеток (дополнительная фигура 1).

Затем мы исследовали уровни экспрессии каспазы -1 и GSDMD в группах комбинированной терапии и контрольных группах с носителем. Иммуногистохимический анализ показал, что экспрессия гломерулярной и почечной интерстициальной каспазы -1 и GSDMD была заметно снижена в группе комбинированной терапии (рис. 3А). Иммуноблоттинг-анализ также обнаружил снижение экспрессии и расщепления каспазы -1 и GSDMD в коре почек в группе комбинированного лечения (рис. 3В). Кроме того, с помощью проточной цитометрии ипироптозКомплект FAM Caspase-1. Результаты показали заметное снижение количества клеток каспазы-1*/PI' в периферической крови у мышей MRL/LPR, получавших комбинированное лечение, по сравнению с мышами MRL/LPR, получавшими носитель (рис. 3C, D). Кроме того, комбинированное лечение также значительно снижало концентрацию Ii в сыворотке (рис. 3Е). Таким образом, мы пришли к выводу, что комбинированное лечение подавляло индуцированный каспазой -1/GSDMDпироптозв почках и клетках крови ЛН (волчанканефрит) мышей.

РИСУНОК 3|Комбинированное лечение ослабляло опосредованный каспазой -1/GSDMD пироптоз у мышей MRL/LPR.

(A) Иммунохимическое окрашивание GSDMD и каспазы -1 в образцах почек мышей MRL/LPR. По сравнению с контрольным носителем экспрессия каспазы -1 и GSDMD была заметно подавлена ​​в группе комбинированного лечения.

(B) Иммуноблот-анализ полноразмерного и расщепленного GSDMD и каспазы -1 в образцах коры почек мышей MRL/LPR; сравнение результатов групп, получавших носитель и комбинированное лечение.

(C) FACS клеток с двойной положительной реакцией на каспазу -1/PI в периферической крови мышей MRL/LPR, получавших или не получавших комбинированное лечение.

(D) Количественное определение клеток с двойной положительной реакцией на каспазу -1/PI в периферической крови мышей MRL/LPR, получавших или не получавших комбинированную терапию.

(E) Количественная оценка концентрации IL{{0}}b в сыворотке у мышей MRL/LPR, получавших или не получавших комбинированное лечение. ####P < 0,0001.="" facs,="" сортировка="" клеток,="" активируемая="" флуоресценцией;="" кт,="" комбинированная="">

Комбинированная терапия Подавляющая каспаза-1/GSDMD-индуцируемаяПироптозв ЛН (волчанканефрит) Пациенты

В период с января 2020 г. по июнь 2020 г. 47 пациентов с ВН (волчанканефрит) были зарегистрированы и прошли 43 24-недель комбинированной терапии. Исходное заболевание и демографические характеристики зарегистрированной когорты перечислены в дополнительной таблице 1. Количественное определение каспазы -1/пропидия йодида (двойные положительные клетки PI) проводилось у пациентов с ВН (волчанканефрит) тип III, IV, V, III плюс V, IV плюс V и у здоровых контролей с использованиемпироптозНабор FAM Caspase-1 и проточная цитометрия. По сравнению со здоровым контролем количество клеток, дважды положительных по каспазе -1/PI, в периферической крови было увеличено (рис. 4А, В). Мы также исследовали клетки, дважды положительные по каспазе-1/PI, после 24-недель терапии и в начале исследования. После 24-недель индукционной терапии частота CR и PR составила 39,5% (17/43) и 32,6% (14/43) соответственно. Количество клеток с двойной положительной реакцией на каспазу -1/PI в периферической крови пациентов с CR и PR было заметно снижено по сравнению с исходным уровнем (рис. 4C). Мы также определили корреляцию между индуцированным каспазой-1пироптози СЛЕДА; данные ясно показали, что положительное соотношение каспаз -1/PI в периферической крови положительно коррелировало с SLEDAI (рис. 4D). Ac-FLTD-CMK, производный от GSDMD ингибитор, предотвращает развитие LN (волчанканефрит).

РИСУНОК 4|Комбинированная терапия ослабляла опосредованный каспазой-1-пироптоз у пациентов с ВН (волчаночный нефрит).

(A) FACS двойных положительных клеток каспазы -1/PI в периферической крови ЛУ (волчанканефрит) пациентов, получавших комбинированную терапию или не получавших ее.

(B) Количественное определение клеток с двойной положительной реакцией на каспазу -1/PI в периферической крови типов III, IV, V, III плюс V и IV плюс V LN (волчанканефрит) пациентов и здоровых лиц.

(C) Количественное определение каспаз -1/PI дважды положительных клеток в периферической крови ЛУ (волчанканефрит) пациенты на исходном уровне, CR, PR и отсутствие ремиссии после комбинированной терапии.

(D) Корреляционный анализ соотношения клеток, дважды положительных каспазу -1/PI, с SLE-DAI.

**р < 0.01.="" facs,="" сортировка="" клеток,="" активируемая="" флуоресценцией;="" лн="">волчанканефрит), волчанканефрит; CR, полная ремиссия; PR, частичная ремиссия; SLE-DAI, индекс активности системной красной волчанки.

Недавнее исследование показало, что у мышей GSDMDh развилось повышенное отложение C3 и IgG в почках, более тяжелое повреждение почек и повышенная смертность в модели СКВ, индуцированной имиквимодом.волчанканефрит), мышам MRL/LPR вводили Ac-FLTD-CMK21, начиная с 8-недельного возраста, с носителем в качестве контроля. После 8-недель лечения не было обнаружено различий в смертности или массе тела между группой, получавшей носитель, и группой, получавшей Ac-FLTD-CMK. По сравнению с контрольными мышами, получавшими носитель, мыши MRL/LPR, получавшие Ac-FLTD-CMK, имели более низкое соотношение альбумина и креатинина в моче (рис. 5A), более низкую концентрацию креатинина в сыворотке (рис. 5B), сниженный гломерулосклероз (рис. 5C) и CD3. , CD4 и CD68-положительная клеточная инфильтрация (рис. 5D). Результаты иммуногистохимии показали снижение экспрессии GSDMD (рис. 5D) и подавление секреции сывороточного IL-1, определенное с помощью ELISA (рис. 5E). В совокупности данные свидетельствуют о том, что Ac-FLTD-CMK ингибируетпироптозв почках, пораженных ВН (волчанканефрит).

РИСУНОК 5|Ac-FLTD-CMK, производный от GSDMD ингибитор, предотвращал развитие ВН (волчаночного нефрита).

(A) Отношение альбумина к креатинину в моче рассчитывали у мышей MRL/LPR, получавших или не получавших ингибитор GSDMD.

(B) Креатинин сыворотки у мышей MRL/LPR, получавших или не получавших ингибитор GSDMD.

(C) Репрезентативные изображения образцов почек, окрашенных периодической кислотой-Шиффом (PAS), и количественный процент гломерулосклероза.

(D) Иммунохимическое окрашивание CD3, CD4, F4/80 и GSDMD. (E) Количественное определение концентрации IL-1b в сыворотке у мышей MRL/LPR, получавших или не получавших ингибитор GSDMD.

Данные представлены как среднее ± SEM. #p < {{0}}.05,="" ##p=""><>

ОБСУЖДЕНИЕ

Комбинированная терапия является многообещающей стратегией из-за более высокой частоты полного ответа и общего ответа, более короткого времени до ремиссии и меньшего количества побочных эффектов. До сих пор не были известны лежащие в основе комбинированной терапии молекулярные механизмы. Недавно Fu et al. (6) лечили мышей MRL/LPR монотерапией или комбинированной терапией и провели комплексный транскриптомный анализ целых почек. Интересно, что они обнаружили, что комбинированная терапия, но не монотерапия, специфически и однозначно подавляет экспрессию каспазы-1.

Инфламмасома NLRP3/ASC/caspase-1 в настоящее время признана ключевым участником патогенеза ВН (волчанканефрит). Инфламмасомы NLRP3 в подоцитах активируются у мышей, склонных к волчанке, а также у пациентов с ВН.волчанканефрит). Когда инфламмасомы NLRP3 были подавлены ингибитором каспазы -1, было обнаружено, что протеинурия, гистологические поражения почек и сглаживание ножки подоцита уменьшались у мышей, склонных к волчанке (8). Хуанг и др. (27) сообщили, что NLRP3 экспрессируется в канальцевых клетках ЛУ (волчанканефрит) класс IV и что активация NLRP3 положительно коррелировала с показателем индекса активности у пациентов с ВН. Было доказано, что каспаза -1 играет жизненно важную роль при волчанке и сосудистой дисфункции и, таким образом, является потенциальной мишенью для новых терапевтических вмешательств (28). Новые экспериментальные препараты, такие как RIP3 (29), антагонисты рецептора P2X7 (30), ингибиторы GSK-3 (31) и агонист Nrf2 (32), ингибировали развитие ВН.волчанканефрит) у мышей MRL/LPR путем модулирования активности инфламмасомы NLRP3/ASC/каспазы-1, что подчеркивает важность и критичность инфламмасомы NLRP3/ASC/каспазы-1 в ВН. Повышенные концентрации интерлейкина -18 в сыворотке крови коррелируют с тяжестью заболевания и степенью поражения/вовлечения почек у пациентов с СКВ (33). Насколько нам известно, кажется, что семейство gasdermin может иметь важное значение для развитияпироптоз, но было недостаточно доказательств наличия GSDMD / GSDME у пациентов с СКВ.

В целом, мы исследовали активацию и экспрессию GSDMD в образцах биопсии почек, взятых из лимфатического узла (волчанканефрит) пациентов и мышей MRL/LPR. GSDMD сильно индуцируется и расщепляется в гломерулярных подоцитах и ​​тубулярных клетках, а также в инфильтрированных интерстициальных клетках. Затем мышам MRL/LPR давали комбинацию ММФ, такролимуса и преднизона или носителя. По сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, активация каспазы-1 и GSDMD была снижена в группе комбинированного лечения. Степеньпироптозв периферической крови также был значительно ниже в ВН (волчанканефрит) пациентов после назначения комбинированной терапии. Более того,пироптозв периферической крови положительно коррелировал с SLEDAI, что свидетельствует о том, чтопироптозв периферической крови может служить важным маркером активности СКВ. Таким образом, мы предположили, что комбинированная терапия может оказывать благотворное влияние на ВН.волчанканефрит) путем ингибированияпироптозиндуцированный каспазой -1/GSDMD. Предыдущие исследования кристаллической структуры каспазы-1 в комплексе с Ac-FLTD-CMK выявили множество взаимодействий фермент-ингибитор, которые предотвращали распознавание GSDMD каспазой-1. Однако мы обнаружили, что Ac-FLTD-CMK, который действует как производный от GSDMD ингибитор, ингибируетпироптозв ЛН (волчанканефрит), которые могут быть вызваны другим механизмом.

Недавно в мышиной модели СКВ, индуцированной TLR7-(34), у мышей GSDMD-/- развилась более высокая степень повреждения почек и повышенная смертность, что первоначально предполагало, что делеция GSDMD будет иметь защитный эффект и быть связана с системное воспаление и продукция аутоантител с ассоциированным увеличением смертности. У мышей с дефицитом GSDMD наблюдается более заметное отложение гломерулярного иммунного комплекса в образцах почек и более высокая протеинурия по сравнению с мышами дикого типа. Повышенная секреция внеклеточного HMGB1 также была обнаружена в GSDMD-/лимфоцитах, что позволяет предположить, что некроз/пироптозпроизошло, когда GSDMD отсутствовал.

Триггеры каспазы-1пироптозрасщеплением GSDMD. Напротив, в клетках с дефицитом GSDMD или низким уровнем GSDMD каспаза -1 запускает апоптоз, а затем GSDME-зависимый вторичный некроз ипироптоз. Когда активность GSDMD отсутствует после терапии, GSDME, возможно, также может переключать опосредованный каспазой-3-апоптоз напироптоз(35,36). Кроме того, активация каспазы -8 была значительно усилена в макрофагах с дефицитом GSDMD. Значительная активация каспазы-8 была также обнаружена в TLR7-индуцированном GSDMD-дефицитном ЛУ (волчанканефрит) мыши (34). Таким образом, в отсутствие GSDMD вполне вероятно, что каспаза-1 взаимодействует с каспазой-8, вызывая переключение апоптоза, опосредованного каспазой-3-GSDME, напироптозв ЛН (волчанканефрит), гипотеза, которая требует дальнейшего экспериментального исследования.

В текущем исследовании есть несколько ограничений. Во-первых, на основе текущих данных мы подтвердили, что комбинированная терапия может подавлятьпироптоз, но другие методы лечения, такие как двойная терапия стероидами и ММФ, стероидами и такролимусом или анти-CD20-антителами, также могут иметь сопоставимые эффекты. Во-вторых, точный молекулярный механизм ингибирующего действия комбинированной терапии на каспазу -1 изучен недостаточно. И последнее, но не менее важное: мы наблюдаем взаимосвязь двойных положительных клеток каспазы -1/PI в периферической крови с SLE-DAI и изменение до и после лечения комбинированной терапией в ретроспективном ВН (волчанканефрит) когорта пациентов. Клиническая прогностическая ценность клеток с двойной положительной реакцией на каспазу -1/PI для активности заболевания и ответа на лечение требует дальнейшего изучения в более крупной проспективной когорте.

В целом, мы определили, что комбинированная терапия дает положительный эффект за счет подавления индуцированных каспазой -1/GSDMDпироптозв ЛН (волчанканефрит), что дало новое понимание задействованных клеточных механизмов. Действительно, комбинированная терапия специфически и уникальным образом подавляла экспрессию каспазы-1. Фармакологическое или генетическое ингибирование NLRP3 и каспазы -1 улучшало функцию почек и подавляло аутоиммунитет при ВН (волчанканефрит). Патофизиологическая роль каспазы-1 в ВН (волчанканефрит) заслуживает дальнейшего изучения, а терапия, нацеленная на GSDMD у пациентов с ВН (волчанканефрит) нужно очень тщательно оценивать.

Метод лечения дляпироптоз

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Саксена Р., Махаджан Т., Мохан С.волчанкаНефрит: Current Update.Arthritis Res Ther (2011)13:240.doi: 10.1186/ar3378

2. An Y, Zhang H, Liu Z. Индивидуализирующая терапия вволчанкаНефрит. Kidney Int Rep (2019)4:1366-72.doi: 10.1016/j.ekir.2019.08.005

3. Bao H, Liu ZH, Xie HL, Hu WX, Zhang HT, LiLS. Успешное лечение класса V плюс IVволчанкаНефритС многоцелевой терапией. J Am Soc Nephrol (2008) 19:2001-10.doi: 10.1681/ASN.2007121272

4. Liu Z, Zhang H, Liu Z, Xing C, Fu P, Ni Z и др. Многоцелевая терапия для индукционного леченияволчанкаНефрит: Рандомизированное исследование, Ann Intern Med (2015) 162: 18-26. DOI: 10.7326/M14-1030

5. Zhang H, Liu Z, Zhou M, Liu Z, Chen J, Xing C и др. Многоцелевая терапия для поддерживающего леченияволчанкаНефрит. J Am Soc Nephrol (2017) 28:3671-8.doi:10.1681/ASN.2017030263

6. Fu J, Wang Z, Lee K, Wei C, Liu Z, Zhang M и др. Транскриптомный анализ раскрывает новые синергетические механизмы в комбинированной терапии дляволчанкаНефрит. Kidney Int (2018) 93:416-29.doi: 10.1016/j.kint.2017.08.031

7. Уммарино Д.волчанкаНефрит: Воспаление NLRP3 вызывает дисфункцию подоцитов. Nat Rev Rheumatol (2017) 13: 451. doi: 10.1038 / Orpheum. 2017.9