Пациенты, перенесшие сосудистую хирургию, с повышенным соотношением нейтрофилов к лимфоцитам имеют пониженную экспрессию РНК нейтрофильного комплемента.

Повышенное соотношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) у пациентов, перенесших плановую сосудистую операцию (EVS), приводит к увеличению смертности независимо от периоперационных хирургических результатов. Чтобы понять, почему высокий NLR связан с более высокой смертностью, мы исследовали экспрессию транскриптома нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов, перенесших ЭВС. Образцы крови были собраны у пациентов, перенесших ЭВС, и здоровых доноров для расчета NLR. Образцы РНК были выделены из нейтрофилов и лимфоцитов пациентов и разделены на NLR_Low (<3) and NLR_High (≥3) groups (n = 6 each). Paired samples with the highest RNA integrity number (mean = 9.8 ± 0.4) were sequenced and analyzed for differential expression. Normalized data were inputted for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). There was no clinical difference between the patient groups about clinical diagnosis, age, sex, history of hypertension, lipid abnormalities, diabetes mellitus, smoking, or statin use. The mean NLR was 4.37 ± 0.27 SEM in the NLR_High and 1.88 ± 0.16 for the NLR_Low groups. Significantly differentially expressed gene sets identified in the RNA sequence data were enriched highly (P = 1E-24) in the humoral immunity and complement systems. Neutrophils from NLR_High patients downregulated complement genes (C1QA, C1QB, C1QC, C1S, C2, CR2, C3AR1, C3, C8G, and C9 and complement regulatory genes CD59, SERPING1, C4BPA, CFH, and CFI). Downregulation of gene expressions of humoral immunity and complement within the neutrophils are associated with elevated NLR. It remains to be determined whether and how these changes contribute to increased late mortality previously observed in patients undergoing EVS.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются ведущей причиной смертности во всем мире. Во многом это связано с атерогенезом и атеросклерозом, которые, помимо индивидуальной генетики и диеты, опосредованы воспалительными и иммунными механизмами.1-3 В последнее время в центре внимания стало дифференциальное количество лейкоцитов (нейтрофилов и лимфоцитов). для прогнозирования сердечно-сосудистых (СС) исходов. Отношение абсолютного количества нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) было признано предиктором общей смертности в многочисленных небольших исследованиях острых коронарных вмешательств, 4-6 гипертонии7,8 и сердечной недостаточности.9

Таблица 1. Клинические характеристики пациентов, подвергшихся плановой сосудистой хирургии, обследованных методом RNA-seq

Предыдущие исследования также показали, что NLR является предиктором долгосрочных результатов у пациентов с заболеваниями периферических сосудов.10-13 Наши ретроспективные исследования популяций пациентов, перенесших сосудистую хирургию, подтверждают этот вывод. В одном исследовании с участием 108 пациентов с плановой эндоваскулярной пластикой аневризмы брюшной аорты не было различий в 30-дневной послеоперационной смертности между NLR<4 and an NLR of >4 (P = .507). However, the 1-year, 3-year, and 5-year mortality between the groups were 4.2% vs 28.1%, 15.1% vs 64.9%, and 24% vs 90%, respectively.14 In a second study of 290 asymptomatic patients undergoing prophylactic carotid endarterectomy, the risk for stroke was noted to be significantly higher (P < .0001) in patients with an NLR of >3 (n=116 пациентов, риск инсульта 42,6%), чем у пациентов с NLR<3 (n = 174 patients, 9.3% stroke risk).15 In a third study with 488 patients who underwent percutaneous interventions of femoropopliteal arteries, the 30-day mortality rates increased significantly (P = .005) with increasing NLR (1.4%, 4.3%, and 7.0% for low [<3], mid [3-4], and high [>4] группы NLR соответственно).16 Пациенты с более низким предоперационным NLR достигли значительно большей выживаемости без ампутаций в течение 4- года наблюдения (низкий NLR 65,5%, средний NLR 37,5% и высокий NLR 17,6). % [P < 0,0001]).16

В этом исследовании мы провели секвенирование РНК (RNA-seq) нейтрофилов и лимфоцитов пациентов, которым была необходима плановая сосудистая хирургия (EVS), чтобы определить потенциальные механизмы повышенного NLR. В ходе исследований изучалось, существует ли молекулярная основа повышенного NLR. Наши исследования показывают, что пациенты с повышенным NLR, перенесшим репарацию EVS, отличаются весьма значительным снижением активности генов иммуноглобулина и комплемента в нейтрофилах.

Преимущества цистанхе – укрепляют иммунную систему

Методы

Пациенты

Blood samples were collected from candidate patients for EVS procedures and healthy volunteers for NLR calculation and RNA sequence studies of neutrophils and lymphocytes. In screening patients for participation, any individual with an active local or systemic infection or obvious inflammatory disease was excluded from participation. Peripheral blood collection was approved by the institutional review board of University Hospitals Cleveland Medical Center (#01-06-02). Informed consent was obtained from each patient and healthy volunteer. All patients for EVS seen in the outpatient department were eligible. Patients in the study were characterized for the type of vascular surgery, age, sex, hypertension (blood pressure >130/80 mm Hg), diabetes mellitus (fasting blood glucose >100 мг/дл), курение, лечение статинами, наличие в анамнезе хронической обструктивной болезни легких, рака, хронической болезни почек, ишемической болезни сердца (ИБС), заболеваний периферических артерий, цереброваскулярных заболеваний и хронической сердечной недостаточности. Всем пациентам проводился общий анализ крови с дифференциальным подсчетом лейкоцитов. Пациенты были разделены на группы с низким NLR (NLR_Low [<3]) and high NLR (NLR_High [≥3]) groups (n = 6 each) and healthy volunteers aged 18 to 71 years (n = 6). Eleven of 12 patients' blood was drawn before surgery. One patient had blood drawn 4 months after surgery. 

Разделение крови

Цельную кровь (20 мл на пациента) собирали в пробирки-вакутайнеры емкостью 10 мл, антикоагулированные ЭДТА, и кровь отделяли в течение часа после сбора. Популяции нейтрофилов и лимфоцитов выделяли из 8 мл крови с использованием наборов для прямого выделения клеток человека EasySep (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада) и магнита Big Easy EasySep (STEMCELL Technologies, Ванкувер, Канада) в соответствии с протоколами производителя. Магнит предварительно охлаждали на льду, а клетки крови и реагенты осторожно перемешивали, переворачивая пробирку, а не пипетируя. Соотношения реагентов также корректировали следующим образом для оптимизации извлечения: перед первым разделением в кровь добавляли 400 мл смеси антител, 400 мл магнитных шариков и 4 мл фосфатно-солевого буфера, а затем 200 мл антитела. смеси и 400 мл гранул перед вторым разделением и 200 мл гранул перед третьим и окончательным разделением. Небольшую аликвоту объемом 200 мл отбирали из конечных объемов восстановления для подсчета клеток и подготовки предметных стекол. Оставшуюся часть восстановленного объема центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 7 минут для осаждения клеток.

Рисунок 1. Полный транскриптом РНК из нейтрофилов и лимфоцитов, собранный у пациентов с NLR, высоким (NLR_Высоким), низким (NLR_Низким) или контролем (NLR_Контроль). . Буквенный код «N» или «L» в названии образца означает, что источником РНК были нейтрофилы или лимфоциты. В каждой категории было по 6 пациентов. Синий=снижает уровень экспрессии; красный=высокий уровень экспрессии.

Подсчет клеток и подготовка слайдов

Клетки, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере, далее разделяли на аликвоты, смешивали с трипановым синим и вручную подсчитывали с помощью гемоцитометра. Обычно на образец выделяли от 9×106 до 15×106 нейтрофилов и от 3×106 до 10×106 лимфоцитов. Слайды выделенных клеток готовили с использованием цитоцентрифуги, вращали при 600 оборотах в минуту в течение 3 минут, а затем окрашивали красителем Райта-Гимзы. Чистоту каждой популяции клеток определяли путем ручного подсчета, при котором на предметном стекле выделяли не менее 1000 клеток. Средняя чистота разделения нейтрофилов и лимфоцитов по подсчету клеток составляла 98,3% и 96,2% соответственно. Проточная цитометрия была выполнена на одной паре образцов нейтрофилов и лимфоцитов и показала чистоту 90,6% и 92,2% соответственно. Остальные клетки в препарате нейтрофилов были разбиты на лимфоциты (4%), моноциты (2%), эозинофилы (2,3%) и базофилы (0,3%). В препарате лимфоцитов другими клетками были нейтрофилы (1,2%), моноциты (1,4%), эозинофилы (1,2%) и базофилы (1,8%). Данные массового секвенирования РНК из всех отдельных образцов также использовались для определения степени загрязнения моноцитами в клеточных препаратах путем определения того, значительно ли увеличили CD14 нейтрофилы или лимфоциты из образцов NLR_Высокий или NLR_Низкий уровень. , CD68, CD83 или CD163. Независимо, данные секвенирования РНК были введены в программу оценки доли иммунных и раковых клеток (EPIC), программу, предназначенную для оценки доли иммунных и раковых клеток в общих данных по экспрессии генов.17 Используемый эталонный профиль был предоставлен EPIC для циркулирующие в крови иммунные клетки и содержат профиль В-клеток, Т-клеток CD4 и CD8, моноцитов, нейтрофилов и естественных клеток-киллеров. Сообщаемые выходные данные представлены в виде фракций клеток на образец.

Рисунок 2. Значительно дифференциально экспрессируемые гены нейтрофилов и лимфоцитов. (А) Число значительно дифференциально экспрессируемых генов в нейтрофилах (синий) и лимфоцитах (оранжевый). (B) График анализа главных компонентов значительно дифференциально экспрессируемых генов в нейтрофилах (зеленый и фиолетовый) и лимфоцитах (красный и синий) в NLR_Высоком (кружки) и NLR_Низком (квадратики). (C) Тепловая карта значительно дифференциально экспрессируемых генов из РНК нейтрофилов NLR_Высокая и NLR_Низкая. (D) Тепловая карта существенно дифференциально экспрессируемых генов из РНК NLR_Высокая и NLR_Низкая РНК лимфоцитов.

РНК-секвенирование и статистический анализ

Подробные методы выделения и секвенирования РНК представлены в дополнительных методах. Считывания секвенирования оценивались на качество, а адаптер был обрезан с помощью TrimGalore! (Институт Бабрахама), скрипт-оболочка для FastQC и CutAdapt. Считывания, прошедшие контроль качества, были сопоставлены с эталонным геномом человека GRCh38 с использованием программного обеспечения STAR Aligner. Выровненные прочтения были обработаны с использованием Cufflinks версии 2.2.1 для дифференциального анализа экспрессии с использованием аннотации гена GENCODE для GRCh38, а данные об экспрессии на уровне гена были представлены во фрагментах на транскрипт в тысячах оснований на миллион картированных прочтений.18 Значительно дифференциально экспрессируемые гены были идентифицированы с использованием ложного пороговое значение скорости открытия P значение<.05, after the Benjamini-Hochberg correction for multiple testing. Normalized fold-change and P values for all expressed genes were then used as input for downstream analysis using iPathwayGuide (AdvaitaBio) and gene set enrichment analysis (GSEA) using GenePattern and MSigDB (Broad Institute). Additional figures including heat maps and scatterplots were generated in R and ClustVis.

Полученные результаты

Характеристики пациента

Шесть пар образцов пациентов были выбраны из 7 NLR_Высокая и 9 NLR_Низких на основании наивысшего качества РНК в паре, оцененного по показателю целостности РНК (RIN) (Таблица 1). ). Также были исследованы шесть контрольных групп от 8 здоровых доноров. У пациентов, включенных в исследование, среднее ± стандартное отклонение NLR для NLR_High составляло 4,37 ± 0,66, а для NLR_Low - 1,87 ± 0. 39 (P < .0001). Среднее ± стандартное отклонение возраста пациентов составило 61,0 ± 17,0 лет для NLR_высокого и 64,5 ± 7,5 лет для NLR_низкого (P= 0,68). У всех пациентов, кроме 1, была аневризма аорты, у 9 — грудной/торакоабдоминальной, а у 2 — абдоминальной. Оба пациента с аневризмой брюшной аорты находились в группе NLR_Low. У 11 из 12 пациентов в анамнезе была гипертония. У четырех из 6 пациентов как в группах NLR_Высокий, так и в группах NLR_Низкий уровень липидов в анамнезе были. Четыре пациента из группы NLR_Высокий уровень и 3 пациента из группы NLR_Низкий уровень были бывшими курильщиками. Один пациент из группы NLR_Low был активным курильщиком. Пять пациентов в группе NLR_Высокий уровень и 4 пациента в группе NLR_Низкий уровень принимали статины. Только 3 пациента в обеих группах страдали диабетом. У одного пациента в каждой группе в анамнезе была ИБС, а у 2 пациентов в группе NLR_Low было заболевание периферических артерий.

Рисунок 3. Данные РНК-секвенирования в этом исследовании использовались в качестве независимого средства для определения контаминации других клеток в препаратах нейтрофилов и лимфоцитов. Показаны только данные по нейтрофилам. Был проведен EPIC-анализ для оценки доли иммунных и раковых клеток в общих данных об экспрессии генов. Этот анализ позволил определить процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, В-клеток, Т-клеток CD4, Т-клеток CD8, естественных клеток-киллеров (NK) и других клеток в препарате нейтрофилов.

Полный транскриптом

Мы наблюдали глобальные различия во всем транскриптоме при сравнении профилей экспрессии генов между нейтрофилами и лимфоцитами (рис. 1). Этот результат не был неожиданным, поскольку экспрессия генов, специфичных для типов клеток, ранее охарактеризовалась как различная.19 В разделе нейтрофилов у пациентов с NLR_Высоким, NLR_Низким и NLR{{ 4}} В контрольных группах было много генов с повышенной регуляцией, которые явно не активировались в секции лимфоцитов, и наоборот. На уровне всего транскриптома клеточно-специфические различия между нейтрофилами и лимфоцитами были отчетливыми и доминирующими независимо от NLR или от пациента или от контроля. Однако при ближайшем рассмотрении стали проявляться различия. График анализа главных компонентов показал, что NLR_контроль нейтрофилов или лимфоцитов перекрывается с NLR_высоким и NLR_низким в обеих клетках (дополнительный рисунок 1). Затем исследования были направлены на поиск дополнительных различий между группами NLR_High и NLR_Low в значительно дифференциально экспрессируемых генах. Было замечено, что 900 (74,5%) существенно дифференциально экспрессируемых генов наблюдались в нейтрофилах в группах NLR _Высокий и NLR_Низкий (рис. 2A). Для сравнения, в лимфоцитах было только 190 (15,7%) значительно дифференциально экспрессируемых генов. График анализа главных компонентов NLR_Высокие гены против NLR_Низких генов в нейтрофилах и лимфоцитах показал, что группа генов NLR_Высокого уровня против NLR_Низких генов в нейтрофилы разделились на две отдельные области, тогда как гены NLR_Высокие и NLR_Низкие лимфоциты перекрывались (рис. 2B). Опять же, как и в случае с данными всего транскриптома, NLR_Контроль перекрывался с генами NRL_Высокий и NLR_Низкий, значительно дифференциально экспрессируемыми как в нейтрофилах, так и в лимфоцитах (дополнительный рисунок 2). Большинство значительно дифференциально экспрессируемых генов в NLR_Высоком уровне нейтрофилов были подавлены по сравнению с NLR_Низким (рис. 2C). Аналогичное, но гораздо меньшее количество генов было подавлено в NLR_High лимфоцитов, чем у нейтрофилов (рис. 2D). Эти данные позволили предположить, что уровни NLR в основном связаны с измененной экспрессией генов в нейтрофилах. Кроме того, ее необходимо было сравнить с пациентами из группы заболевания NLR_Низкий, а не NLR-Контроль, поскольку первая группа четко отделялась от NLR_Высокий, но не NLR_Контроль ( Рисунок 2B; дополнительный рисунок 2).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Прежде чем исследовать дифференциальную экспрессию генов и обогащение набора генов, дополнительные исследования характеризовали степень загрязнения моноцитами препарата нейтрофилов. Используя данные секвенирования РНК, мы заметили, что экспрессия моноцитарных маркеров CD14, CD68, CD83 и CD163 в препаратах NLR_High против NLR_Low нейтрофилов или лимфоцитов существенно не различалась. EPIC-анализ данных секвенирования РНК нейтрофилов показал, что неиммунные клетки («другие клетки») и Т-клетки CD4 были основными загрязнителями в препаратах нейтрофилов (рис. 3). За исключением NLR{{10}}Т-клеток и B-клеток с низким содержанием CD4, ни одна из других контаминирующих клеток существенно не отличалась в NLR._Низкие нейтрофилы против NLR_Высокие нейтрофилы. . В препарате нейтрофилов загрязнение моноцитами по данным EPIC-анализа составляло всего 0,17% ± 0.05% для NLR_Низкое против 0,1% ± 0,033% для НЛР_Высокие препараты (P=.12). Это значение указывает на то, что загрязнение моноцитами было на порядок ниже при определении с помощью анализа данных RNA-seq по сравнению с проточной цитометрией.

Рисунок 4. Пузырьковая диаграмма значительно экспрессируемых категорий наборов генов GO для биологических процессов между NLR_Высоким и NLR_Низким. Отношение k:K по оси абсцисс представляет собой количество генов, которые значительно дифференциально экспрессируются (k) по сравнению с общим количеством генов в категории (K). По оси ординат — значимость обогащения, выраженная в виде логарифма (значение P). (A) Наборы генов GO, полученные в результате секвенирования нейтрофильной РНК, сравнивающие NLR_Высокий и NLR_Низкий. (B) Наборы генов GO, полученные из секв. РНК лимфоцитов. Наборы генов в левом нижнем углу обоих графиков являются наименее значимыми. Наборы генов в правом верхнем углу обоих графиков являются наиболее значимыми.

Рисунок 4 (продолжение)

Чтобы изучить природу дифференциально экспрессируемых генов, мы провели GSEA с категориями генной онтологии (GO) для биологических процессов, используя значительно дифференциально экспрессируемые наборы генов между NLR_High и NLR_Low. Результаты показаны на пузырьковых диаграммах рассеяния (рис. 4). Выделение наборов генов в правом верхнем углу каждого графика показывает (1) высокий процент генов в наборах генов, которые значительно изменены, и (2) высокую степень значимости для обогащения набора генов. В нашем образце пузырьковые диаграммы рассеяния показали обогащение категорий GO как комплемента, так и гуморального ответа независимо как для нейтрофилов, так и для лимфоцитов. У нейтрофилов наборы генов классического пути активации комплемента, регуляции каскада активации белков и гуморального иммунного ответа, опосредованного циркулирующим иммуноглобулином, были наиболее значимыми, при этом самый высокий процент членов набора генов значительно изменился (рис. 4А). Независимо от этого, идентичные наборы генов в лимфоцитах также имели высокое соотношение значительно измененных генов и степень значимости, как и в исследованиях нейтрофилов (рис. 4B).

Таблица 2. Иммунологические наборы генов в нейтрофилах и лимфоцитах

В таблице 2 перечислены наиболее существенно изменившиеся наборы иммунологических генов в нейтрофилах (таблица 2, панель А) и лимфоцитах (таблица 2, панель Б). В этом исследовании сравнивалась экспрессия генов в нейтрофилах или лимфоцитах в образцах с _высоким уровнем NLR и образцами с низким уровнем NLR_. Здоровые образцы NLR_Контроль не сравнивались, поскольку их уровни экспрессии перекрывались с образцами пациентов с NLR_высоким и NLR_низким уровнем экспрессии как по всему транскриптому, так и по набору генов, экспрессирующихся значительно дифференциально. Кроме того, здоровые контрольные образцы NLR_ не соответствовали возрасту, заболеванию и хирургическому состоянию (дополнительные рисунки 1 и 2). Данные показали, что как в нейтрофилах (Таблица 2), так и в лимфоцитах (Таблица 2) экспрессия наборов генов, связанных с иммунной системой, сильно различалась при сравнении NLR_High с NLR_Low. . При секвенировании РНК каждый тип клеток дает те же результаты, что и другой тип клеток. В обеих панелях уровни значимости основных наборов генов максимальны при P <1E-24. Эти данные имели высокую значимость независимо от того, исследовались ли нейтрофилы или лимфоциты. Чтобы сосредоточиться на весьма значимой области содержания этого исследования РНК-секвенирования, была изучена значительно дифференциально выраженная экспрессия генов иммуноглобулина. Во-первых, график анализа главных компонентов генов нейтрофилов показал, что для NLR_Высокого и NLR_Низкого значительно дифференциально экспрессируемые гены иммуноглобулинов были разделены на 2 группы (дополнительная фигура 3A). Альтернативно, гены лимфоцитов NLR_Высокий и NLR_Низкий перекрываются (дополнительный рисунок 3A). Затем комбинированную тепловую карту экспрессии генов, связанных с иммунитетом, между NLR_Высоким и NLR_Низким сравнивали в нейтрофилах и лимфоцитах (рис. 5). В целом, при рассмотрении всей тепловой карты наблюдается очевидное подавление всего семейства генов иммуноглобулинов в группе нейтрофилов NLR_High по сравнению с группой NLR_Low. Большинство генов (69/156, 44%) были связаны с иммуноглобулинами. Только 12 из 156 (7,7%) генов были связаны с комплементом: C1QA, C1QB, Serping1, C2, C2R, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CFH, CFD и CD59. В группе лимфоцитов также наблюдалось снижение активности преимущественно генов иммуноглобулинов в категории NLR_Высокая.

Наборы генов комплемента в нейтрофилах и лимфоцитах подробно описаны в таблице 3. И в нейтрофилах (таблица 3), и в лимфоцитах (таблица 3) экспрессия генов в трех наборах генов, связанных с системой комплемента, сильно различалась (P < 1E{{ 5}}), когда образцы NLR_Высокого уровня сравнивались с образцами NLR_Низкого уровня. Это наблюдение было одинаковым независимо от того, проводилось ли сравнение между РНК из нейтрофилов или лимфоцитов. Три набора генов включают активацию комплемента, классический путь активации комплемента и регуляцию активации комплемента. График анализа главных компонентов генов нейтрофилов снова показал, что для NLR_High против NLR_Low значительно дифференциально экспрессируемые гены комплемента были разделены на 2 группы (дополнительный рисунок 3B). Альтернативно, гены лимфоцитов NLR_Высокая и NLR_Низкая перекрываются (дополнительный рисунок 3B).

Рисунок 5. Тепловая карта существенно дифференциально экспрессируемых генов набора генов иммуноглобулинов в нейтрофилах (слева) и лимфоцитах (справа). Гены, перечисленные справа на каждой тепловой карте, являются членами иммуноглобулина.

Тепловая карта экспрессии нейтрофилов и лимфоцитов набора генов, связанных с комплементом, сравнивающая NLR_Высокий и NLR_Низкий, показана на рисунке 6. В нейтрофилах огромное количество генов было подавлено в NLR_Высокая численность населения. В этом наборе генов, как и в наборах генов иммуноглобулинов, большинство генов (69/86, 80%) были связаны с иммуноглобулинами. Только 12 из 86 (14%) были компонентом комплемента и регуляторными генами (C1QA, C1QB, SERPING1, C2, CR2, C4BPA, C3AR1, CR1, CR1L, CD59, CFH и CFD). В группе лимфоцитов в целом было меньше экспрессии генов комплемента, а гены иммуноглобулинов были немного более подавлены в группе NLR_High. Поскольку существует большее понимание генов системы комплемента по сравнению с генами систем иммуноглобулина, внимание было сосредоточено на системе комплемента как потенциальном кандидате на роль генов-мишеней, связанных с высоким и низким уровнем NLR. Была составлена ​​составная тепловая карта, сравнивающая NLR_High с NLR_Low, показывающая экспрессию системы комплемента и связанных с ней генов как в образцах нейтрофилов, так и в лимфоцитах (рис. 7). По большей части лимфоциты не являются резервуарной клеточной системой для системы комплемента. Большинство генов комплемента не активируются в лимфоцитах. Присутствовали только C1S, CR2, C5, C8G, C5 и CFB с разницей в экспрессии между NLR_Высоким и NLR_Низким лимфоцитами (рис. 7). CD81 в лимфоцитах представляет собой тетраспанин В-клеток. Экспрессия C1S и C8G, по-видимому, значительно выше в NLR лимфоцитов_Высокая, чем у NLR лимфоцитов_Низкая, аналогично KLKB1, гену прекалликреина плазмы.

Напротив, в нейтрофилах NLR_High продемонстрировала подавление генов компонентов комплемента C1QA, C1QB, C1QC, SERPING1, C1R, C4BPA, C3 и C3AR1, а также их регуляторных (ингибирующих) генов комплемента CD59, CFB и CFI. . У пациентов с NLR_высоким_N наблюдалась активация только генов C2 и CFD. CD59 и C9 относительно повышены в нейтрофилах NLR_Low_N по сравнению с нейтрофилами NLR_High_N. FGFR4 представляет собой рецептор фактора роста. CFH присутствовал, но, судя по всему, не находился под влиянием NLR нейтрофилов_Высокий или NLR_Низкий. Он более выражен в лимфоцитах.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Обсуждение

NLR по дифференциальному подсчету лейкоцитов стал широко используемым простым маркером для распознавания потенциальных неблагоприятных исходов при широком спектре заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, солидные опухоли и воспалительные заболевания, такие как системная красная волчанка и системный склероз. В наших собственных ретроспективных исследованиях на пациентах с атеросклеротическими сердечно-сосудистыми заболеваниями мы наблюдали, что пациенты с высоким уровнем NLR имеют более высокий уровень поздней смертности после плановой пластики аневризмы аорты, более высокий уровень позднего инсульта/смертности после профилактической каротидной эндартерэктомии и снижение выживаемости без ампутации после плановая бедренно-подколенная реваскуляризация, если у них повышен NLR.14-16 Настоящие исследования были начаты с целью найти механистическую основу высокого NLR. лимфома, множественные солидные опухоли и воспалительные заболевания, такие как системная красная волчанка и системный склероз. В наших собственных ретроспективных исследованиях на пациентах с атеросклеротическими сердечно-сосудистыми заболеваниями мы наблюдали, что пациенты с высоким уровнем NLR имеют более высокий уровень поздней смертности после плановой пластики аневризмы аорты, более высокий уровень позднего инсульта/смертности после профилактической каротидной эндартерэктомии и снижение выживаемости без ампутации после плановая бедренно-подколенная реваскуляризация, если у них повышен NLR.14-16 Настоящие исследования были начаты с целью найти механистическую основу высокого NLR.

Таблица 3. Наборы генов комплемента в нейтрофилах и лимфоцитах

Чтобы разработать объективный подход к механизму(ам) дифференциального воздействия NLR на исходы сердечно-сосудистых заболеваний, мы провели секвенирование РНК как на нейтрофилах, так и на лимфоцитах у одних и тех же пациентов. Для этого исследования все пациенты с заболеванием аорты были проспективно собраны и сгруппированы по категориям NLR по результатам. Последние 6 образцов в каждом из 2 типов клеток были отобраны по самому высокому уровню их RIN в приготовленной РНК парных образцов нейтрофилов и лимфоцитов, независимо от пола, возраста или предыдущих заболеваний. Как видно из таблицы 1, пациенты в группах NLR_Высокий и NLR_Низкий были очень похожи и отличались только своим NLR.

Качество РНК, используемой в этом исследовании, показано RIN и полным разделением характера экспрессии генов между нейтрофилами и лимфоцитами во всех собранных группах пациентов (высокий NLR, низкий NLR и контрольная группа) (рис. 1). График анализа главных компонентов показывает, что NLR_Контрольные данные не имели значения в этом исследовании, поскольку NLR пациентов перекрывался с NLR_Высоким и NLR_Низким в популяциях нейтрофилов и лимфоцитов пациентов. . Анализ GSEA дал четкое представление о том, какие наборы генов были обогащены наборами генов GO биологических процессов, а пузырьковая диаграмма ясно продемонстрировала это, построив логарифмическую значимость в зависимости от отношения числа измененных генов к общему числу генов. в наборах генов. При рассмотрении наборы генов, которые выделяются из всего списка, были наборами генов гуморального (иммуноглобулинового) иммунитета и системы комплемента (таблицы 2 и 3), основанными на соотношении и статистической значимости при беспристрастном подходе к открытию.

С большим количеством задействованных генов гуморального иммунитета иммуноглобулинов трудно работать, поскольку важные различия между этими генами недостаточно известны. С другой стороны, о системе комплемента известно гораздо больше, и акцент на классической системе комплемента, которая активируется иммуноглобулином, является заметной мишенью воспалений и заболеваний, связанных с иммуноглобулинами. Наши данные свидетельствуют о том, что классические гены компонентов комплемента C1QA, C1QB, C1R, CR1, C1S, SERPING1, C2, C4BPA, C3 C3AR1, C8G, C9 и некоторые регуляторные гены (CD59, CFB CFI и CFH) подавлены в нейтрофилах пациентов. с высоким NLR (рис. 7). Эти результаты поразительны по трем причинам. Во-первых, задействованы гены, в основном относящиеся к классическому пути комплемента. Во-вторых, у пациентов с высоким NLR эти гены комплемента по большей части подавлены по сравнению с таковыми у пациентов с низким NLR. Наконец, больше F12 экспрессируется в нейтрофилах из образцов NLR_Высокий, чем в образцах NLR_Низкий. Ферментативные формы белкового продукта F12 (фактор XII [FXII]) активируют классический путь комплемента и нейтрофилов.20 Напротив, PLG, ген плазминогена и активатора FXII, подавляется в лимфоцитах и ​​нейтрофилах пациентов с NLR{ {21}}Высокий, что позволяет предположить, что активация FXII сама по себе может быть регулятором активации комплемента.

Кроме того, было показано, что классическая система комплемента участвует в ускорении сердечно-сосудистых заболеваний. Компонент комплемента 1q (C1q) является начальным фактором пути комплемента, который играет важную роль как во врожденной, так и в приобретенной иммунной системе.21 Было показано, что C1q играет двойную роль: положительное и отрицательное влияние на атеросклероз.22 В классической медицине пути комплемента, C1q играет защитную роль на ранней стадии атеросклероза, регулируя молекулярный сигнал макрофагов через комплемент-независимый путь, модулируя поглощение атерогенного липопротеина, опосредуя апоптотические клетки и удаление клеточного мусора.23,24 Недавнее исследование Jia и соавт.23 указывают на то, что снижение уровня C1q в сыворотке связано с ИБС. Другое исследование Guo et al24 показывает, что повышенная активность C1q связана с ИБС. Наконец, недавние исследования показывают, что у пациентов с диабетом со сниженным уровнем C1q выживаемость сокращается.25 Эти данные показывают, что исследование системы комплемента может иметь важное значение для понимания воспалительного патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний.

Рисунок 6. Тепловая карта значительно дифференциально экспрессируемых генов набора генов комплемента в нейтрофилах (слева) и лимфоцитах (справа). Гены, перечисленные справа на каждой тепловой карте, являются членами набора генов комплемента. РНК получают из нейтрофилов или лимфоцитов, собранных у пациентов с высоким (NLR_Высоким) или низким (NLR_Низким) NLR. Шесть отдельных образцов NLR_Высокий сравниваются с 6 отдельными образцами NLR_Низкий как по нейтрофилам, так и по лимфоцитам.

Рисунок 7. Составная тепловая карта комплемента и родственных генов нейтрофилов или лимфоцитов NLR_Высокая или NLR_Низкая. В каждой категории составная тепловая карта была составлена ​​из 6 отдельных образцов секвенирования РНК из каждого типа клеток.

Recently, a retrospective investigation of the data from the CANTOS, JUPITER, SPIRE-1, SPIRE-2, and CIRT trials on 60 087 patients was conducted to determine whether NLR predicts major adverse CV events and is modified by anti-inflammatory therapy.26 NLR modestly correlated (ie, r 2 ≤ 0.26) with interleukin 6, C-reactive protein, and fibrinogen levels but minimally with lipids.25 In all 5 trials, NLR predicted incident CV events and death in patients with NLR >3.08.26 Хотя снижение липидов не оказало влияния на NLR, противовоспалительная терапия канакинумабом, ингибитором интерлейкина 1, снижала NLR (P < 0,0001).26 Эти данные позволяют предположить, что NLR может быть маркером сердечно-сосудистых заболеваний независимо от липидов и влияние статинов. Этот специальный анализ многочисленных проспективных рандомизированных исследований позволяет предположить, что NLR может быть независимым фактором риска смертности при сердечно-сосудистых заболеваниях.

В этом исследовании есть некоторые ограничения. По данным проточной цитометрии, наши препараты нейтрофилов имели 4% загрязнение лимфоцитами и 2% моноцитами. Поскольку неизвестно, что нейтрофилы синтезируют иммуноглобулин, изменения гена нейтрофильного иммуноглобина могут быть вызваны загрязнением В-клеток. При анализе EPIC наблюдалось значительное увеличение загрязнения B-клетками образцов с низким уровнем NLR. Это наблюдение предполагает, что повышение уровня генов иммуноглобулинов в образцах NLR_ с низким содержанием нейтрофилов может быть результатом контаминации B-клеток. Таким образом, снижение генов иммуноглобулина в образцах NLR_Высокий уровень может быть связано с увеличением количества B-клеток в образцах NLR_Низкий уровень и не обязательно снижением уровней генов иммуноглобулина в образцах NLR_Высокий уровень. Аналогично, нейтрофилы не известны как клетки, продуцирующие комплемент. Двухпроцентное загрязнение моноцитами может быть источником генов комплемента. Однако, используя данные секвенирования РНК, мы заметили, что нет существенной разницы в загрязнении моноцитами препаратов нейтрофилов между NLR_Низкий и NLR_Высокий. Кроме того, проведение EPIC-анализа данных секвенирования РНК показывает, что контаминация моноцитами была<0.1% (<1:1000) of the neutrophil preparations, indicating that the RNA-seq was unlikely influenced by contaminating monocytes (Figure 3). The contaminating B cells in the NLR_Low samples do not influence the complement data observed. Finally, even now, it is not known that the changes we observed in complement and immunoglobulin genes are specific to vascular surgery patients with high NLR or older patients in general. NLR and genetic studies need to be performed on healthy age- and sex-matched patients without CVD.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

В целом, кардинальным открытием этого исследования является то, что при высоких состояниях NLR многие гены компонентов комплемента и некоторые из их регуляторов подавляются в нейтрофилах. Неясно общее значение и состояние активации выявленных генов комплемента с пониженной регуляцией. Поскольку наборы генов комплемента резко уменьшены, мы предполагаем, что у людей с NLR_высокой и сокращенной послеоперационной выживаемостью наблюдаются утраты основных механизмов защиты от сердечно-сосудистых заболеваний, обеспечиваемых системами комплемента. Эту оценку необходимо изучить проспективно в клинических исследованиях для выявления механизмов, лежащих в основе этого результата.

Рекомендации

1. Росс Р. Атеросклероз – воспалительное заболевание. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

2. Гетц ГС. Серия тематических обзоров: иммунная система и атерогенез. Иммунная функция при атерогенезе. J Липид Рез. 2005;46(1):1-10.

3. Ханссон Г.К., Херманссон А. Иммунная система при атеросклерозе. Нат Иммунол. 2011;12(3):204-212.

4. Даффи Б.К., Гурма Х.С., Раджагопал В., Гупта Р., Эллис С.Г., Бхатт Д.Л. Полезность повышенного соотношения нейтрофилов и лимфоцитов для прогнозирования долгосрочной смертности после чрескожного коронарного вмешательства. Я Дж Кардиол. 2006;97(7):993-996.

5. Тамхане У.У., Анеха С., Монтгомери Д., Роджерс Э.К., Игл К.А., Гурм Х.С. Связь между соотношением нейтрофилов и лимфоцитов при поступлении и исходами у пациентов с острым коронарным синдромом. Я Дж Кардиол. 2008;102(6):653-657.

6. Гибсон П.Х., Кроал Б.Л., Катбертсон Б.Х. и др. Предоперационное соотношение нейтрофилов и лимфоцитов и исход аортокоронарного шунтирования. Ам Харт Дж. 2007;154(5):995-1002.

7. Фичи Ф, Челик Т, Балта С и др. Сравнительное влияние небиволола и метопролола на ширину распределения эритроцитов и соотношение нейтрофилов/лимфоцитов у пациентов с впервые диагностированной эссенциальной гипертензией. Дж Кардиоваск Фармакол. 2013;62(4):388-393.

8. Караман М., Балта С., Ай С.А. и др. Сравнительное влияние валсартана и амлодипина на уровни фактора Виллебранда и соотношение N/L у пациентов с впервые диагностированной артериальной гипертензией. Clin Exp Hypertens. 2013;35(7):516-522.

9. Утамалингам С., Патвардхан Э.А., Субраманиан С. и др. Полезность соотношения нейтрофилов и лимфоцитов в прогнозировании долгосрочных результатов при острой декомпенсированной сердечной недостаточности. Я Дж Кардиол. 2011;107(3):433-438.

10. Бхат ТМ, Афари МЭ, Гарсия Л.А. Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов при заболеваниях периферических сосудов: обзор. Эксперт преподобный Кардиоваск Тер. 2016;14(7):871-875.

11. Бхутта Х., Ага Р., Вонг Дж., Тан Т.И., Уилсон Ю.Г., Уолш С.Р. Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов предсказывает среднесрочную выживаемость после плановой крупной сосудистой хирургии: поперечное исследование. Васк Эндоваск Хирург. 2011;45(3):227-231.

12. Эпплтон Н.Д., Бэйли Д.М., Моррис-Стифф Дж., Льюис М.Х. Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов предсказывает периоперационную смертность после открытой плановой пластики аневризмы брюшной аорты. Васк Эндоваск Хирург. 2014;48(4):311-316.

13. Бат Дж., Смит Дж.Б., Крузе Р.Л., Фогель Т.Р. Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов предсказывает тяжесть заболевания и исход после процедур на нижних конечностях. Дж Васк Сург. 2020;72(2):622-631.

14. Кинг А.Х., Шмайер А.Х., Харт К.С. и др. Повышенное соотношение нейтрофилов и лимфоцитов предсказывает смертность после планового эндоваскулярного восстановления аневризмы. Дж Васк Сург. 2020;72(1):129-137.

15. Кинг А.Х., Ким А.Х., Кван С. и др. Повышенное соотношение нейтрофилов и лимфоцитов связано с худшими результатами после каротидной эндартерэктомии у бессимптомных пациентов. J Инсульт Цереброваск Дис. 2021;30(12):106120.

16. Кинг А.Х., Кван С., Шмайер А.Х. и др. Повышенное соотношение нейтрофилов и лимфоцитов связано со снижением выживаемости без ампутации после бедренно-подколенной чрескожной реваскуляризации. Инт Ангиол. 2021;40(5):442-449.

17. Ракл Дж., де Йонге К., Баумгертнер П., Спейзер Д.Е., Гфеллер Д. Одновременный подсчет типов раковых и иммунных клеток на основе данных об экспрессии генов опухоли. Элифе. 2017;6:e26476.

18. Трапнелл С., Робертс А., Гофф Л. и др. Дифференциальный анализ экспрессии генов и транскриптов в экспериментах по секвенированию РНК с помощью TopHat и Cufflinks. Нат Проток. 2012;7(3):562-578.

19. Палмер С., Дин М., Ализаде А.А., Браун П.О. Специфические профили экспрессии генов лейкоцитов в периферической крови человека. БМК Геномика. 2006;7:115.

20. Ставру Э.С., Фанг С., Бэйн К.Л. и др. Фактор XII и uPAR активируют функции нейтрофилов, влияя на заживление ран. Джей Клин Инвест. 2018;128(3): 944-959.

21. Дункельбергер-младший, Song WC. Комплемент и его роль во врожденных и адаптивных иммунных реакциях. Сотовые Рез. 2010;20(1):34-50.

22. Шпейдл В.С., Кастл С.П., Хубер К., Войта Дж. Комплемент при атеросклерозе: друг или враг? J Тромб Гемост. 2011;9(3):428-440.

23. Цзя Ю, Вэнь В, Ян Ю и др. Клиническая роль комбинированного уровня C1q в сыворотке и вчСРБ в прогнозировании ишемической болезни сердца. Клин Биохим. 2021;93:50-58.

24. Го С., Мао X, Ли X, Оуян Х., Гао Ю., Мин Л. Активность C1q комплемента сыворотки связана с обструктивной ишемической болезнью сердца. Фронт Кардиоваск Мед. 2021;8:618173.

25. Чавушоглу Э., Кассотис Дж.Т., Анвар А. и др. Полезность комплемента C1q для прогнозирования 10-летней смертности у мужчин с сахарным диабетом, направленных на коронарографию. Я Дж Кардиол. 2018;122(1):33-38.

26. Адамштейн Н.Х., Макфадьен Дж.Г., Роуз Л.М. и др. Соотношение нейтрофилов и лимфоцитов и возникновение атеросклеротических событий: анализ пяти современных рандомизированных исследований. Eur Heart J. 2021;42(9):896-903.