Оценка кишечного транспорта экстракта, богатого фенилэтаноидными гликозидами, из Cistanche Deserticola через модель монослоя клеток Caco-2

Введение

Клеточная линия Caco-2, полученная из аденокарциномы толстой кишки человека, обладает энтероцитоподобными характеристиками. В нормальных условиях клетки Caco-2 спонтанно дифференцируются из зрелых клеток и образуют интактные монослои. Соседние клетки сцепляются посредством плотных соединений, образующихся на апикальной стороне монослоя, которые могут дискриминировать пассивно расположенные клетки.и активно транспортировали лекарства через эпителиальный слой. Благодаря морфологическому и биохимическому сходству с нормальными энтероцитами монослои клеток Caco-2 служат общепринятой моделью in vitro для изучения потенциала кишечной абсорбции и транспортных характеристик лекарств.

В отличие от химикатов, растительные экстракты (ПЭ) представляют собой смеси, биологическая активность и активные компоненты которых часто не определены. Более того, транспортные свойства ПЭ в кишечнике, в отличие от свойств его компонентов, тесно связаны с клиническим применением. Измерения потока тестируемого образца через монослой клеток Caco-2 обычно включают химические методы, такие как ВЭЖХ, ЖХ/МС и т. д. Хотя эти методы являются мощными инструментами, они сложны, отнимают много времени, дороги и иногда требуют сложного оборудования. Что еще более важно, ни отдельный компонент, ни компонент меньшинства не могут отражать PE в целом. Таким образом, для идентификации и оценки транспортных характеристик полиэтилена необходимо разработать новый подход, независимый от определения компонентов.

Cistanche Deserticola YC Ma (CD), голопаразитное растение, является распространенным традиционным китайским лекарством, которое в основном используется для лечения почечной недостаточности, слабости тела и запоров, и это использование официально зарегистрировано в Китайской Фармакопее.Фенилэтаноидные гликозиды (PhG), в том числе эхинакозид (EC), актеозид (AC), изоактеозид (IS) и т. д., представляют собой класс полифенольных соединений. Они считаются одними из основных биологически активных компонентов видов Cistanche. Фармакологические исследования показали, что биологическая активность ФГ разнообразна и включает антиоксидантное, противоусталостное, гепатопротекторное, иммуномодулирующее, противовоспалительное и нейропротекторное действие. Однако характеристики кишечного транспорта PhGs не исследовались. В этом исследовании мы исследовали кишечную проницаемость экстракта, богатого PhG (PRE) из CD, как интегрированной системы, а также проницаемость трех основных PhG (AC, IS и EC) в дифференцированных клетках Caco-2. Наши результаты показали, что PRE в основном транспортируется посредством плохо абсорбируемой пассивной диффузии вниз по градиенту концентрации без оттока, что обеспечивает фармакокинетическую основу для клинического применения PhG при БК.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материалы и методы

Материалы

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98%) были приобретены у компании Must Biotechnology Co. (Чэнду, Китай). Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS) и заменимые аминокислоты (NEAA) были произведены компанией Gibco BRL (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). 6-луночные планшеты TranswellTM (площадь роста вставленной мембраны 4,67 см2) были получены от Corning (Costar) Inc. (Тьюксбери, Массачусетс, США). Коллаген крысиного хвоста был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Все реагенты и химикаты для анализа ВЭЖХ имели аналитическую чистоту.

Подготовка PRE с компакт-диска

Высушенный на воздухе материал CD измельчали ​​в порошок и экстрагировали перколяцией 70% этанолом. Фракцию, обогащенную PhG, готовили, как описано ранее, и экстрагировали насыщенным водой н-бутиловым спиртом. Экстрактный раствор концентрировали и сушили при пониженном давлении. УФ-спектрофотометрия макропористой смолы показала содержание PhG 78,4%. Конечный образец имел выход сырья 1,75% по сухому весу. Полученный образец хранили при температуре -20 градусов до дальнейшего использования.

Определение AC, IS и EC методом ВЭЖХ

Для анализа содержания AC, IS и EC в PRE использовали систему ВЭЖХ Shimadzu, оснащенную программным обеспечением для решения ЖХ. Использовали колонку Intersil C18 с обращенной фазой (4,6 мм × 250 мм, 5 мкм), которую поддерживали при комнатной температуре. Подвижными фазами служили ацетонитрил и вода, содержащая 0,1% фосфорной кислоты (об./об.) с градиентным элюированием (табл. 1) при скорости потока 1,0 мл/мин. Детектор УФ-спектрофотометра был установлен на длину волны 334 нм. Для точного определения потока AC и IS мы разработали новый метод обнаружения ВЭЖХ-флуоресценции (ВЭЖХ-FLD). После структурного анализа и сканирования длины волны флуоресценции (данные не показаны) мы получили оптимальные условия обнаружения флуоресценции для AC (Ex: 338 нм, Em: 448 нм) и IS (Ex: 320 нм, Em: 434 нм).

Аналитический метод ВЭЖХ был проверен с использованием следующих рабочих характеристик: стабильность, линейность, чувствительность, прецизионность (внутри- и междневная изменчивость) и точность. Аналиты в транспортном буфере хранили при 25 градусах в темноте в течение 24 часов и измеряли их стабильность. Аналиты были очень стабильны в присутствии витамина С (0,4%), поскольку значения относительного стандартного отклонения (RSD) в областях пиков составляли <3,5%. Уравнение линейной регрессии, коэффициент корреляции, диапазон линейности, LOD и LOQ для AC, IS и EC показаны в таблице 2. LOD (18–30 нМ) и LOQ (60–100 нМ) Значения показывают, что методы ВЭЖХ-ФЛД и ВЭЖХ-УФ являются высокочувствительными. Все значения RSD, отражающие точность метода, составляли <2% для внутридневной и междневной изменчивости, что указывает на хорошую точность. Для оценки восстановления AC, IS и EC добавляли к транспортному буферу, чтобы получить три уровня концентрации (высокий, средний и низкий). Значения извлечения аналитов, полученные методом, суммированы в Таблице 3. Средний уровень извлечения колебался от 90,0% до 96,4%, что указывает на хорошую точность. В заключение следует отметить, что признанные методы ВЭЖХ являются удовлетворительными в отношении линейности, чувствительности, прецизионности и правильности количественного определения AC, IS и EC в транспортном буфере.

Определение PRE с помощью системы биоанализа

Биоанализ (общая антиоксидантная способность) был основан на анализе FRAP (железовосстановительная/антиоксидантная способность), который мы описали ранее [16] и подтвердили с точки зрения линейности и точности (внутри- и междневной изменчивости). Линейность метода биоанализа определяли на основе калибровочных кривых. Диапазон концентраций линейности составлял 0.0625 - 40 мкг/мл (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Точность общепринятого метода биоанализа определяли по внутри- и междневной вариабельности анализа PRE (10,0 мкг/мл). Внутридневную повторяемость метода определяли на основании пяти последовательных определений в один и тот же день. Междневную повторяемость измеряли на основе пяти последовательных определений в три разных дня. Значения RSD для точности метода составили 1,014% и 4,72% для внутри- и междневной изменчивости соответственно, что указывает на хорошую точность. Таким образом, признанный метод биоанализа является удовлетворительным с точки зрения линейности, точности и правильности количественного определения PRE в транспортном буфере.

Культура клеток

Клетки Caco{0}} культивировали при 37 градусах и относительной влажности 95% в атмосфере, содержащей 5% CO2 и среде, состоящей из DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-глутамина, пенициллина. (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Среду меняли через день в ходе роста и дифференцировки клеток. Клетки выращивали в пластиковых колбах 75- см2 и собирали каждые 3–5 дней с 0,05% ЭДТА-трипсином. Для экспериментов по транспортировке клетки высевали с плотностью 1×105 клеток/см2 на вставки Transwell, покрытые коллагеном. Примерно через 21 день после посева монослои использовали для экспериментов по транспортировке. Их целостность определяли путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) поперек монослоев с помощью EVOM, оснащенного ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., США). Значения TEER монослоя клеток Caco-2 должны были превышать 500 О∙см2.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ УСПОКАИВАЮЩЕГО И СЛАБИТЕЛЬНОГО PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Транспортные эксперименты

Монослой промывали транспортным буфером (P-буфер, содержащий 10 мМ HEPES, 1 мМ пируват натрия, 10 мМ глюкоза, 3 мМ CaCl2 и 145 мМ NaCl, pH 7,4), а затем предварительно инкубировали в течение 20 мин. при 37 градусах. После удаления транспортного буфера свежий транспортный буфер, содержащий тестируемые образцы, добавляли в апикальную (AP) камеру (1,5 мл) в исследованиях с направлением от AP к базолатеральному (BL) или в камеру BL (2,5 мл) при исследованиях с направлением от BL к AP. Для анализов AC, IS и EC с использованием ВЭЖХ аликвоту (300 мкл) отбирали из каждой приемной камеры через разные промежутки времени (30, 60, 90 и 120 мин). Приемную камеру пополняли одинаковым объемом свежего, предварительно нагретого (37 градусов) транспортного буфера после каждого отбора проб. Собранные образцы хранились при температуре -20 градусов для дальнейшего использования. Для определения PRE с использованием биоанализа отбирали только пробы через 120 минут. Из-за нестабильности PRE, AC, IS и EC, 0,4% (мас./об.) витамина С было добавлено для стабилизации образцов для определения содержания AC, IS и EC с помощью ВЭЖХ, а образцы для биоанализа PRE были анализируют сразу после отбора проб. Рассчитывали значение кажущегося коэффициента проницаемости (Papp или 'Papp) каждого образца.

Анализ данных

Значения Papp в направлениях AP BL или BLAP AC, IS и EC рассчитывались на основе следующего уравнения: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), где Papp — коэффициент кажущейся проницаемости (см/с), определенный методом ВЭЖХ. (4Q/4t) — скорость появления тестируемого соединения (AC, IS или EC) на принимающей стороне (мкмоль/с); А – площадь поверхности вставки (см2); C0 представляет собой начальную концентрацию тестируемого соединения на донорской стороне (мкмоль/мл). В частности, при расчете значений Papp вместо «мкмоль» использовалась единица массы «мкг». Данные выражены как среднее ± SD.

Полученные результаты

Состав АС, ИС и ЭК в ПРЭ с КД

Поскольку AC, IS и EC считаются основными биологически активными веществами.PhG видов Cistancheмы проанализировали их содержание в PRE с помощью ВЭЖХ-УФ. Репрезентативная хроматограмма представлена ​​на рис. 1. Идентификация этих компонентов основана на сравнении времен удерживания и УФ-спектра с аутентичными стандартами при длине волны 334 нм. Содержание АЦ, ИС и ЭК в ПРЭ составило 26,60%, 1,84% и 32,83% соответственно. Таким образом, на эти три соединения приходится 61,27% PRE; кроме того, приведенные выше результаты показывают, что содержание PhG в PRE составляет 78,4%. Таким образом, AC, IS и EC составляют примерно 80% PhG при PRE.

Суммарная антиоксидантная способность PRE, AC, IS и EC

Исследованияантиоксидантная активность PhGsот CD, а AC, IS и EC составляют примерно 80% PhG при PRE. Таким образом, были проанализированы общие антиоксидантные способности PRE, AC, IS и EC, которые были выражены с использованием значений FRAP (× 10–6 ммоль). Как показано на рис. 2, при значении FRAP 8 × 10–6 ммоль конечные концентрации PRE, AC, IS и EC составляли 6,20 мкг/мл, 3,14 мкг/мл, 22,92 мкг/мл и 4,89 мкг/мл. /мл соответственно, что указывает на то, что общая антиоксидантная способность этих четырех образцов располагалась следующим образом: AC > EC > PRE > IS. Биологическая активность PRE обусловлена ​​группами его активных ингредиентов (AIG). Примерно для 60% PRE AC и EC продемонстрировали более сильную общую антиоксидантную активность, чем PRE и IS. Поскольку IS (1,84%) составляет очень небольшую долю PRE, другие компоненты, такие как слабо антиоксидантный IS, также явно активны в PRE. Удивительно, но общая антиоксидантная активность различалась почти в 7- раза между AC и его изомером IS, что указывает на то, что не только количество фенольных гидроксильных групп, но и положение фенольных гидроксильных групп в молекуле влияет на антиоксидантный эффект. .

Проверка монослоев Caco-2

Для проверки монослойной системы клеток Caco-2 значения Papp пропранолола (хорошо транспортируемого маркера) и Люцифера желтого (плохо транспортируемого маркера) от AP до BL через монослои Caco-2 были определены как 1,51 × 10–5 см/с и 2,8 × 10–7 см/с соответственно, и эти значения согласуются с опубликованными в предыдущих отчетах. Анализ активности щелочной фосфатазы также подтвердил, что монослои клеток Caco-2 качественно сопоставимы с эпителием тонкой кишки.

Проницаемость AC, IS и EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 см/с), тогда как у плохо всасывающихся препаратов были низкими (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Проницаемость ПРЭ

Приведенные выше результаты показывают, что общая антиоксидантная способность PRE обусловлена, по меньшей мере, 61,27% AIG из PRE. Таким образом, мы оценили TR PRE на основе кривой концентрации-эффекта общей антиоксидантной способности и рассчитали значения Papp, чтобы отразить транспортные характеристики PRE. Значения 'Papp PRE для AP!BL и BL!AP составили (2,16 ± 0,26) × 10–7 см/с и (3,13 ± 0,29) × 10–7 см/с. s, соответственно, что указывает на то, что это соединение было плохой проницаемостью. Кроме того, отток или активный транспорт не были очевидны, поскольку соотношение 'Papp BL к AP/'Papp AP к BL для PRE составляло 1,45. Более того, двунаправленный TR PRE линейно увеличивался примерно между 300 и 900 мкг/мл (рис. 5). Отсутствие направленного предпочтения результатов позволяет предположить, что пассивная диффузия является основным транспортным механизмом PRE.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обсуждение

По сравнению с высокоочищенными лекарственными средствами полиэтилен обычно представляет собой смесь, состоящую из сотен компонентов с совершенно разными физико-химическими свойствами. Таким образом, ПЭ оказывают систематическое, многоцелевое и многоканальное синергетическое действие за счет сложного АИГ [21], что затрудняет анализ транспортных характеристик ПЭ. Чтобы оценить транспортные свойства ПЭ с более научной точки зрения, некоторые исследователи идентифицировали в ПЭ несколько компонентов, а не один компонент [22–24]. Тем не менее, ограниченное число составляющих не может отражать ПЭ в целом. Однако определить все компоненты в ПЭ невозможно. Более того, если различные компоненты полиэтилена демонстрируют совершенно разные транспортные характеристики, целостные транспортные характеристики полиэтилена будет трудно идентифицировать.

В 1990-х годах системы биоанализа использовались для оценки ТР антимикробных препаратов [25]. К 2005 году Эгучи и его коллеги [26] оценили антиоксидантную активность экстракта моркови, используя среду BL из дифференцированных клеток Caco-2; этот подход более подходит для отражения ситуаций in vivo.

На основании предыдущего отчета об активности ФГ и наших результатов (рис. 2) ТР АИГ в ПРЭ можно оценить путем определения общей антиоксидантной способности среды в приемной камере. После экспериментов по транспорту мы обнаружили, что ТР PRE был одинаков в обоих направлениях, причем этот транспорт был ненасыщенным и плохо поглощаемым ('Papp < ​​1.0 × 10–6 см/с) и не указывают на отток, предполагая, что пассивная диффузия вниз по градиенту концентрации является основным механизмом транспорта PRE (рис. 5). Более того, транспортные характеристики PRE соответствуют характеристикам AC, IS и EC, эффективных компонентов, которые проявляют антиоксидантную активность в PRE (рис. 4 и таблица 4). Этот результат был ожидаемым и показал, что настоящая система биоанализа подходит и надежна для оценки транспортных характеристик AIG в PRE в дифференцированных клетках Caco-2.

В отличие от канонического значения Papp, которое обычно используется для отражения транспорта одного соединения, значение Papp, полученное из TR на основе кривой концентрация-эффект, может не только отражать компоненты, проникающие в монослои с неповрежденной структурой, но и отражать компоненты, проникающие в монослои с неповрежденной структурой. также вовлекают другие факторы, связанные с целевой активностью, такие как метаболиты компонентов, продукты химического разложения и даже некоторые цитокины, секретируемые клетками Caco-2 в ответ на стимуляцию, которые могут повлиять на целевую биоактивность. Таким образом, значение 'Papp' определяет упомянутый выше мультифактор, а не только транспортируемые неповрежденные компоненты. Следовательно, 'Papp может более сильно коррелировать с ситуациями in vivo, чем каноническое значение Papp. В этом исследовании мы выяснили пассивно-диффузионную и плохо абсорбируемую природу PRE на основе его значения Papp, и эта природа может быть связана с высокими дозами и длительным периодом клинического лечения БК. Тем не менее, эти результаты дадут более систематическое руководство для клиницистов при применении CD, когда будут идентифицированы только транспортные характеристики большинства AIG при CD, а не только PhG.

Однако выбранный объект биологической активности должен быть достаточно чувствительным, чтобы его можно было обнаружить в среде приемной камеры, что представляет собой проблему для создания системы биоанализа для оценки транспортных характеристик ПЭ. Кроме того, биологическая активность также должна зависеть от как можно большего числа компонентов. В нашем исследовании анализ общей антиоксидантной способности оказался более подходящим, чем некоторые другие методы (рис. S1). Но даже в этом случае наш анализ может обнаружить TR PRE только через 120 минут.

В совокупности настоящее исследование создало новую систему биоанализа для оценки кишечной проницаемости PRE в дифференцированных клетках Caco-2. Полученные результаты показали, что основным транспортным механизмом PRE (рис. 5), обеспечивающим фармакокинетическую основу клинического применения PhG при БК, является плохо абсорбируемая пассивная диффузия вниз по градиенту концентрации без оттока. Использование новой системы биоанализа для оценки TR и, таким образом, расчета значений Papp для оценки свойств кишечного транспорта AIG в PE вполне осуществимо. Этот подход может также подойти для других ПЭ, учитывая соответствующую биологическую активность.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%